下調(diào)CENP-W對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的影響*

汲乾坤， 李建斌， 范陽華， 徐 斌， 柴 毅， 紀(jì)晨星， 祝新根△

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科， 河南 新鄉(xiāng)453100； 2南昌市第二醫(yī)院神經(jīng)外科，3南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科， 江西 南昌 330006)

下調(diào)CENP-W對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的影響*

汲乾坤1， 李建斌2， 范陽華3， 徐 斌3， 柴 毅3， 紀(jì)晨星3， 祝新根3△

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科， 河南 新鄉(xiāng)453100；2南昌市第二醫(yī)院神經(jīng)外科，3南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科， 江西 南昌 330006)

目的： 研究下調(diào)著絲粒蛋白W(centromere protein W，CENP-W)的表達(dá)水平對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的影響。 方法：采用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)抑制人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞CENP-W的表達(dá)，采用RT-qPCR和Western blot法評(píng)價(jià)siRNA的干擾效果，采用MTT法、BrdU實(shí)驗(yàn)和平板集落形成實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞的增殖，Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲力的變化，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的改變。 結(jié)果：MTT實(shí)驗(yàn)、平板集落形成實(shí)驗(yàn)和BrdU實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染siRNA的實(shí)驗(yàn)組U87細(xì)胞的增殖能力、集落形成能力較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組明顯降低；Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移、侵襲能力較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組明顯減弱；流式細(xì)胞術(shù)分析表明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡比例較對(duì)照組增多(P<0.05)。 結(jié)論：下調(diào)CENP-W的表達(dá)可抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，提示CENP-W有望成為人腦膠質(zhì)瘤基因治療的候選靶點(diǎn)。

著絲粒蛋白W； 小干擾RNA； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞侵襲

腦膠質(zhì)瘤是一種源自神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞而主要發(fā)生在人大腦中的腫瘤[1]。腦膠質(zhì)瘤具有無控性增殖、侵襲性生長、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)[2-3]。目前研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與多種致癌基因過度表達(dá)及抑癌基因的失活密切相關(guān)[4]。因此尋找具有抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性表型的相關(guān)基因，深入揭示其作用機(jī)制，對(duì)膠質(zhì)瘤的治療具有重要意義。

著絲粒蛋白W(centromere protein W，CENP-W)作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的蛋白，主要分布于細(xì)胞核中，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞著絲粒中，CENP-W參與DNA結(jié)合復(fù)合物的形成，在維持細(xì)胞正常有絲分裂雙極紡錘體的形成過程中具有重要作用。目前國內(nèi)外對(duì)于CENP-W與膠質(zhì)瘤的相關(guān)研究較少。本研究采用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)下調(diào)CENP-W的表達(dá)，觀察CENP-W對(duì)腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲等生物學(xué)表型的影響，期望為腦膠質(zhì)瘤的治療提供新的治療靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 主要材料和試劑

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87細(xì)胞購于南昌長城生物試劑中心；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和RNA抽提試劑TRIzol購自Invitrogen；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-qPCR試劑盒購自TaKaRa；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒和細(xì)胞總蛋白抽提試劑盒購自Abcam；兔抗人CENP-W多克隆抗體購自RayBiotech，鼠抗人β-actin 抗體購自北京長城生物產(chǎn)業(yè)責(zé)任有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)所用的DMEM購自Gibco；Transwell板購自Corning；針對(duì)CENP-W基因序列的特異性siRNA以及CENP-W 和β-actin的PCR引物均由Invitrogen設(shè)計(jì)并合成。FACSCalibur流式細(xì)胞儀為BD產(chǎn)品。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA 轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活的新生小牛血清、100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2和95%濕度的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞種植于6孔板，培養(yǎng)至60%～80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法參照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行。siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分3組：未轉(zhuǎn)染對(duì)照組、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組和轉(zhuǎn)染siRNA實(shí)驗(yàn)組。CENP-W siRNA的序列為5’- GCAGAAGAG-TCCAGGACAA-3’，陰性對(duì)照序列為5’-GCATGGAGAGAGCAACCAA-3’。轉(zhuǎn)染后6 h，將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)可見點(diǎn)狀熒光，若熒光細(xì)胞比例占50%以上則判斷為轉(zhuǎn)染成功。無血清培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，5 min后輕輕混勻稀釋的siRNA寡核苷酸和Lipofectamine 2000稀釋液，室溫放置20 min，使之充分結(jié)合，加入細(xì)胞中，輕輕混勻。37 ℃、5% CO2溫箱中孵育6 h，加入與每孔中液體等體積的含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，12 h后更換含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后采用下述方法進(jìn)行相關(guān)檢測。

