miRNA-363通過調(diào)控SOX4影響骨肉瘤細胞生長及凋亡*

萬 廣， 楊 慧， 吳大鵬， 柳申鵬， 梁秋冬△

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科， 2新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 河南 新鄉(xiāng) 453100)

miRNA-363通過調(diào)控SOX4影響骨肉瘤細胞生長及凋亡*

萬 廣1， 楊 慧2， 吳大鵬1， 柳申鵬1， 梁秋冬1△

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，2新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 河南 新鄉(xiāng) 453100)

目的： 探討骨肉瘤組織中miRNA-363及SOX4的表達水平，以及miRNA-363對骨肉瘤細胞活力、細胞周期以及凋亡的影響及機制。方法: 用real-time PCR法檢測63 例骨肉瘤患者腫瘤組織與癌旁組織中miRNA-363及SOX4的表達水平及相關(guān)性。用脂質(zhì)體法將miRNA-363 mimics瞬時轉(zhuǎn)染入MG-63人骨肉瘤細胞，檢測細胞中miRNA-363及SOX4的表達水平；CCK-8實驗檢測各組細胞的活力；流式細胞術(shù)檢測各組細胞的周期及凋亡率；檢測轉(zhuǎn)染SOX4 siRNA或質(zhì)粒后miRNA-363的表達水平。結(jié)果: 骨肉瘤組織miRNA-363 表達明顯低于瘤旁組織，SOX4的mRNA表達明顯高于瘤旁組織，miRNA-363與SOX4的表達水平呈明顯負相關(guān)。轉(zhuǎn)染miRNA-363 mimics后MG-63細胞miRNA-363的表達水平明顯上調(diào)，SOX4 mRNA及蛋白的表達水平明顯下降；同時，細胞活力明顯下降，細胞周期阻滯在G0/G1期，凋亡率增高。改變SOX4表達后，miRNA-363的表達無明顯變化，升高SOX4表達能夠恢復(fù)miRNA-363抑制的細胞活力。結(jié)論: miRNA-363在骨肉瘤中呈低表達水平，過表達miRNA-363可能通過調(diào)控SOX4抑制骨肉瘤細胞的生長，并促進細胞凋亡。

miRNA-363； SOX4； 骨肉瘤； 細胞活力； 細胞凋亡

骨肉瘤是一種常見的原發(fā)于骨的惡性腫瘤，起源于間葉組織，惡性程度較高[1]，好發(fā)于青少年，骨肉瘤最主要的治療方式包括外科切除結(jié)合術(shù)后放化療，但骨肉瘤患者預(yù)后仍然較差，5年生存率為55%～68%[2]，基因水平的治療是骨肉瘤研究的重要方面。

微小RNA(microRNA，miRNA)是由20～25個核苷酸組成的非編碼小分子RNA，miRNA 通過與靶mRNA的3’端完全或不完全的互補結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA 的降解或翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行負調(diào)控[3]，從而實現(xiàn)影響細胞增殖、分化和凋亡[4-5]。

miRNA-363是let-7 家族中成員，已經(jīng)被證實在多種腫瘤中低表達[6-8]，但miRNA-363對骨肉瘤的作用尚不明確。本研究旨在探討miRNA-363在骨肉瘤組織中的表達水平及miRNA-363對骨肉瘤細胞生物學(xué)特性的影響及作用機制，以期為骨肉瘤的基因靶向治療提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 臨床資料

收集新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科自2010年1月～2014年12月手術(shù)切除并經(jīng)病理檢測證實的骨肉瘤標(biāo)本63例，41例男性，22例女性，年齡6～52歲，平均20.6歲。所有患者術(shù)前均未曾經(jīng)過放化療治療，腫瘤的邊緣組織經(jīng)過病理證實無癌腫侵犯為對照組。本實驗獲得患者的知情同意，并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員審核通過。

2 實驗材料

人骨肉瘤MG-63細胞購買自中科院上海細胞庫；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)液購自HyClone；TRIzol及逆轉(zhuǎn)錄、實時熒光定量PCR試劑盒、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自TaKaRa；miRNA-363及SOX4引物、miRNA-363 mimics(序列為5’-AAUUGCACGGUAUCCAUCUGUA-3’)、SOX4 siRNA(sense：5’-GGACCAAAUUUUUUCUCAGTT-3’;antisense：5’-CUGAGAAAAAAUUUGGUCCTG-3’)及其質(zhì)粒由武漢博士德公司合成；抗SOX4及內(nèi)參的 I 抗購自Abcam。

