白花蛇舌草對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡及Ki-67表達(dá)的影響

文雪梅 陳 瑛 李 婷 宋雪妮 王 妮

(西藏民族大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 咸陽 712082)

白花蛇舌草對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡及Ki-67表達(dá)的影響

文雪梅 陳 瑛1李 婷2宋雪妮3王 妮3

(西藏民族大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 咸陽 712082)

目的 探討白花蛇舌草對(duì)Hela細(xì)胞增殖、凋亡及Ki-67表達(dá)的影響。方法 運(yùn)用動(dòng)物血清學(xué)方法制備白花蛇舌草藥物血清，MTT檢測(cè)白花蛇舌草血清濃度為10%、20%、40%，作用時(shí)間為24、48、72 h后的Hela細(xì)胞的存活率，并計(jì)算藥物的抑制率。原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)白花蛇舌草血清濃度為10%、20%、40%，作用時(shí)間為24、48、72 h后的Hela細(xì)胞的凋亡率，進(jìn)一步驗(yàn)證白花蛇舌草抑制宮頸癌細(xì)胞增殖是否與促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。RT-PCR檢測(cè)白花蛇舌草血清濃度為10%、20%、40%，作用時(shí)間為24、48、72 h后的Hela細(xì)胞中Ki-67 mRNA水平。免疫組化檢測(cè)白花蛇舌草血清濃度為10%、20%、40%，作用時(shí)間為24、48、72 h后的Hela細(xì)胞中抗原Ki-67的表達(dá)情況。結(jié)果 白花蛇舌草藥物血清作用后的Hela細(xì)胞與對(duì)照組相比細(xì)胞生長(zhǎng)增殖明顯受到抑制，隨著藥物作用濃度和藥物作用時(shí)間的增加，Hela細(xì)胞抑制率也明顯增加。TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示，白花蛇舌草藥物血清作用后的Hela細(xì)胞凋亡率比對(duì)照組增多，藥物作用濃度越高，凋亡率也越高；藥物作用時(shí)間越長(zhǎng)，凋亡率越高。RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，白花蛇舌草藥物血清作用后的Hela細(xì)胞中Ki-67 mRNA的表達(dá)量隨著作用時(shí)間和作用濃度的增加而減小。免疫組化結(jié)果顯示，白花蛇舌草藥物血清作用后的Hela細(xì)胞中抗原Ki-67的表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯降低。白花蛇舌草藥物血清可以明顯降低Hela細(xì)胞中Ki-67的表達(dá)。結(jié)論 白花蛇舌草對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela的增殖具有抑制作用，可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制Ki-67基因表達(dá)。

白花蛇舌草；宮頸癌；增殖；凋亡

手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)療法是目前常用的治療宮頸癌的方法，但這些治療方法效果具有局限性，預(yù)后差〔1〕。白花蛇舌草是一種我國(guó)傳統(tǒng)的中草藥，具有抗腫瘤作用〔2〕，在臨床上已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，多用于治療支氣管癌、直腸癌、淋巴癌、鼻咽癌等。但目前對(duì)白花蛇舌草抗宮頸癌的作用機(jī)制尚未研究。Ki-67基因表達(dá)與癌細(xì)胞增殖有密切關(guān)系，在癌細(xì)胞增殖分化過程中具有重要意義，編碼的Ki-67蛋白是癌細(xì)胞增殖過程中必需的一種DNA結(jié)合蛋白〔3〕。本研究利用動(dòng)物血清學(xué)原理制備了白花蛇舌草藥物血清，與宮頸癌Hela細(xì)胞作用后，觀察細(xì)胞增殖分化及凋亡情況，并分析Ki-67 mRNA水平，初步探討白花蛇舌草對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖分化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 Hela細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)室保存，成年雌性SD大鼠20只購(gòu)于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，鼠齡為90日齡，體重260～290 g。主要儀器和試劑：酶標(biāo)儀(美國(guó)sigma)，水浴鍋(蘇州精密儀器公司)，CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，PCR儀(美國(guó)PE)，倒置顯微鏡(日本尼康)，離心機(jī)(上海醫(yī)用設(shè)備廠)，RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Sigma)，PBS(鼎國(guó)生物試劑有限公司)，胎牛血清(FBS)(杭州四季青有限公司)，MTT(碧云天生物技術(shù)有限公司)，青鏈霉素(美國(guó)Sigma)，胰蛋白酶(美國(guó)Sigma)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)，細(xì)胞RNA提取試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)，TUNEL試劑盒(北京中山生物科技有限公司)，二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)Sigma)，Ki-67單克隆抗體(北京中山生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hela細(xì)胞用含有10% FBS的RPMI1640細(xì)胞生長(zhǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞傳代用0.125%的胰蛋白酶消化。