2.2 RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞中CENP-W的mRNA表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，用TaKaRa的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以RT-qPCR檢測各組CENP-W mRNA的表達(dá)量?？偡磻?yīng)體系20 μL，其中SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物各0.5 μL(2.5 μmol/L)，cDNA模板1 μL，RNase-free H2O加至20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s, 58.8 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。CENP-W的上游引物為5’-AGTGGTGACTTATTGGTCCATCTG-3’，下游引物為5’-AAGCGTTTGTCCTGGACTCTTC-3’。整個(gè)反應(yīng)過程中熒光信號(hào)的變化由qPCR儀監(jiān)測。反應(yīng)結(jié)束后，電腦自動(dòng)分析并顯示計(jì)算結(jié)果，2-ΔΔCt為CENP-W的 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2.3 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞中CENP-W蛋白的表達(dá) 用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心15 min取上清液，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白膠條轉(zhuǎn)移至PVDF膜，TBST洗膜后加入5%脫脂奶粉封閉液中37 ℃封閉2 h，TBST洗膜3次，加Ⅰ抗4 ℃過夜孵育。TBST 漂洗后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠Ⅱ抗(工作液稀釋比例均為1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，置增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑ECL底物中反應(yīng)5 min，暗室曝光顯示特異的蛋白信號(hào)，依據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒操作說明進(jìn)行顯影、定影。利用凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行灰度掃描和凈光密度值分析。

2.4 MTT法檢測siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞活力的影響 U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染后1 d，按每孔100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。siRNA轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞株12 h、24 h、48 h和72 h，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，室溫下再培養(yǎng)4 h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加150 μL DMSO，紫外分光光度計(jì)570 nm波長測各孔吸光度值。

2.5 BrdU實(shí)驗(yàn)檢測U87細(xì)胞增殖活性 轉(zhuǎn)染后24 h的細(xì)胞按2×104細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，加入10 μmol/L的BrdU，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS 洗滌2 次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3次，2 mol/L鹽酸作用40 min，血清封閉后加入抗BrdU 抗體，4 ℃過夜，室溫復(fù)溫后加入羅丹明標(biāo)記的熒光Ⅱ抗，DAPI復(fù)染后，任取5個(gè)視野計(jì)數(shù)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞侵襲能力的變化 轉(zhuǎn)染48 h后在Transwell上室中加入1∶2(基質(zhì)膠∶DMEM)稀釋后的基質(zhì)膠60 μL，37 ℃ 30 min使其聚合成凝膠。在下室中加入細(xì)胞條件培養(yǎng)液600 μL。待檢細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，上室中加入1×105個(gè)細(xì)胞，24 h后棄上室液體，擦去Transwell小室上室面未穿過膜的細(xì)胞，甲醇固定30 min風(fēng)干后用0.1 %的結(jié)晶紫染色20 min。200倍下計(jì)數(shù)上、中、下、左、右5個(gè)視野中黏附細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，以上所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 用標(biāo)記筆在6孔板背面均勻劃橫線，兩兩相隔0.6 cm左右，每孔穿過5～6條橫線。在6孔板的每個(gè)孔中加入約3×105個(gè)細(xì)胞。次日用細(xì)胞刮劃痕，劃痕和背面的橫線相互垂直，清理掉劃痕時(shí)劃下的細(xì)胞，添加純培養(yǎng)基置溫箱培養(yǎng)。按0 h、6 h、12 h、24 h取樣測距，觀察時(shí)間不要超過1個(gè)細(xì)胞周期，可避免假陽性結(jié)果。