3 實驗方法

3.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清、37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)骨肉瘤MG-63細胞，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取對數(shù)期生長的活力較好的細胞種板，參照Lipofectamine 2000說明書進行轉(zhuǎn)染，miRNA-363 mimics轉(zhuǎn)染實驗分空白對照組(blank組)、無義序列對照組(miR-NC組)和miRNA-363 mimics組；SOX4 siRNA轉(zhuǎn)染實驗分為空白對照組(blank組)、無義序列對照組(NC siRNA)和SOX4 siRNA組。

表1 Real-time PCR實驗的引物序列

3.2 Real-time PCR檢測骨肉瘤組織及MG-63細胞中相關(guān)mRNA的表達 TRIzol法提取組織或細胞的總RNA，檢測所提取的RNA的純度及濃度后，用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)體系為cDNA模板 1 μL,SYBR Premix Ex Taq 10 μL,上、下游引物各0.5 μL，加無核酶水補充至20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s,60℃ 30 s，35循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算miRNA-363及SOX4 mRNA的表達水平。

3.3 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后MG-63細胞活力的改變 將轉(zhuǎn)染后24 h的細胞消化后收集，按每孔2×103接種到96孔板，各組設(shè)5個復(fù)孔。于種板后1～5 d進行檢測，待細胞貼壁后，用CCK-8法分別測定1～5 d時細胞的活力。檢測前2 h，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育2 h，利用酶標(biāo)儀測定450 nm 波長處各孔的吸光度(A)值。

3.4 流式細胞術(shù)檢測miRNA-363 mimics轉(zhuǎn)染后的細胞周期及凋亡水平 用75%濃度的乙醇固定轉(zhuǎn)染后的MG-63骨肉瘤細胞，加入1 g/L 的RNase A溶液200 μL，放入37 ℃的條件下培養(yǎng)30 min，之后加入800 μL的碘化丙啶染色溶液，充分混勻后放置于4 ℃條件下避光染色30 min后，上機檢測MG-63細胞的細胞周期水平。采用1×buffer洗滌轉(zhuǎn)染后的MG-63細胞沉淀，重懸后收集沉淀，下一步采用1 mL 1×staining buffer繼續(xù)重懸細胞，取100 μL細胞液加入5 μL Annexin V-APC溶液進行染色，室溫避光15 min后上機檢測MG-63細胞的凋亡水平。

3.5 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后MG-63細胞中SOX4蛋白的表達水平 將蛋白提取緩沖液加入轉(zhuǎn)染后的MG-63骨肉瘤細胞中，收集其細胞的裂解液，測定蛋白濃度后根據(jù)其濃度情況調(diào)節(jié)每孔的上樣量，于10% SDS-PAGE分離蛋白后進行轉(zhuǎn)膜，之后將膜放置于5% 脫脂奶粉封閉液中封閉，加入抗SOX4的I抗孵育，洗膜后孵育 II 抗，然后進行顯影、定影。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析。實驗均重復(fù)3次，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組織分析采用兩獨立樣本的t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，mRNA表達之間的相關(guān)性分析采用直線相關(guān)分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Real-time PCR檢測骨肉瘤組織中miRNA-363和SOX4 mRNA的表達水平

Real-time PCR檢測骨肉瘤組織及其癌旁組織中的miRNA-363及SOX4 mRNA的表達，結(jié)果顯示：與癌旁組織相比較，骨肉瘤組織中miRNA-363的表達明顯降低(P<0.05)； 而SOX4的mRNA表達明顯升高(P<0.05)。行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)骨肉瘤中miRNA-363與SOX4 mRNA的表達水平呈明顯負相關(guān)(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression levels of miRNA-363 (A) and SOX4 mRNA (B) in the osteosarcoma and adjacent normal tissues were detected by real-time PCR. The correlation between the levels of miRNA-363 and SOX4 mRNA was analyzed (C). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsadjacent tissues groups.

