CX3CR1基因多態(tài)性與糖尿病腎病炎癥介質的相關性

朱阿楠 方亞君 許 紅 王利峰 陳洪宇 俞艷雯

(余姚市中醫(yī)醫(yī)院內科，浙江 余姚 315400)

CX3CR1基因多態(tài)性與糖尿病腎病炎癥介質的相關性

朱阿楠 方亞君1許 紅1王利峰1陳洪宇2俞艷雯1

(余姚市中醫(yī)醫(yī)院內科，浙江 余姚 315400)

目的 探討趨化因子受體CX3CR1-V249I 、CX3CR1-T280M 基因多態(tài)性的與糖尿病腎病(DN)炎癥介質核因子(NF)-κB、Fractalkine(FKN)、白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子( TNF)-α的相關性。方法 應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性法檢測及反向測序法檢測80例DN患者(DN組)、119例糖尿病(DM組)患者和118例對照者(C組)的CX3CR1 基因T280M、V249I 多態(tài)性分布，ELISA法測定各組血清中NF-κB、FKN、IL-6、 TNF-α濃度。結果 等位基因V249I在C組中的分布頻率(20.33%)明顯高于DN組(17.23%)和DM組(8.75%)(P<0.05)；等位基因T280M在各組中分布頻率無明顯差異(P>0.05)。DN組及DM組中V249I、T280M變異型患者血清中FKN濃度較野生型明顯增加(P<0.05)；DN組及DM組中V249I、T280M 變異型患者血清中NF-κB濃度較野生型明顯減少(P<0.05)；DM組中突變型患者血清TNF-α濃度較野生型明顯減少(P<0.05)；DN組T280M突變型患者血清IL-6濃度較野生型濃度明顯增多(P<0.05)。結論 CX3CR1-V249I突變可能減少了DN的發(fā)生，炎癥因子NF-κB、FKN、 TNF-α可能參與了此過程；而CX3CR1-T280M基因多態(tài)性和DN發(fā)生無明顯關聯，但IL-6加速DN的發(fā)生可能和T280M突變有關。

趨化因子受體；V249I；T280M；基因多態(tài)性；糖尿病腎病；炎癥介質

糖尿病腎病(DN)是由于血糖持續(xù)升高、腎小球血流動力學改變等多種因素共同作用引起的一種以腎小球硬化為主的腎臟病變。研究證實炎癥介質在DN 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔1，2〕。本研究分析了糖尿病(DM)患者、DN患者和對照組人群中CX3CR1兩個基因多態(tài)位點的多態(tài)性分布情況及其炎癥介質的濃度變化。

1 資料與方法

1.1 一般資料 經過醫(yī)院倫理委員會通過，選取2009年1月至2013年12月我院門診及住院DM患者199例，所有患者知情同意并簽署知情同意書，診斷符合1999 年WHO糖尿病診斷及分型標準。其中DN組80例，尿白蛋白排出率(UAER)>200 μg/min；DM組119例，DM組所有患者腎小球濾過率(GFR)正常，且運動后UAER<20 μg/min。DN組男53例，女27例；平均年齡(62.23 ± 10.11)歲；糖尿病病程(11± 3.02)年。DM組男69例，女 50例；平均年齡(58.91 ± 9.18)歲；糖尿病病程(10± 2.18)年。同時選取正常對照組(C組)：我院同期門診健康體檢者118例，男67例，女51例；平均年齡(59.93±10.08)歲，體檢正常，排除糖尿病及其他腎臟疾病、血管病變等。各組在年齡和性別及病程差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性法檢測 采取外周血全血提取基因組DNA，采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性法進行引物設計、酶切、電泳，得出電泳圖。(MX3005P 定量PCR儀，上海智巖科學儀器有限公司)。

1.3 DNA序列分析 分別選取CX3CR1 的T280M基因位點純合子野生型、純合子突變型、雜合子標本，經純化后進行反向測序驗證，測序由杭州艾迪康生物有限公司完成，測序結果在SNP數據庫中進行分析比較。

1.4 各組血清Fractalkine(FKN)、核因子(NF)-κB、白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α濃度測定 常規(guī)空腹采肘部靜脈血，采用ELISA法(ELx800TM通用酶標儀，上海澤權儀器設備有限公司)測定各組血清 FKN(試劑為美國Cytolab公司)、NF-κB(試劑為美國Cytolab公司)、IL-6(試劑為上海森雄科技實業(yè)有限公司)、TNF-α(試劑為美國Cytolab公司)濃度。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件包進行χ2和t檢驗。采用Logistic 回歸分析比較基因型與DN的相關性，其關聯性用比值比(OR)和95%可信度(95%CI)表示。

