K-ras對girdin蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制及二者在結(jié)直腸癌中的表達(dá)

吳志豪， 劉海斌， 鄭 敏

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外科，浙江 溫州 325000)

K-ras對girdin蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制及二者在結(jié)直腸癌中的表達(dá)

吳志豪， 劉海斌， 鄭 敏△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外科，浙江 溫州 325000)

目的： 研究K-ras對COS7細(xì)胞girdin蛋白的調(diào)控機(jī)制，并檢測結(jié)直腸癌組織中k-ras和girdin的表達(dá)。方法: 通過病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)K-ras的COS7細(xì)胞，采用Western blot方法檢測穩(wěn)定細(xì)胞株和結(jié)直腸癌組織中K-ras、girdin及其相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果: 高表達(dá)K-ras的COS7細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在高表達(dá)K-ras時其下游的信號蛋白p-ERK1/2和p-Stat3的蛋白水平都明顯增加，同時girdin的表達(dá)量也明顯增加；當(dāng)加入K-ras siRNA后，p-ERK1/2、p-Stat3和girdin的表達(dá)量也隨之減少。對7例結(jié)直腸癌組織和相應(yīng)癌旁組織用Western blot檢測結(jié)果顯示，有5例組織在K-ras高表達(dá)的同時girdin的表達(dá)量也隨之增加。結(jié)論: 通過細(xì)胞和組織實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測K-ras蛋白通過Ras-ERK1/2-Stat3信號通路實(shí)現(xiàn)對girdin蛋白的調(diào)控，并為臨床上與K-ras相關(guān)的腫瘤治療提供一定的參考。

K-ras； Girdin； 結(jié)直腸癌

K-ras是最早被發(fā)現(xiàn)的人類原癌基因之一，與H-ras、N-ras合稱為Ras基因家族。K-ras基因編碼含有189個氨基酸共21.5 kD的膜結(jié)合型K-ras蛋白[1]。正常情況下，細(xì)胞中K-ras蛋白作為一個分子開關(guān)，調(diào)控細(xì)胞的生長和增殖。但當(dāng)K-ras基因出現(xiàn)變異或表達(dá)失控時，K-ras蛋白會處于持續(xù)激活狀態(tài)，進(jìn)而將激活Ras-Raf-絲裂原激活蛋白激酶的激酶(mitogen activated protein kinase kinase，MEK)-細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)這條信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞的異常增生，促使腫瘤形成。到目前為止，關(guān)于K-ras基因的突變或表達(dá)失控與胰腺癌、結(jié)直腸癌以及肺癌發(fā)生之間的相關(guān)性已經(jīng)研究得比較透徹了[2-4]。此外，對于K-ras基因上調(diào)與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移能力之間的聯(lián)系也有報道[5]。

Girdin蛋白是最近十年才開始被深入研究的細(xì)胞內(nèi)蛋白。目前報道表明，girdin蛋白在多種腫瘤組織中表達(dá)明顯增加，包括食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌及肺癌等[6-7]。而且，在高侵襲力及高轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞中，girdin的表達(dá)明顯增加，特別是在結(jié)腸癌和胰腺癌中更為明顯[7]。所以在本實(shí)驗(yàn)開始之前，我們就提出了K-ras蛋白和girdin蛋白之間可能存在某種信號通路聯(lián)系的假設(shè)。針對這個假設(shè)我們設(shè)計了如下實(shí)驗(yàn)對這兩個蛋白之間的信號通路及分子機(jī)制進(jìn)行了探索和研究。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

本實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑除特意指出外均購自Sigma?？筀-ras鼠單克隆抗體、girdin兔多克隆抗體、K-ras siRNA均購自Santa Cruz ；抗p-ERK1/2、Stat3兔單克隆抗體、抗ERK1/2兔多克隆抗體、抗p-Stat3鼠單克隆抗體均購自Cell Signaling；抗GAPDH 兔單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；K-ras ORF 質(zhì)粒購自O(shè)rigen；Lenti-X Lentiviral Expression Systems及pLVX-IRES-Hyg 病毒載體購自Clontech；XhoI限制性內(nèi)切酶、SpeI限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa；切膠回收試劑盒購自北京博邁德公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco；ECL化學(xué)發(fā)光液購自北京康為世紀(jì)公司；ECL Plus超敏發(fā)光液購自北京索萊寶公司；抗體稀釋液購自Calbiochem。