圖1 Real-time PCR檢測骨肉瘤及癌旁組織的miRNA-363水平和SOX4的mRNA表達情況及兩者的相關(guān)性

2 Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染miRNA-363 mimics后細胞相關(guān)mRNA的表達水平

Real-time PCR檢測結(jié)果顯示miRNA-363 mimics組、miR-NC組和blank組miRNA-363的表達水平分別為1.96±0.18、1.13±0.16和1.03±0.17，與blank組和miR-NC組比，miRNA-363 mimics組細胞miRNA-363的表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染成功。而miRNA-363 mimics組、miR-NC組和blank組SOX4的mRNA表達水平分別為0.49±0.07、1.07±0.14和0.96±0.09，與blank組和miR-NC組比，miRNA-363 mimics組細胞SOX4的mRNA 表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

3 Western blot檢測轉(zhuǎn)染miRNA-363 mimics后細胞SOX4蛋白的表達水平

Western blot實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-363 mimics組的SOX4 蛋白表達水平較miR-NC組和blank組明顯升高(P<0.05)，blank組與miR-NC組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖3。

4 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染miRNA-363 mimics后細胞活力的變化

骨肉瘤MG-63細胞轉(zhuǎn)染miRNA-363 mimics后，與blank及miR-NC組比較，從第3天開始miRNA-363 mimics組的骨肉瘤MG-63細胞的細胞活力較blank組與miR-NC組明顯減弱(P<0.05)，blank組與miR-NC組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖4。

Figure 2.The expression levels of miRNA-363 (A) and SOX4 mRNA (B) in the MG-63 cells after transfection with miRNA-363 mimics were detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-363 mimics.

圖2 miRNA-363 mimics轉(zhuǎn)染MG-63細胞后miRNA-363及SOX4 mRNA表達水平的比較

Figure 3.The protein expression of SOX4 was detected by Wes-tern blot after transfection with miRNA-363 mimics. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-363 mimics.

圖3 Western blot檢測miRNA-363 mimics轉(zhuǎn)染MG-63細胞后SOX4蛋白的表達水平

5 流式細胞術(shù)分析MG-63細胞轉(zhuǎn)染miRNA-363 mimics后細胞周期的變化

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，blank組、miR-NC組及miRNA-363 mimics組的G0/G1期細胞所占比例分別為55.36±5.15、53.35±4.78和70.21±5.62。miRNA-363 mimics組較blank組和miR-NC組G0/G1期細胞所占比例明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

Figure 4.The changes of the viability of the MG-63 cells after transfection with miRNA-363 mimics detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-363 mimics.

圖4 CCK-8檢測轉(zhuǎn)染后不同時點MG-63細胞活力的變化

Figure 5.The cell cycles of MG-63 cells after transfection with miRNA-363 mimics analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-363 mimics.

圖5 流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染miRNA-363 mimics后各組細胞周期情況的變化

6 流式細胞術(shù)分析MG-63細胞轉(zhuǎn)染后細胞凋亡的變化

檢測各組凋亡率結(jié)果顯示，blank組為(9.69±0.73)%,miR-NC組為(9.36±1.54)%,miRNA-363 mimics組為(15.79±3.49)%。miRNA-363 mimics組細胞凋亡率明顯升高，與blank組及miR-NC組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

Figure 6.The changes of apoptotic rate of the MG-63 cells after transfection with miRNA-363 mimics analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-363 mimics.

圖6 流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染miRNA-363 mimics后各組細胞凋亡率的變化

7 Real-time PCR法檢測轉(zhuǎn)染SOX4 siRNA及質(zhì)粒后miRNA-363的表達水平

Real-time PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染SOX4 siRNA后，SOX4的mRNA表達明顯被抑制；轉(zhuǎn)染pcDNA/SOX4后，SOX4的mRNA表達明顯升高，3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但miRNA-363表達水平不受SOX4的變化影響，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖7。

Figure 7.The expression levels of SOX4 mRNA and miRNA-363 were evaluated using real-time PCR in the MG-63 cells after transfection withSOX4 siRNA or pcDNA/SOX4. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control.

圖7 調(diào)節(jié)SOX4表達后對SOX4 mRNA及miRNA-363表達水平的影響

8 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染SOX4質(zhì)粒后細胞活力的變化

骨肉瘤MG-63細胞轉(zhuǎn)染miRNA-363 mimics和pcDNA/SOX4后，與對照組比較，其骨肉瘤MG-63細胞的細胞活力明顯升高(P<0.05)，表明上調(diào)SOX4表達后，SOX4能明顯恢復(fù)miRNA-363抑制的細胞活力，見圖8。

Figure 8.The changes of the viability of the MG-63 cells after transfection with pcDNA/SOX4 detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-363 mi-mics+pcDNA.

