動態(tài)觀察過敏原誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型從急性炎癥到慢性重塑的發(fā)展*

張方琪， 韓新鵬， 張 芳， 楊學(xué)敏， 向 東， 李志奎

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 陜西 西安 710032)

·實驗技術(shù)·

動態(tài)觀察過敏原誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型從急性炎癥到慢性重塑的發(fā)展*

張方琪， 韓新鵬， 張 芳， 楊學(xué)敏， 向 東， 李志奎△

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 陜西 西安 710032)

目的： 動態(tài)觀察對比卵白蛋白(OVA)誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型從氣道的急性炎癥到慢性重塑的相關(guān)炎癥指標(biāo)及氣道重塑指標(biāo)的變化。方法: 60只雌性BALB/c小鼠隨機分為正常對照組和哮喘組。哮喘組給予OVA致敏和激發(fā)，正常對照組給予等量生理鹽水(NS)作為對照，第21天開始，連續(xù)激發(fā) 3 d，觀察急性炎癥反應(yīng)；而后每周激發(fā)1次、每次激發(fā)后24 h內(nèi)取材1次，連續(xù)5周；動態(tài)觀察對比OVA激發(fā)組和NS對照組小鼠氣道炎癥細(xì)胞的浸潤情況、灌洗液細(xì)胞因子水平和氣道重塑相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果: 與NS組比較，OVA組肺組織的炎癥細(xì)胞浸潤明顯，炎癥因子升高；氣道上皮細(xì)胞向杯狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化明顯；支氣管外周膠原沉積顯著。OVA組內(nèi)比較，24 d組炎癥細(xì)胞和炎癥因子上升明顯，而上皮細(xì)胞向杯狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及支氣管外周膠原沉積相關(guān)重塑指標(biāo)不明顯，52 d組上皮細(xì)胞向杯狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及支氣管外周膠原沉積相關(guān)重塑指標(biāo)最為顯著，而炎癥細(xì)胞和炎癥因子有所下降。結(jié)論: 連續(xù)3次OVA激發(fā)可成功模擬炎癥細(xì)胞和炎癥因子顯著的急性哮喘模型；每周1次、連續(xù)5周的OVA激發(fā)方式可成功模擬重塑明顯的慢性哮喘模型。

過敏原； 氣道炎癥； 氣道重塑； 哮喘模型

哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，由多種細(xì)胞(包括炎癥細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞)以及細(xì)胞組分參與，氣道的炎癥和重塑是哮喘的特征性病理改變；但哮喘的促發(fā)因素和患者的個體癥狀非常的多樣化[1]。雖然多數(shù)患者經(jīng)過規(guī)范化的治療，哮喘的癥狀能夠得到很好地控制；但是，隨時間的推移，哮喘反復(fù)發(fā)作所引起的氣道重塑目前仍沒有很好的干預(yù)手段[2]。鑒于臨床對于哮喘氣道重塑干預(yù)藥物的迫切需求，建立穩(wěn)定、可靠的哮喘氣道重塑的模型，以及對比了解急、慢性哮喘模型的病理機制對臨床藥物的開發(fā)及應(yīng)用具有重要的意義。因此，本研究以相同方式對小鼠進(jìn)行致敏，隨時間推移而延長激發(fā)次數(shù)，動態(tài)對比觀察各組小鼠氣道炎癥細(xì)胞的浸潤情況、灌洗液細(xì)胞因子水平、氣道重塑相關(guān)指標(biāo)，為構(gòu)建哮喘不同階段的動物模型提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 實驗動物 60只清潔級雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，體重(22±3) g，購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，無卵白蛋白(ovalbumin，OVA)飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)于實驗動物中心清潔動物實驗室。

1.2 主要試劑和儀器 卵白蛋白購自Sigma；氫氧化鋁凝膠(西安赫特生物科技有限公司)；ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)，402型超聲霧化器(上海四菱醫(yī)療器械廠)。

2 方法

2.1 動物分組 實驗小鼠按隨機方法分為正常對照組[生理鹽水(normal saline,NS)組]和哮喘模型組(OVA組)，每組30只；按取材的時間間隔再分為24 d、31 d、38 d、45 d和52 d組。

2.2 模型制備 OVA組小鼠分別于第1、7、14天腹腔注射200 μL 致敏液(20 μg OVA、150 μL氫氧化鋁凝膠和50 μL 0.9%氯化鈉溶液)；NS組小鼠以相同體積0.9%氯化鈉溶液替代。從第21天開始，將OVA組小鼠置于封閉容器中，超聲霧化吸入5% OVA生理鹽水誘發(fā)哮喘，連續(xù)激發(fā)3 d，而后每周1次，每次30 min，激發(fā)后24 h內(nèi)對相應(yīng)組取材，持續(xù)5周；NS組小鼠以0.9%氯化鈉溶液替代(圖1)。

Figure 1.The protocol for asthma mouse model.