2 結 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡 對DM組、DN組與C組的CX3CR1基因多態(tài)性進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，三組之間不存在顯著差異(P=0.6231)，說明群體基因遺傳平衡來自同一孟德爾群體。

2.2 CX3CR1基因V249I、T280M酶切結果 限制性片段V249I瓊脂糖凝膠電泳結果：目的產物經AclⅠ酶切后，出現1條條帶295 bp，為突變型純合子II型；出現2條條帶104 bp和191 bp，為野生型純合子VV型；出現3條條帶104 bp、191 bp和295 bp，為雜合子VI型。限制性片段T280M瓊脂糖凝膠電泳結果：目的產物經HpyCH4Ⅲ酶切和瓊脂糖凝膠電泳后出現1 條295 bp條帶，為突變型純合子MM型；96 bp和199 bp條帶，為野生型純合子TT型；96 bp、199 bp、295 bp條帶，為雜合子TM型。見圖1、圖2。

2.3 兩組CX3CR1基因T280M、V249I頻率比較 各組CX3CR1-V249I均有3種基因型，即VV型、VI型、II型，均以VV型為主；DN組和DM組、DN組和C組V249I的基因型頻率差異顯著(P值分別為0.004，0.032)。DM組和C組V249I的基因型頻率無統(tǒng)計學差異(P>0.05，基因型比較：χ2=0.771，P=0.680；等位基因比較：χ2=0.753，P=0.386)。DN組和C組CX3CR1-T280M有兩種基因型：TT型、TM型；DM組三種基因型：TT型、TM型、MM型，各組均以MM型為主，等位基因頻率和基因型頻率在各組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。多因素Logistic回歸分析顯示：V249I多態(tài)性與DN發(fā)生負關聯，VI和II基因型在非DN患者中的分布明顯增多，并獨立于DN其余危險因素，其差異有統(tǒng)計學意義(P=0.009；OR=0.827，95%CI：0.698～0.981)。

2.4 各組V249I不同基因型患者血清炎癥介質濃度比較 DN組及DM組中突變型(V+II)FKN濃度較野生型(VV)濃度明顯增加(P<0.05)；DN組及DM組中突變型NF-κB濃度較VV基因型濃度明顯減少(P<0.05)；DM組中突變型TNF-α濃度較VV基因型濃度明顯減少(P<0.05)，C組中各種炎癥介質濃度在突變型和野生型之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1和表2。

圖1 CX3CR1基因V249I酶切電泳結果

2.5 各組T280M不同基因型患者血清中炎癥介質濃度比較 表3、表4可見，各組中TM + MM基因型(突變型)患者血清FKN濃度較TT基因型(野生型)均明顯增加(P<0.05)；DN組及DM組中突變型患者血清NF-κB濃度較野生型明顯減少；DN組突變型患者血清IL-6濃度較野生型明顯增多(P<0.05)；

圖2 CX3CR1基因T280M酶切電泳結果表1 各組CX3CR1 基因V249I 頻率比較〔n(%)〕

組別n基因型VVVIIIχ2值P值等位基因頻率(%)VIχ2值P值DN組8068(85.0)1)2)10(12.5)1)2)2(2.5)1)2)11.0771)0.0041)91.251)2)8.751)2)9.6981)0.0021)DM組11982(73.21)33(22.32)4(4.46)6.8972)0.0322)82.7717.235.7732)0.0162)C組11875(68.18)38(28.18)5(3.64)79.6620.33

與C組比較：1)P<0.05；與DM組比較：2)P<0.05

表2 各組CX3CR1 基因T280M 頻率比較〔n(%)〕

表3 V249I不同基因型患者血清中炎癥遞質及細胞因子濃度比較±s)

表4 各組T280M不同基因型患者血清中炎癥遞質及細胞因子濃度比較±s)

DM組中突變型患者血清TNF-α濃度較野生型明顯減少(P<0.05)，C組中NF-κB、IL-6、TNF-α濃度在突變型和野生型之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