圖8 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染pcDNA/SOX4后不同時點MG-63細胞活力的變化

討 論

骨肉瘤惡性程度高，目前的治療手段一般為手術(shù)聯(lián)合術(shù)后的化療，但其治療后骨肉瘤患者的預(yù)后仍較差。研究表明miRNA 具有廣泛的基因調(diào)節(jié)功能， miRNA的表達水平在骨肉瘤中表達異常，認為骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展可能與miRNA有著密切的關(guān)系[7-8]。

miR-363已被報道在多種類型的腫瘤細胞中失調(diào)，并對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到重要的調(diào)控作用[9]，最新研究發(fā)現(xiàn)miR-363在乳頭狀甲狀腺癌[10]、結(jié)直腸癌[11]、早期T 細胞前體急性淋巴細胞白血病(early T-cell precursor acute lymphoblastic leukaemia，ETP-ALL)[12]等腫瘤中呈低表達。此外，過表達miR-363可以明顯降低HepG2-R細胞對順鉑的抗藥性[13]，同時明顯降低頭頸部腫瘤細胞的遷移能力[14]及明顯抑制腎癌細胞的細胞增殖、遷移水平[15]。預(yù)后研究發(fā)現(xiàn)，頭頸部腫瘤低表達miR-363的患者的預(yù)后較差[16]，以上研究表明miR-363對腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有重要作用，miRNA-363可以通過完全結(jié)合靶mRNA的 3’UTR區(qū)，降解靶標(biāo)mRNA，或不完全的形式結(jié)合抑制其翻譯過程，從而形成負性調(diào)控作用。但miRNA-363對骨肉瘤的影響及相關(guān)下游機制尚不清楚，需要進一步驗證。

Hu等[17]在結(jié)腸癌HT290細胞中抑制miR-363-3p的表達水平，發(fā)現(xiàn)細胞中SOX4的表達水平明顯升高，其進一步行螢光素酶實驗發(fā)現(xiàn)，在293T細胞中升高miR-363-3p的表達水平，能夠抑制野生型SOX4 3’UTR表達載體的螢光素酶活性，但對突變型SOX4 3’UTR表達載體的螢光素酶活性無明顯影響，表明在結(jié)腸癌細胞中SOX4可能為miR-363的下游靶基因。SOX基因家族是一類新的控制發(fā)育的基因家族， 主要特征是具有一個保守的HMG 盒，可與DNA 序列特異結(jié)合，是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[18]。目前研究發(fā)現(xiàn)SOX4 在多種腫瘤細胞中呈高表達的失調(diào)水平，并與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[19]。SOX4 是SOX 家族一員，參與多種組織器官發(fā)育，多個研究發(fā)現(xiàn)SOX4 作為轉(zhuǎn)錄因子可能也參與腫瘤的生長調(diào)控過程，SOX4 與肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌以及前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[20]。SOX4 可能是一種致癌基因，但其在骨肉瘤中的作用及其調(diào)控機制尚不明確。

為探究miR-363及SOX4對骨肉瘤的作用，本研究首先在骨肉瘤組織中行熒光定量PCR實驗，發(fā)現(xiàn)miRNA-363的表達水平在骨肉瘤組織中較其癌旁正常組織明顯降低，得出miRNA-363在骨肉瘤中呈低表達的結(jié)論；同時發(fā)現(xiàn)SOX4在骨肉瘤表達水平明顯高于癌旁組織；并行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-363與SOX4 mRNA的表達水平呈明顯負相關(guān)，表明mi-RNA-363與SOX4關(guān)系密切，可能存在相互調(diào)控關(guān)系。

為了進一步探討miRNA-363與SOX4在骨肉瘤細胞的關(guān)系及作用機制，將miRNA-363 mimics轉(zhuǎn)染入骨肉瘤MG-63細胞中，經(jīng)熒光定量PCR證實細胞中的miRNA-363表達水平升高，表明轉(zhuǎn)染成功，并且SOX4 mRNA及蛋白表達水平明顯受到抑制，表明抬高miRNA-363表達可明顯抑制SOX4的表達水平，在骨肉瘤細胞中驗證了miRNA-363對SOX4具有調(diào)控關(guān)系。