2.8 平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測CENP-W對(duì)細(xì)胞增殖能力的作用 取轉(zhuǎn)染48 h后處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，消化成單細(xì)胞懸液，按設(shè)計(jì)好的梯度稀釋，接種于6孔板中。置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周左右，細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)心觀察，當(dāng)6孔板中出現(xiàn)可見的克隆時(shí)，培養(yǎng)即可終止。PBS液清洗后用多聚甲醛固定細(xì)胞，清除固定液，加一定量的GIMSA染色液染色20 min，洗去染色液，晾干，觀察計(jì)數(shù)細(xì)胞的克隆情況，以大于30個(gè)細(xì)胞作為一個(gè)成功的克隆。

2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 U87細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。siRNA轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞2 d后收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞3次，加入預(yù)冷75%乙醇固定，4 ℃過夜。每孔加入100 mg/L的RNase 10 μL及50 mg/L的碘化丙啶緩沖液300 μL，4 ℃避光30 min，使用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測。

2.10 細(xì)胞凋亡的檢測 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，待細(xì)胞密度為70～80%時(shí)將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L。取0.5 mL細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心4 min，棄上清，加0．5 mL binding buffer 重懸細(xì)胞，加入1 μL熒光標(biāo)記的Annexin V試劑，混勻后避光室溫下孵育20 min，加入5 μL PI，混勻后避光4 ℃下孵育5 min，加入0.5 mL binding buffer，行流式細(xì)胞術(shù)分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，比較采用單因素方差分析。進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，百分?jǐn)?shù)的比較采用2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 用Lipofectamine 2000對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞進(jìn)行CENP-W siRNA轉(zhuǎn)染

CENP-W siRNA轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞6 h后，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，可見絕大多數(shù)細(xì)胞都熒光著色，被轉(zhuǎn)染細(xì)胞有明顯的細(xì)胞輪廓，見圖1。

Figure 1.The green fluorescence in the U87 cells transfeced with CENP-W siRNA after 6 h (×100).

圖1 人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后熒光表達(dá)的改變

2 RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞CENP-W的mRNA表達(dá)

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示空白對(duì)照組(blank組)、陰性對(duì)照組(NC siRNA組)和轉(zhuǎn)染組(CENP-W si-RNA組)的值分別為1.04±0.16、1.12±0.12和0.42±0.07，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，CENP-W siRNA組細(xì)胞CENP-W的mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression levels of CENP-W in the U87 cells after transfection with CENP-W siRNA detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCENP-W siRNA.

圖2 CENP-W siRNA 轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞對(duì)CENP-W mRNA表達(dá)的影響

3 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞CENP-W蛋白的表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和CENP-W siRNA轉(zhuǎn)染組的CENP-W蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.96±014、1.12±0.19和0.27±0.08，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，CENP-W siRNA組細(xì)胞的CENP-W蛋白的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3。

Figure 3.The protein levels of CENP-W in the U87 cells after transfection with CENP-W siRNA detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCENP-W siRNA.

圖3 CENP-W siRNA轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞對(duì)CENP-W蛋白表達(dá)的影響

4 MTT法檢測細(xì)胞活力的變化

與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染后24 h，轉(zhuǎn)染CENP-W siRNA組U87細(xì)胞的細(xì)胞活力明顯減弱(P<0.05)，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4。

Figure 4.The viability of the U87 cells after transfection with CENP-W siRNA determined by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCENP-W siRNA.

圖4 MTT檢測轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間U87細(xì)胞的活力

5 BrdU實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力

與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染后24 h，轉(zhuǎn)染CENP-W siRNA組U87細(xì)胞的增殖能力明顯減弱(P<0.05)，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖5。

6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力

與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比較，CENP-W siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖6。

Figure 5.The proliferation ability of the U87 cells after transfection of CENP-W siRNA detected by BrdU incorporation (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCENP-W siRNA.

圖5 BrdU實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞的增殖能力

Figure 6.The effects of CENP-W siRNA transfection on the invasion ability of the U87 cells (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCENP-W siRNA.

圖6 轉(zhuǎn)染CENP-W siRNA對(duì)U87細(xì)胞侵襲能力的影響

7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

劃痕后即可在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察劃痕的寬度，結(jié)果如圖7所示。劃痕后24 h，精確記錄劃痕寬度。結(jié)果提示，U87細(xì)胞在劃痕后24 h的測距寬度為0.71±0.06。同一時(shí)點(diǎn)空白組和陰性對(duì)照組的測距寬度分別是0.38±0.04和0.41±0.06。結(jié)果說明實(shí)驗(yàn)組的劃痕寬度愈合速度明顯減慢，與空白組和陰性對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而空白組和陰性對(duì)照組的劃痕寬度相差不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

Figure 7.The migration capability of U87 cells after transfection of CENP-W siRNA analyzed by wound healing assay (×50). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCENP-W siRNA.