圖1 哮喘模型制備流程

2.3 取支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)細(xì)胞計數(shù)及炎癥因子的檢測 麻醉后眼球取血處死，0.8 mL預(yù)冷的PBS灌洗雙肺，停留并按摩肺部片刻后回收灌洗液重復(fù)3次，回收率80%以上。BALF經(jīng)4 ℃、1 500 r/min離心10 min后，回收上清-20 ℃保存用于細(xì)胞因子檢測。0.2 mL PBS液重懸細(xì)胞沉淀，取10 μL重懸液注入計數(shù)板，由細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)白細(xì)胞；另取20 μL重懸液涂片，經(jīng)瑞氏染色后計數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞。

2.4 BALF中細(xì)胞因子的檢測 采用ELISA法，檢測BALF中適應(yīng)性免疫應(yīng)答關(guān)鍵因子IL-4、IL-5和IL-13水平，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2.5 肺組織標(biāo)本處理 支氣管肺泡灌洗完畢后, 無菌操作下切取各小鼠相同部位肺組織[3]； 4%多聚甲醛固定, 常規(guī)石蠟包埋、切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟、梯度乙醇水化后，HE染色觀察肺組織病理變化；過碘酸-雪夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色觀察氣道分泌情況[4]；天狼星紅染色觀察氣道周圍纖維化情況,于光鏡下攝片以Image-Pro Plus軟件進(jìn)行分析，以單盲法隨機選取直徑約150～250 μm的支氣管進(jìn)行觀察并評分，結(jié)果以天狼星紅染色面積(μm2)/支氣管基底膜周長(μm)表示，每張切片至少分析5處支氣管[5]。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 和GraphPad Prism 5軟件分析并制圖，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。非參數(shù)Kruskal-Wallis H檢驗比較組間差異，用Nemenyi檢驗進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤隨時間推移的變化

與NS組相比，OVA組BALF中的白細(xì)胞(white blood cells，WBC)總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophils，EOS)數(shù)目均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；相較于NS組，OVA組小鼠各時點肺組織的炎癥細(xì)胞浸潤均較顯著。OVA組內(nèi)比較，45 d組和52 d組相較于24 d組的WBC和EOS數(shù)目有明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；從肺組織病理觀察，炎癥細(xì)胞的浸潤亦有下降趨勢，見圖2。這提示急性期炎癥浸潤最為顯著，隨時間推移，模型小鼠對過敏原的刺激引起的氣道炎癥細(xì)胞浸潤水平有所下調(diào)。

Figure 2.Inflammatory response in the lung. A: the inflammatory cells in the BALF; B: the representative images of HE-stained lung sections (×20). Mean±SD.n=6 .*P<0.05vspaired NS group;#P<0.05vsOVA 24 d group.

圖2 肺部炎癥反應(yīng)的病理觀察和BALF中的炎癥細(xì)胞計數(shù)

2 各組小鼠BALF中的炎癥因子IL-4、IL-5和IL-13水平的變化

與NS組比較，OVA組BALF中的炎癥因子IL-4、IL-5和IL-13的含量均明顯增高(P<0.05)。OVA組內(nèi)比較，相較于24 d組，38 d組、45 d組和52 d組的IL-4水平均有一定程度下降(P<0.05)；45 d組和52 d組的IL-5水平有所下降(P<0.05)；而45 d組和52 d組的IL-13水平有不同程度下降(P<0.05)，見圖3。這提示急性期BALF中炎癥因子水平最高，隨時間推移，模型小鼠對過敏原的刺激引起的氣道炎癥因子水平有所下調(diào)并趨于穩(wěn)定。

Figure 3.The cytokine levels in BALF. Mean±SD.n=6.*P<0.05vspaired NS group;#P<0.05vsOVA 24 d group.

圖3 BALF中的細(xì)胞因子水平

3 各組小鼠氣道上皮的變化

與NS組比較，OVA組各組小鼠氣道上皮含黏液的杯狀細(xì)胞增生明顯；從PAS評分可以看出，在各個時點OVA組小鼠均發(fā)生了明顯杯狀細(xì)胞增生(P<0.05)；OVA組內(nèi)比較，相較于24 d組，52 d組的增生更為明顯(P<0.05)，見圖4。這提示急性期小鼠氣道上皮細(xì)胞向杯狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)化已經(jīng)啟動，隨時間推移，模型小鼠氣道上皮的重塑逐漸加劇。

Figure 4.The epithelial remodeling in the airway. A: the representative images of periodic acid-Schiff (PAS)-stained lung sections (×20); B: the scores of PAS-stained sections. Mean±SD.n=6.*P<0.05vspaired NS group;#P<0.05vsOVA 24 d group.