為了驗證miRNA-363 mimics對骨肉瘤細胞生長及凋亡的影響，轉(zhuǎn)染后行CCK-8實驗顯示miRNA-363的表達水平上調(diào)后，MG-63細胞的細胞活力明顯受抑制，通過流式細胞術(shù)對細胞周期和凋亡率的分析，miRNA-363的表達上調(diào)，G0/G1期的MG-63細胞數(shù)明顯增加，表明細胞生長受限，并且發(fā)現(xiàn)miRNA-363表達上調(diào)后，細胞凋亡數(shù)目明顯增多，凋亡率增高。結(jié)果表明miRNA-363 表達水平上調(diào)后MG-63 細胞生長受抑制并凋亡水平增加。

我們研究發(fā)現(xiàn)抑制或者上調(diào)SOX4的表達后，miRNA-363的表達水平無明顯變化，進一步表明miR-363對SOX4的單向調(diào)控作用；而恢復(fù)SOX4的表達水平后，因miRNA-363抑制的細胞活力能夠被明顯恢復(fù)，表明miRNA-363 可能是通過調(diào)控SOX4 對骨肉瘤細胞的生長、凋亡等產(chǎn)生影響。

綜上所述，miRNA-363 在骨肉瘤組織中呈低表達，miRNA-363通過調(diào)控SOX4抑制骨肉瘤MG-63 細胞活力及促進其凋亡。因此miRNA-363 可能在骨肉瘤中作為一種抑癌基因，并為骨肉瘤的分子治療提供了新的靶點。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Repressive effect of miRNA-363 via SOX4 on human osteosarcoma cell growth and apoptosis

WAN Guang1, YANG Hui2, WU Da-peng1, LIU Shen-peng1, LIANG Qiu-dong1

(1DepartmentofOrthopaedics,TheFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,2DepartmentofNeurology,TheCentralHospitalofXinxiang,Xinxiang453100,China.E-mail: 13837385528@163.com)

AIM: To detect the expression of miRNA-363 and SOX4 in osteosarcoma tissues and to investigate the effect of miRNA-363 on the viability and apoptosis of human osteosarcoma cell line MG-63. METHODS: Real-time PCR was used to detect the expression level and the relationship of miRNA-363 and SOX4 mRNA in the osteosarcoma tissues and the corresponding paratumorous tissues collected from 63 patients. The expression levels of miRNA-363 and SOX4 in osteosarcoma cell line MG-63 after transfected with miRNA-363 mimics were measured. The cell viability was measured by CCK-8 assay. Flow cytometry was used to monitor the changes of cell cycle and apoptosis. The changes of SOX4 and miRNA-363 expression levels in the MG-63 cells after transfection withSOX4 siRNA or pcDNA/SOX4 was detect by real-time PCR. RESULTS: The expressed level of miRNA-363 was lower, and the expression level of SOX4 was higher in the osteosarcoma tissues than those in the adjacent normal tissues. A significantly negative correlation between the expression levels of miRNA-363 and SOX4 was observed. The expression of miRNA-363 in the MG-63 cells after transfection with miRNA-363 mimics was significantly up-regulated, while the expression of SOX4 in the MG-63 cells was significantly down-regulated, with significant difference as compared with the cells transfected with miRNA-NC and control cells. The viability of MG-63 cells was inhibited, the cell cycle was arrested in G0/G1phase, and the cell apoptosis was increased by transfection with miRNA-363 mimics. The relative protein expression levels of SOX4 inSOX4 siRNA group and pcNDA/SOX4 group were significantly different from those in negative control group, but the relative expression levels of miRNA-363 had no significant difference. Over-expression of SOX4 restored the viability of the MG-63 cells reduced by miR-363.CONCLUSION: The expression level of miRNA-363 is low in human osteosarcoma tissue. miRNA-363 may inhibits the viability of osteosarcoma cell line MG-63 and promotes cell apoptosisinvitrovia inhibiting the SOX4 expression．

miRNA-363; SOX4; Osteosarcoma; Cell viability; Apoptosis

1000- 4718(2017)02- 0278- 06

2016- 08- 09

2016- 10- 09

吳階平醫(yī)學(xué)基金會臨床科研專項資助基金(No. 320274516224)

R730.23； R738.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.014

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