2 細(xì)胞系和組織標(biāo)本

COS7細(xì)胞株購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。7例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本均來自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外科，其中的對照組織均為所對應(yīng)的同一患者癌旁5 cm處的正常組織。手術(shù)中切除的組織立即放于液氮中保存。本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本，術(shù)前均告知患者及其家屬，并簽署了知情同意書。

3 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱為SANYO產(chǎn)品；半干轉(zhuǎn)膜儀為Bio-Rad產(chǎn)品；多功能成像分析系統(tǒng)為CellBioscience產(chǎn)品；Western blot灰度分析軟件為Ipwin32。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1 K-ras ORF序列的擴(kuò)增及酶切位點(diǎn)的引入

K-ras isoform-a的ORF序列來自GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M54968.1)。在PCR過程中通過上、下游引物(K-ras的上游引物為5’-gcggCTCGAGatgactgaatataaac-3’，下游引物為5’-gccgcACTAGTttacattataatg-3’)分別在上、下游引入XhoI和SpeI酶切位點(diǎn)，PCR反應(yīng)體系為 5×primer buffer 6 μL，dNTP(2.5 mmol/L)1.6 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，Primer star 0.3 μL，K-ras ORF(400 mg/L)0.2 μL，加dH2O至總反應(yīng)體系為 30 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳分離，通過切膠回收試劑盒進(jìn)行回收，整個過程完全按照試劑盒所提供的說明書操作。

4.2 K-ras病毒載體的構(gòu)建及擴(kuò)增 pLVX-IRES-Hyg病毒空載體使用XhoI和SpeI 2個限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切后產(chǎn)物使用純化試劑盒進(jìn)行純化。將上一步純化的PCR產(chǎn)物和酶切后的空載體連接，連接過程完全按照試劑盒所提供的說明書操作。最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中進(jìn)行擴(kuò)增。用含有氨芐抗性的LB平板篩選陽性克隆，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒。

4.3 病毒的包被、侵染及高表達(dá)K-ras蛋白的單克隆細(xì)胞株的篩選 用HEK293細(xì)胞包裝病毒，整個轉(zhuǎn)染過程完全嚴(yán)格按照Lenti-X Lentiviral Expression Systems轉(zhuǎn)染試劑盒中所提供說明書進(jìn)行。收獲的病毒上清用0.45 μm的無菌濾膜過濾后馬上轉(zhuǎn)導(dǎo)COS7細(xì)胞。24 h后更換1次培養(yǎng)基，48 h后更換為含有500 mg/L潮霉素的培養(yǎng)基。此后每48 h更換1次含有潮霉素的培養(yǎng)基，直至最后篩選出高表達(dá)K-ras蛋白的單克隆細(xì)胞株。

4.4 Western blot法檢測細(xì)胞中相應(yīng)蛋白的表達(dá) 高表達(dá)K-ras蛋白的單克隆細(xì)胞株在10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時，在冰上用1 mL RIPA裂解液對細(xì)胞進(jìn)行裂解，獲得全細(xì)胞裂解液。用BCA定量試劑盒對全細(xì)胞裂解液蛋白濃度進(jìn)行測定。取35 μg(檢測girdin蛋白時上樣量增至60 μg)蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，而后采用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入5%脫脂奶粉稀釋的Ⅰ抗(GADPH稀釋比例為1∶10 000，girdin稀釋比例為1∶500)，4 ℃孵育過夜，PBST洗滌3次后加入5%脫脂奶粉稀釋的Ⅱ抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，于多功能成像分析儀中檢測。

4.5 Western blot法檢測組織中相應(yīng)蛋白的表達(dá) 取約200 mg組織于1 mL RIPA裂解(含PMSF 100 mg/L)中，在冰上剪碎并超聲裂解，每次超聲時間為3 s，暫停10 s，至組織完全裂解為止，最后離心取上清(12 000×g，4 ℃，20 min)?？紤]到組織中g(shù)irdin蛋白的含量較低，所以在進(jìn)行SDS-PAGE時取最大上樣體積量，各個樣品之間的差異通過內(nèi)參照GAPDH進(jìn)行調(diào)整。為了增加檢測的敏感度，組織樣品孵育時采用了Calbiochem的抗體稀釋液以及北京索萊寶公司的ECL Plus超敏發(fā)光液，除此之外,其它均與細(xì)胞樣品處理過程一樣。