1.2.2 制備白花蛇舌草血清 取300 g白花蛇舌草加入1 000 ml水中，小火煎制2 h，棄渣后濃縮為300 ml，配制成白花蛇舌草的灌胃水。每天給予20只成年雌性大鼠2次灌胃，每次4 ml，持續(xù)給藥3 d。第3天給藥后1 h用乙醚麻醉大鼠，在大鼠腹主動(dòng)脈處采血，1 500 r/min離心10 min，分離的血清滅活后分別稀釋含藥血清倍數(shù)為10、5、2.5倍，制成濃度10%、20%、40%的白花蛇舌草血清，分裝，保存于4℃冰箱備用。

1.2.3 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)Hela細(xì)胞增殖 取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宮頸癌Hela細(xì)胞，棄去細(xì)胞生長(zhǎng)液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞后，1 000 r/min離心10 min，棄酶消化液，加PBS重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，在顯微鏡下調(diào)整細(xì)胞濃度為6×104個(gè)/ml，取混合均勻的細(xì)胞懸浮液100 μl接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃，培養(yǎng)時(shí)間大約為24 h，觀察細(xì)胞貼壁后，分別在細(xì)胞中加入白花蛇舌草血清。實(shí)驗(yàn)組中加入終濃度為10%、20%、40%的白花蛇舌草血清培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為24、48、72 h。為了減小誤差，每組設(shè)置8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組和空白組，陰性對(duì)照組中不加含藥血清，只加入等量的細(xì)胞生長(zhǎng)液；空白組中無細(xì)胞加入等量的含藥血清。含藥血清作用時(shí)間結(jié)束后，在細(xì)胞中加入體積20 μl、濃度5 mg/ml的MTT溶液，置于37℃反應(yīng)4 h，棄含藥培養(yǎng)基后，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶液，避光條件孵育充分反應(yīng)10 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)492 nm處各孔的吸光度(OD值)，計(jì)算每組Hela細(xì)胞抑制率。

存活率=100%×(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(陰性對(duì)照組OD值-空白組OD值)。抑制率=1-細(xì)胞存活率。

1.2.4 原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 終濃度為10%、20%、40%的白花蛇舌草血清與Hela細(xì)胞作用24、48、72 h后，用濃度為4%的多聚甲醛在室溫下固定細(xì)胞30 min，吸除上清，加入適量的PBS洗滌細(xì)胞3次，每次3 min，加入3%的H2O2甲醇阻斷劑，孵育30 min，阻斷內(nèi)源性氧化物酶，PBS洗片。加入含有0.1%TritonX-100的枸櫞酸鈉溶液作為通透液，放置于冰盒中孵育2 min，小心吸除液體，加入轉(zhuǎn)化劑POD 50 μl，蓋上蓋玻片，37℃于濕盒中反應(yīng)30 min，洗片。加入100 μl顯色劑二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，在室溫下結(jié)合反應(yīng)15 min，酒精脫水后用二甲苯透明封片。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。顯微鏡下觀察細(xì)胞核為棕紅色為陽性，計(jì)算凋亡率。凋亡率的計(jì)算方法：胞核為紅棕色的細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞的數(shù)量百分比。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)藥物作用細(xì)胞后Ki-67 mRNA水平 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞經(jīng)終濃度為10%、20%、40%的白花蛇舌草血清培養(yǎng)基作用24、48、72 h后，棄去含藥培養(yǎng)基，放置于冰上，加入300 μl冰預(yù)冷的勻漿液變性，移液槍緩慢吹打細(xì)胞，觀察細(xì)胞裂解后，轉(zhuǎn)移至EP管中，加入2 mol/L的pH4.0的醋酸鈉溶液60 μl，上下顛倒EP管5次混勻，再加入600 μl的氯仿和酚的混合液，上下顛倒EP管5次混勻，在振蕩器上震蕩15 s。放置于4℃孵育15 min，4℃，14 000 r/min離心20 min。吸取水相層至新EP管中，加入與水相層相等體積的異丙醇，上下顛倒EP管5次混勻，置于-30℃靜置60 min。4℃，14 000 r/min，離心15 min，棄上清，在RNA沉淀中加入500 μl 冰預(yù)冷的80%乙醇混勻，置于-30℃、靜置60 min。4℃，14 000 r/min離心15 min，棄上清，將EP管放置于超凈工作臺(tái)中晾干，加入RNase-free 水溶解保存。提取的RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書反轉(zhuǎn)錄合成Ki-67 mRNA的cDNA。觀察分析細(xì)胞中Ki-67水平 。