圖7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測CENP-W對(duì)細(xì)胞遷移能力的作用

8 平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力

與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染CENP-W siRNA組U87細(xì)胞的集落形成能力明顯減弱(P<0.05)，空白組與陰性組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖8。

Figure 8.The cell proliferation ability of U87 cells after transfection of CENP-W siRNA analyzed by colony formation experiments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCENP-W siRNA.

圖8 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測CENP-W對(duì)細(xì)胞增殖能力的作用

9 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期的變化

空白對(duì)照組細(xì)胞G0/G1、S和G2/M期分別占41.36%、32.14%和26.50%，陰性對(duì)照組細(xì)胞的G0/G1、S和G2/M期分別占45.94%、29.65%和24.41%，CENP-W siRNA組細(xì)胞的G0/G1、S和G2/M期分別占68.35%、18.46%和13.19%。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，CENP-W siRNA組的G0/G1期細(xì)胞比例增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖9。

Figure 9.The cell cycle distribution of the U87 cells after transfection with CENP-W siRNA analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.

圖9 流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染CENP-W siRNA后各組U87細(xì)胞周期的分布

10 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡

利用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染4 d后各組細(xì)胞的凋亡率，空白對(duì)照組的凋亡率為(6.52±1.69)%，陰性對(duì)照組的凋亡率為(7.09±1.98)%，CENP-W siRNA組的凋亡率為(12.43±2.79)%。CENP-W siRNA組的細(xì)胞凋亡率明顯升高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖10。

Figure 10.The apoptotic rate of the U87 cells after transfection of CENP-W siRNA analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCENP-W siRNA.

圖10 流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染CENP-W siRNA后各組U87細(xì)胞凋亡的比率

討 論

腦膠質(zhì)瘤特別是腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的預(yù)后極差，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的高度血管化的惡性腫瘤之一，患者中位生存期不超過12個(gè)月。傳統(tǒng)治療方法(包括手術(shù)、化療和放療)并沒有完全解決膠質(zhì)瘤侵襲性生長所導(dǎo)致的高復(fù)發(fā)率和低治愈率難題。針對(duì)與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因異常的治療已成為研究熱點(diǎn)[4]。

CENP-W主要分布于細(xì)胞核中，許多研究表明CENP-W在細(xì)胞有絲分裂過程中扮演關(guān)鍵作用[5-8]。阻斷CENP-W可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂過程中觀察到多極紡錘體和染色體錯(cuò)位等異常染色體結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，并誘導(dǎo)異常的有絲分裂來影響細(xì)胞的活性[9]。另外還有研究表明[10]CENP-W在細(xì)胞間期與核仁緊密聯(lián)系同時(shí)調(diào)節(jié)核仁與著絲粒蛋白前體之間的聯(lián)系，Hori等[5]研究表明CENP-W與CENP-T直接與核仁中的DNA及H3組蛋白連接。同時(shí)，CENP-W對(duì)于惡性腫瘤的生物學(xué)特性亦有著重要的調(diào)控作用。研究表明，CENP-W廣泛高表達(dá)于卵巢、肝臟、肺、結(jié)腸、胃、胰腺等多種癌癥組織中，并因此將其命名為腫瘤上調(diào)蛋白CUG2[11-12]。而在鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3的實(shí)驗(yàn)研究中顯示，CENP-W的過表達(dá)使NIH3T3細(xì)胞表現(xiàn)出腫瘤細(xì)胞的特性，并移植到裸鼠皮下后形成腫瘤，表現(xiàn)出CENP-W的顯著致癌活性。作為著絲粒結(jié)構(gòu)的組成部分，CENP-W的表達(dá)異常會(huì)干擾有絲分裂的正常進(jìn)行，而影響染色體DNA的正確分離，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)染色體異常。而這種染色體異常既可以易化腫瘤的形成，也可以引起細(xì)胞的凋亡，取決于其所處細(xì)胞環(huán)境及下游信號(hào)通路的反應(yīng)結(jié)果。