3 討 論

Tuttle〔3〕認為 DN 是一種炎癥性疾病，Fornoni等〔4〕試驗證明：免疫炎癥反應細胞、細胞因子、急性期反應蛋白及凝血因子等炎癥反應因子在糖尿病腎損害中發(fā)揮重要作用。Park等〔5〕研究發(fā)現Fractalkine /CX3CR1參與介導了腎臟的發(fā)生發(fā)展過程。近年發(fā)現CX3CR1 基因中存在V249I、T280M 堿基突變，這種遺傳變異對CX3CR1和FKN的親和力產生明顯影響，從而影響炎癥過程中白細胞的游走、黏附和聚集，并可能影響 DN 的遺傳易感性〔6〕。

本研究顯示CX3CR1基因的 249I 等位基因與DN發(fā)生的危險性下降明顯相關，獨立于DN其他危險因素；T280M基因多態(tài)性和DN無明顯關聯。FKN/CX3CR1 通過參與白細胞特別是吞噬細胞和淋巴細胞的游走和活化、介導細胞間黏附等作用在許多炎癥反應中發(fā)揮重要作用〔7〕。研究發(fā)現小鼠系膜細胞的增殖受FKN/CX3CR1的影響，FKN劑量越大，系膜細胞增殖越明顯〔8〕。在體外培養(yǎng)的小鼠腎小管上皮細胞、系膜細胞，發(fā)現促炎癥因子IL-1β、TNF-α是FKN 的主要誘導物，TNF-α的表達水平與慢性腎疾病風險率呈正相關，可作為預測DN病情變化的指標〔9〕。TNF高表達可通過誘導腎小球血管表達ICAM-1、誘導氧自由基產生、刺激腎小球系膜細胞合成IL-1、MCP-1等途徑參與DN的發(fā)生發(fā)展〔10〕。FKN/CX3CR1 的表達也依賴于NF-κB信號通路，NF-κB 活化后可以進入細胞核內與TNF-α 啟動子的κB 序列結合，使TNF-α 的釋放增加〔6〕，且兩者之間還存在著正反饋作用。可見FKN/CX3CR1與DN發(fā)生發(fā)展有關，這一過程又受TNF-α、NF-κB等炎癥因子的影響〔10〕。

本研究發(fā)現，DN組CX3CR1基因249I等位基因的變異較DM組及C組明顯減少。其潛在的可能機制為DN患者V249I等位基因變異降低，相對而言導致了CX3CR1表達增加，同時DN患者血清中FKN濃度增加，FKN-CX3CR1系統(tǒng)激活，單核細胞表達NF-κB和TNF-α增加，腎血管內皮細胞和系膜細胞的損傷，促進了DN的發(fā)生發(fā)展。McDermott等〔11〕在其研究中也發(fā)現外周CX3CR1受體非正常的表達，使表達CX3CR1受體的細胞對內皮細胞上膜結合型FKN的趨化和黏附能力均顯著下降，從而減輕了內皮細胞的損傷。本研究說明V249I變異型對FKN的趨化活性下降，與FKN的結合率也降低，炎癥因子NF-κB、TNF-α濃度降低，減輕了DN 的發(fā)生發(fā)展。但是DN組中VI+II基因型TNF-α濃度較VV基因型濃度減少無統(tǒng)計學意義，也可能其他途徑參與調節(jié)TNF-α的生成。T280M基因多態(tài)性和DN無明顯關聯，但V280M變異型和V249I變異型中炎癥因子TNF-α、NF-κB、FKN的濃度高度一致，其原因為本研究樣本中T280M基因大多和V249I突變同時發(fā)生。在McDermott等〔11〕研究也發(fā)現：CX3CR1-M280經常與CX3CR1-I249同時存在，但是與后者相比，兩者在冠狀動脈疾病發(fā)生率的下降方面作用卻不相同。