1.2.6 藥物作用后Hela細(xì)胞Ki-67抗原檢測(cè) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞經(jīng)終濃度為10%、20%、40%的白花蛇舌草血清培養(yǎng)基作用24、48、72 h后，棄含藥培養(yǎng)基，加入PBS洗滌3次，每次3 min。放置于室溫下30 min，待風(fēng)干后，加入4%多聚甲醛固定30 min，空氣中干燥5 min，PBS洗滌3次，每次3 min，加入0.5% Triton X-100孵育15 min，洗片，加入封閉血清孵育20 min。Ki-67抗體用抗體稀釋液以1∶100稀釋后，加入封閉后的細(xì)胞爬片中，37℃反應(yīng)60 min，PBS洗片。加入ploymer Helper放置于37℃中孵育20 min，PBS洗片。加入poly peroxicase-anti-rabbit IgG后37℃反應(yīng)30 min，PBS洗片，加入DAB顯色，置于顯微鏡下觀察至棕色，5 min后自來水洗，分別用75%、85%、95%的酒精脫水，每個(gè)濃度梯度3 min。二甲苯透明2次，每次3 min，中性樹膠封片。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組中不加Ki-67抗體，加等量的PBS液。計(jì)算細(xì)胞核呈棕紅色的細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值為抗原表達(dá)率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 MTT檢測(cè)藥物作用后細(xì)胞抑制情況 10%、20%、40%白花蛇舌草血清作用后的Hela細(xì)胞抑制率與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。相同藥物濃度，藥物作用時(shí)間為72 h的Hela細(xì)胞與作用時(shí)間48 h相比差異顯著(P<0.05)；相同藥物濃度，藥物作用時(shí)間為48 h的Hela細(xì)胞與作用時(shí)間24 h相比差異不顯著(P>0.05)。隨著藥物濃度的增加，抑制率呈上升趨勢(shì)；隨著作用時(shí)間的增加，抑制率逐漸上升。見表1。

表1 MTT法檢測(cè)白花蛇舌草血清作用后的Hela 細(xì)胞抑制率

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與48 h比較：2)P<0.05；表2同

2.2 TUNEL檢測(cè)白花蛇舌草藥物血清作用后Hela細(xì)胞凋亡情況 白花蛇舌草血清作用后的Hela細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。相同作用濃度的白花蛇舌草血清作用72 h后Hela細(xì)胞凋亡率較作用時(shí)間為48 h的凋亡率差異顯著(P<0.05)；隨著作用時(shí)間的增加，藥物作用后的Hela細(xì)胞凋亡率也明顯增加；隨著作用濃度的增加，藥物作用后的Hela細(xì)胞凋亡率顯著增加。說明白花蛇舌草血清通過促進(jìn)Hela細(xì)胞凋亡而抑制細(xì)胞增殖。見表2。