綜上所述，CENP-W對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要的作用。最新研究報(bào)道，發(fā)現(xiàn)CENP-W在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào)，且與RAS的表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)，且CENP-W在腦膠質(zhì)瘤中可調(diào)節(jié)RAS表達(dá)水平，表明CENP-W可能調(diào)控RAS信號(hào)通路影響腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，CENP-W與腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后密切相關(guān)[14]。故我們研究CENP-W對(duì)腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡等惡性生物學(xué)表型的作用，進(jìn)一步明確CENP-W對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的關(guān)系及作用機(jī)制。

將CENP-W siRNA轉(zhuǎn)染入腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中，經(jīng)RT-qPCR和Western blot法證實(shí)細(xì)胞中的CENP-W的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯受到抑制，表明轉(zhuǎn)染成功。行Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的侵襲、遷移能力較對(duì)照組明顯受抑制；行平板集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CENP-W siRNA組U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的集落形成能力明顯減弱；行MTT實(shí)驗(yàn)、BrdU實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染CENP-W siRNA的U87細(xì)胞的增殖能力較對(duì)照組明顯降低；通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期和凋亡情況的分析，抑制CENP-W的表達(dá)水平， G0/G1期的U87細(xì)胞數(shù)明顯增加，細(xì)胞增殖受限，表明CENP-W表達(dá)下降可以影響骨肉瘤細(xì)胞周期，而同時(shí)細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增多，凋亡率增高。綜上研究結(jié)果表明，抑制CENP-W的表達(dá)水平能夠有效抑制腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖與侵襲能力。

作為一種潛在的致癌蛋白，CENP-W對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展可能具有重要的影響。本研究首次探索了CENP-W對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，通過多種實(shí)驗(yàn)方法最終證實(shí)下調(diào)CENP-W的表達(dá)可抑制人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，提示CENP-W有望成為人腦膠質(zhì)瘤基因治療的候選靶點(diǎn)，其具體的作用機(jī)制及靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of CENP-W down-regulation on human glioma U87 cells

JI Qian-kun1, LI Jian-bin2, FAN Yang-hua3, XU Bin3, CHAI Yi3, JI Chen-xing3, ZHU Xin-gen3

(1DepartmentofNeurosurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege,Xinxiang453100,China;2DepartmentofNeurosurgery,TheSecondHospitalofNanchangCity,3DepartmentofNeurosurgery,TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:zxg2008vip@163.com)

AIM: To study the effect of centromere protein W (CENP-W) down-regulation on human glioma U87 cells. METHODS: Small interfering RNA (siRNA) was used to inhibit the expression of CENP-W in the U87 cells. The interference effect of siRNA was evaluated by RT-qPCR and Western blot. The proliferation of the cells was analyzed by MTT assay, BrdU staining and colony formation experiment. Transwell chamber assay was used to detect the invasion ability of the cells. The cell migration ability was measured by a scratch test. The changes of the cell cycle distribution and apoptosis were analyzed by flow cytometry. RESULTS: The results of MTT assay, colony formation experiment and BrdU staining showed that the cell proliferation and colony formation abilities in experimental group were significantly lower than those in control group and negative control group. The results of Transwell and scratch experiments showed that the migration and invasion abilities in experimental group were weaker than those in blank control group and negative control group. The results of flow cytometry analysis showed that the cell cycle distribution in experimental group was arrested in G0/G1phase. The percentage of apoptotic cells in experimental group was higher than that in control group (P<0.05). CONCLUSION: Down-regulation of CENP-W expression inhibits the proliferation, migration and invasion of human glioma cells and promotes the apoptosis of the cells, suggesting that CENP-W may be a potential target of gene therapy for human glioma.

Centromere protein W; Small interfering RNA; Cell proliferation; Cell invasion

1000- 4718(2017)02- 0263- 08

2016- 08- 31

2016- 11- 14

江西省優(yōu)勢科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃(No. 20152BCB24009)；江西省對(duì)外科技合作計(jì)劃(No. 20151BDH80009)

R739.41

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.012

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