圖4 氣道上皮重塑的病理觀察

4 各組小鼠支氣管周圍膠原的沉積

與NS組比較，OVA組各組小鼠支氣管以及血管外周膠原沉積明顯；對支氣管外周膠原定量可以看出，在各個時點OVA組小鼠支氣管周圍的膠原沉積量均明顯大于NS組(P<0.05)；OVA組內(nèi)比較，相較于24 d組， 52 d組的膠原沉積更為顯著(P<0.05)，見圖5。這提示急性期小鼠氣道支氣管外周已開始有基質(zhì)沉積，隨時間推移，模型小鼠氣道外周的膠原沉積逐漸加劇。

討 論

雖然哮喘發(fā)病機制復(fù)雜多樣，Th2占優(yōu)勢的免疫失衡目前仍被認(rèn)為是過敏性哮喘的主要發(fā)病機制。當(dāng)過敏原刺激機體后，Th2細(xì)胞因子如IL-4、IL-5和IL-13等分泌量增加[6]。IL-4可以促進(jìn)T細(xì)胞向Th2細(xì)胞的分化，并且誘導(dǎo)B細(xì)胞轉(zhuǎn)換產(chǎn)生IgE，進(jìn)而促進(jìn)肥大細(xì)胞的脫顆粒引發(fā)炎癥反應(yīng)[7]；IL-5是促進(jìn)EOS增殖、分化、動員、活化及募集的最主要細(xì)胞因子之一，組織中IL-5的過度表達(dá)可以引起EOS向氣管和肺組織的聚集和趨化，并導(dǎo)致哮喘多種病理改變，尤其對于EOS凋亡延遲狀態(tài)的持續(xù)有重要影響[8]。而IL-13在上皮下膠原沉積和上皮向杯狀細(xì)胞的分化有著關(guān)鍵的作用，并且IL-13與氣道高反應(yīng)也有一定的相關(guān)性[9]。氣道上皮細(xì)胞向杯狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是氣道重塑的關(guān)鍵指標(biāo)之一，氣道大量的杯狀細(xì)胞分泌黏液形成黏液栓阻塞氣道可以造成致死性哮喘的發(fā)生。而支氣管外周膠原的大量沉積可以影響支氣管的舒張，造成支氣管的狹窄和痙攣是肺呼吸功能下降，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，是哮喘患者氣道慢性重塑的重要原因之一。

Figure 5.The changes of the extracellular collagen deposition. A: the representative images of Sirius red-stained perivascular and peribronchial collagen (×20); B: the quantitative analysis of perivascular and peribronchial collagen. Mean±SD.n= 6.*P<0.05vspaired NS group;#P<0.05vsOVA 24 d group.

圖5 氣道外周膠原沉積的改變

基于此，本實驗通過模擬不同的時點，動態(tài)觀察從急性炎癥期到慢性重塑期哮喘模型小鼠氣道上述相關(guān)指標(biāo)的變化，尋找以不同特征模型的最優(yōu)造模方式，為哮喘的基礎(chǔ)研究提供科學(xué)的依據(jù)。實驗結(jié)果顯示，在激發(fā)時間早且頻率高的早期模型中，肺組織的炎癥細(xì)胞浸潤顯著，炎癥因子水平高，而氣道上皮向杯狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及支氣管外周膠原的沉積均已啟動，但程度較輕；隨時間推移激發(fā)次數(shù)的增加，氣道重塑相關(guān)指標(biāo)愈發(fā)明顯，而肺組織的炎癥細(xì)胞和炎癥因子有不同程度下降并趨于穩(wěn)定。

綜上所述，需要進(jìn)行哮喘急性炎癥期的機制或者相關(guān)藥物研究，可采用僅連續(xù)3次激發(fā)的急性哮喘模型，而需要進(jìn)行哮喘氣道重塑的相關(guān)研究可采用每周1次、連續(xù)5周亦或更長程的慢性哮喘模型。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Dynamic observation of asthma model induced by allergen in mice from acute inflammation to chronic remodeling

ZHANG Fang-qi, HAN Xin-peng, ZHANG Fang, YANG Xue-min, XIANG Dong, LI Zhi-kui

(DepartmentofRespiratoryMedicine,XijingHospitalofTheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China.E-mail:lizhikui@fmmu.edu.cn)

AIM: To dynamically observe and compare the relative changes of the indexes from the process of acute inflammation to chronic remodeling in asthmatic mice induced by ovalbumin (OVA). METHODS: Female BALB/c mice (n=60) were randomly divided into normal control group and asthma group. The mice in asthma group were sensitized and challenged by OVA, while the mice in normal group received equal volume of normal saline (NS). The challenge was performed for 3 consecutive days from the 21th day to observe the response of acute inflammation, and then the mice in different groups were challenged once per week for 5 weeks. Detailed comparisons of the dynamic changes of cell infiltration, cytokine expression and airway remodeling were conducted.RESULTS: Compared with NS group, the mice in OVA group showed a predominantly eosinophilic infiltration into the airway lumen, increased production of Th2-type cytokines, secretion of epithelial mucus and deposition of subepithelial collagen. In OVA challenge groups, the levels of inflammatory cells and inflammatory factors were remarkably higher in 24 d group, whereas the most obvious changes of goblet cell hyperplasia and airway remodeling were observed in 52 d group.CONCLUSION: Acute asthma model is sufficiently induced by 3 consecutive days of OVA challenge protocol, which is accompanied with high levels of inflammatory cells and inflammatory factors. The OVA challenge protocol once per week for 5 weeks could induce a chronic asthma model with obvious airway remodeling.

Allergen; Airway inflammation; Airway remodeling; Asthma model

1000- 4718(2017)02- 0380- 05

2016- 06- 08

2016- 11- 14

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81070028)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.032

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