研究發(fā)現〔12〕，DM患者血清IL-6可明顯升高，且和尿蛋白濃度正相關。IL-6 的升高可顯著削弱胰島β 細胞的功能，引起胰島素分泌功能障礙、胰島素抵抗和代謝綜合征的發(fā)生，最終導致DM進展為DN。而且升高的 IL-6與腎小球系膜細胞上的IL-6受體結合，刺激腎小球系膜的增殖和細胞外基質的產生，使腎小球濾過膜增厚。本研究顯示各組V249I不同基因型患者血清中IL-6的濃度無顯著差異；但T280M不同基因型中，DN組突變型患者血清IL-6濃度較野生型明顯增多，說明IL-6濃度變化與V249I、T280M兩個位點的突變情況并不一致，DN組T280M位點的突變與IL-6濃度的增加有一定相關性，目前相關機制尚不清楚，DN患者中IL-6濃度的增加與FKN-CX3CR1 系統(tǒng)關系尚需進一步研究。

本研究發(fā)現CX3CR1 的V249I多態(tài)位點突變和DN發(fā)生發(fā)展顯著相關，T280M基因多態(tài)性和DN無明顯關聯，V249I等位基因突變可能對DM患者腎臟病變起著保護作用。CX3CR1多態(tài)性有可能通過影響腎臟的炎癥過程而參與DN的發(fā)生發(fā)展。要更深入了解CX3CR1多態(tài)性與DN的關系，尚需大樣本、多臨床中心的進一步研究。

1 謝紹鋒，黃莉吉，趙 越，等.血清 Fractalkine 和超敏 C 反應蛋白與早期 2 型糖尿病腎病的相關性研究〔J〕.中國全科醫(yī)學，2013；3(16)：987-90.

2 Yamagishi S，Matsui T，Nakamura K，etal.Olmesartan blocks inflammatory reactions in endothelial cells evoked by advanced gyrations end products by suppressing generation of reactive oxygen species〔J〕.Ophthalmic Res，2008；40(1)：10-5.

3 Tuttle KR.Metabolism and immunology：diabetic nephropathy is an inflammatory disease〔J〕.J Am Soc Nephrol，2005；16(6)：1537-8.

4 Fornoni A，Ijaz AJ，Tejada T，etal.Role of inflammation in diabetic nephropathy〔J〕.Curr Diabetes Rev，2008;4(1)：10-7.

5 Park J，Song KH，Ha H.Lipopolysaccharide increases monocyte binding to mesangial cells through fractalkine and its receptor〔J〕.Transplant Proc，2012;44(4)：1029-31.

6 Donadelli R，Zanchi C，Morigi M，etal.Protein overload induces fractalkine upregulation in proximal tubular cells through nuclear factor kappa B-and p38 mitogen-activated protein kinasedependent pathways〔J〕.J Am Soc Nephrol，2003;14(10)：2436-46.

7 Escher F，Vetter R，Kühl U，etal.Fractalkine in human inflammatory cardiomyopathy〔J〕.Heart，2011;97(9)：733-9.

8 Park J，Song KH，Ha H.Fractalkine increases mesangial cell proliferation through reactive oxygen species and mitogen-activatedprotein kinases〔J〕.Transplant Proc，2012;44(4)：1026-8.

9 Yeo ES,Hwang JR，Park JE,etal.Tumor necrosis factor(TNF-alpha)and C reactive protein(CRP)are positively associated with the risk of chronic kidney disease in patients with type 2 diabetes〔J〕.Yonsei Med,2010;51(4)：519-25.

10 Tsiotra PCJ,Tsigos C，Yfanti E，etal.Visfatin，TNF-alpha and IL-6 mRNA expression is increased in mononuclear cells from type 2 diabetic women〔J〕.Horm Metab Res J,2007;39(10)：758-63.

11 McDermott DH，Fong AM，Yang Q，etal.Chemokine receptor mutant CX3CRI-M280 has impaired adhesive function and correlates with protection from cardiovascular disease in humans〔J〕.J Clin Invest,2003；1(11)：1241-50.

12 何 煜，張 琰，廖婷婷，等.老年早期糖尿病腎病患者血清胱抑素C與氧化應激的相關性〔J〕.中國老年學雜志，2014；34(2)：594-6.

〔2015-08-19修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

余姚市科技計劃項目(No.2009Y11)

朱阿楠(1975-)，女，醫(yī)學碩士，主治醫(yī)師，主要從事內分泌學研究。

R318.16

A

1005-9202(2017)03-0616-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.040

1 余姚市中醫(yī)醫(yī)院腎內科 2 杭州市中醫(yī)院腎內科