4.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取約5×105個細(xì)胞均勻地鋪于6孔板中，過夜培養(yǎng)，使融合率達(dá)到100%。使用10 μL的無菌槍頭在培養(yǎng)皿中輕輕的劃痕，然后用PBS洗滌，去除被劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。期間需測量原始劃痕和愈合后劃痕的寬度。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；人結(jié)直腸癌及其癌旁組織中g(shù)irdin及K-ras的比較采用兩配對樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)方法；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染K-ras基因后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化

高表達(dá)K-ras蛋白的單克隆細(xì)胞株在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上發(fā)生了明顯的變化。與正常的COS7細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞相比，高表達(dá)K-ras蛋白的單克隆細(xì)胞株細(xì)胞表現(xiàn)出不規(guī)則形態(tài)，見圖1。

Figure 1.The morphological changes of COS7 cells transfected withK-ras(×100). A: control; B: COS7 cells transfected with empty vector; C: COS7 cells transfected withK-ras.

圖1 COS7細(xì)胞在轉(zhuǎn)染K-ras基因前后細(xì)胞形態(tài)的變化

2 高表達(dá)或抑制K-ras蛋白后對下游相應(yīng)信號蛋白的影響

通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)K-ras蛋白的細(xì)胞株中g(shù)irdin蛋白的表達(dá)量明顯要比對照組高。因此,為了探究K-ras蛋白和girdin蛋白之間聯(lián)系，本實(shí)驗(yàn)特意對K-ras的下游信號通路和girdin的上游信號通路進(jìn)行了逐一檢測。由圖2可見，在K-ras高表達(dá)時，其下游的p-ERK1/2和p-Stat3的蛋白水平明顯增加，但ERK1/2和Stat3總量未有明顯變化。在高表達(dá)K-ras的細(xì)胞株中再次轉(zhuǎn)染K-ras siRNA以抑制K-ras的表達(dá)，其下游的p-ERK1/2和p-Stat3蛋白水平明顯減少，而且girdin也隨之減少，見圖3。

3 轉(zhuǎn)染K-ras后細(xì)胞遷移能力的變化

本次實(shí)驗(yàn)采用了細(xì)胞劃痕法對高表達(dá)K-ras的COS7細(xì)胞株的遷移能力進(jìn)行了檢測。如圖4所示， COS7_K-ras細(xì)胞株在18 h后的相對遷移率，要快于轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的COS7細(xì)胞株，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

Figure 2.The protein levels in the COS7 cells with K-ras over-expression determined by Western blot. COS7_V: COS7 cells transfected with empty vector; COS7_K-ras: COS7 cells transfected with K-ras. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCOS7;##P<0.01vsCOS7_V.

圖2 正常COS7細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體的COS7細(xì)胞及高表達(dá)K-ras蛋白的COS7細(xì)胞的Western blot檢測結(jié)果

Figure 3. The effect of K-ras siRNA on the protein levels in the COS7 cells with K-ras over-expression determined by Western blot. COS7_K-ras: COS7 cells transfected with K-ras; COS7_siRNA_K-ras: COS7 cells transfected with K-ras siRNA. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCOS7_K-ras.

圖3 高表達(dá)K-ras蛋白的COS7細(xì)胞在轉(zhuǎn)染K-ras siRNA前后的Western blot檢測結(jié)果

Figure 4. The results of scratch wound assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCOS7_V.

圖4 COS7_V和COS7_K-ras細(xì)胞株的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)直腸癌組織中K-ras和girdin蛋白的關(guān)系

此外，本次實(shí)驗(yàn)選取了7例結(jié)直腸癌組織及其癌旁組織進(jìn)行K-ras和girdin蛋白的檢測。結(jié)果顯示：其中4例癌組織K-ras和girdin的表達(dá)量都要高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；1例癌組織K-ras的表達(dá)量都要高于癌旁組織，但是girdin沒有明顯差異；還有1例組織，其癌旁組織中K-ras的表達(dá)量要高于癌組織，同時其girdin蛋白也是如此。說明二者之間或許存在某種聯(lián)系?？傮w來說，在選取的7例組織中，癌組織的girdin及K-ras的表達(dá)要高于癌旁組織，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

討 論

在本實(shí)驗(yàn)中以高表達(dá)K-ras蛋白的COS7細(xì)胞作為研究對象，對K-ras蛋白和girdin蛋白之間的信號通路進(jìn)行了詳細(xì)的闡述。當(dāng)K-ras蛋白高表達(dá)時其下游的p-ERK1/2是明顯增加，這與Cagnol和Miller等的研究結(jié)果一致[8-9]。根據(jù)Gough等[10]報道，當(dāng)ERK1/2被激活時,其下游的Stat3也會隨之被激活，這也與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符。Dunkel等[11]研究表明Stat3蛋白和girdin蛋白之間存在著一個相互作用的結(jié)合位點(diǎn)，并且當(dāng)2個蛋白之中的任意一個激活時都可以促使另一個蛋白的上調(diào)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為K-ras對girdin的調(diào)控可能是通過K-ras-ERK1/2-Stat3-girdin這條信號通路完成。此外結(jié)腸癌組織的結(jié)果也在一定程度上說明在癌組織中二者之間存在關(guān)聯(lián)。但girdin蛋白除受K-ras蛋白調(diào)控之外肯定還是受到其它信號通路的影響，所以會出現(xiàn)組織的差異，例如Enomoto等[12]所發(fā)現(xiàn)的PI3K-AKT信號通路可能就是其中之一。

Figure 5.The protein expression of girdin and K-ras in the colorectal carcinoma and their adjacent tissues. C: colorectal cancer tissues; P: pericarcinous tissues. Mean±SD.n=7.*P<0.05vspericarcinous tissues.

圖5 人結(jié)直腸癌及其癌旁組織Western blot結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在高表達(dá)K-ras后COS7細(xì)胞四周出現(xiàn)了明顯不規(guī)則形狀，而且細(xì)胞的遷移能力也明顯增加。Jiang等[6]通過動物模型研究發(fā)現(xiàn)，girdin在乳腺癌的轉(zhuǎn)移過程中起到了關(guān)鍵的作用，此外也有研究也表明在具有高度轉(zhuǎn)移能力的結(jié)腸癌和胰腺癌中g(shù)irdin蛋白的表達(dá)量是明顯增加的[7]，這些都與細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。所以我們認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)中g(shù)irdin蛋白的上調(diào)是細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)的原因之一。

本實(shí)驗(yàn)首次將K-ras蛋白和girdin蛋白之間的信號通路進(jìn)行了搭建，也比較明確地闡述了K-ras蛋白、girdin蛋白以及細(xì)胞遷移能力之間的聯(lián)系，可以為臨床上結(jié)腸癌、胰腺癌以及乳腺癌等一些與K-ras相關(guān)的腫瘤的治療提供一定的參考。在本實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上深入研究K-ras基因的突變與girdin蛋白之間的聯(lián)系以及這2個蛋白之間的相關(guān)性將是我們以后的目標(biāo)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Regulatory mechanisms of K-ras to girdin in COS7 cells and expression of K-ras and girdin in colorectal carcinoma

WU Zhi-hao, LIU Hai-bin, ZHENG Min

(DepartmentofGeneralSurgery,TheSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:1018885905@qq.com)

AIM: To investigate molecular regulatory mechanism of K-ras to girdin protein in COS7 cells and expression of K-ras and girdin in colorectal carcinoma tissues. METHODS: The lentiviral vector carryingK-rasgene was constructed and transfected in the COS7 cells. The expression of K-ras, girdin proteins and other related proteins in COS7 cells and colorectal carcinoma tissues was observed by Western blot. RESULTS: The COS7 cells with K-ras over-expression showed an irregular cell morphology. The results of Western blot indicated that the downstream signal protein levels of p-ERK1/2, p-Stat3 and girdin were significantly increased in the COS7 cells with K-ras over-expression. Transfection with the K-ras siRNA into the COS7 cells significantly reduced the protein levels of p-ERK1/2, p-Stat3 and girdin. In the colorectal carcinoma tissues (7 cases), 5 cases had higher expression of K-ras and girdin compared with pericarcinous tissues. CONCLUSION: K-ras regulates girdin expression through the signal pathway of K-ras-ERK1/2-Stat3-girdin.

K-ras; Girdin; Colorectal cancer

1000- 4718(2017)02- 0297- 05

2016- 04- 15

2016- 10- 31

R730．23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.017

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△通訊作者 Tel: 15967431898； E-mail: 1018885905@qq.com