表2 TUNEL法檢測(cè)白花蛇舌草血清 作用后的Hela細(xì)胞凋亡率

2.3 RT-PCR檢測(cè)白花蛇舌草作用后Hela細(xì)胞中Ki-67 mRNA水平 白花蛇舌草血清作用后的Hela細(xì)胞中Ki-67水平與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。40%的白花蛇舌草血清作用時(shí)間為72 h組比作用時(shí)間為48 h組Hela細(xì)胞中Ki-67水平降低很多(P<0.05)；40%的白花蛇舌草血清作用時(shí)間為48 h組比作用時(shí)間為24 h組Hela細(xì)胞中Ki-67水平降低很多(P<0.05)。20%的白花蛇舌草血清作用時(shí)間為72 h組比作用時(shí)間為48 h組Hela細(xì)胞中Ki-67水平降低很多(P<0.05)；20%的白花蛇舌草血清作用時(shí)間48 h比作用時(shí)間為24 h的Hela細(xì)胞中Ki-67水平降低很多(P<0.05)。10%的白花蛇舌草血清作用時(shí)間72 h組比作用時(shí)間為48 h組Hela細(xì)胞中Ki-67水平降低很多(P<0.05)；10%的白花蛇舌草血清作用時(shí)間48 h組比作用時(shí)間為24 h組Hela細(xì)胞中Ki-67水平降低很多(P<0.05)。藥物作用后的Hela細(xì)胞中Ki-67 mRNA水平隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加而減小。見表3。

2.4 免疫組化檢測(cè)白花蛇舌草血清作用后的Hela細(xì)胞Ki-67的表達(dá)情況 白花蛇舌草血清作用后的Hela細(xì)胞與對(duì)照組相比Ki-67抗原表達(dá)量受到明顯抑制作用(P<0.05)。10%白花蛇舌草血清作用24、48、72 h后抗原Ki-67的表達(dá)率依次為0.612 3±0.060 1，0.547 8±0.045 1，0.507 9±0.042 1。20%白花蛇舌草血清作用24、48、72 h后抗原Ki-67的表達(dá)率依次為0.534 6±0.051 1，0.471 6±0.041 2，0.426 8±0.040 2。40%白花蛇舌草血清作用24、48、72 h后抗原Ki-67的表達(dá)率依次為0.442 6±0.041 2，0.390 6±0.035 1，0.325 0±0.029 1。對(duì)照組中作用時(shí)間為24、48、72 h后抗原Ki-67的表達(dá)率依次為0.792 4±0.07，0.801 7±0.082 0，0.785 9±0.074 1。白花蛇舌草血清藥物濃度越高，Hela細(xì)胞抗原Ki-67表達(dá)量越小，藥物作用時(shí)間越長(zhǎng)，Hela細(xì)胞抗原Ki-67表達(dá)量越小。這與RT-PCR檢測(cè)的Ki-67 mRNA表達(dá)結(jié)果一致，說明白花蛇舌草血清可以減少Ki-67的表達(dá)。

表3 RT-PCR檢測(cè)白花蛇舌草作用后的細(xì)胞中 Ki-67表達(dá)率

與相同作用時(shí)間對(duì)照組比較：1)P<0.05；與相同作用濃度作用時(shí)間24 h比較：2)P<0.05

3 討 論

宮頸癌是一種常見的惡性腫瘤，我國(guó)每年宮頸癌死亡人數(shù)在全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的第四位。宮頸癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中僅次于乳腺癌。在農(nóng)村的發(fā)病率明顯高于城市，發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率高于發(fā)達(dá)國(guó)家〔4〕。30～40歲年齡階段的女性是宮頸癌高發(fā)人群，20歲以下宮頸癌發(fā)病率較少〔5〕。白花蛇舌草屬于茜草科植物，廣泛生長(zhǎng)于亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)主要分布在長(zhǎng)江以南地區(qū)，具有抗腫瘤、消炎、滅菌、增加免疫力等多種功效〔6〕。白花蛇舌草的抗腫瘤作用在食道癌、淋巴癌、直腸癌、胃癌中已經(jīng)得以證實(shí)。研究表明白花蛇舌草具有抑制癌細(xì)胞增殖分化、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)等多種作用〔7〕。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞正常情況下的一種程序性死亡，在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起到重要作用。細(xì)胞凋亡是一系列復(fù)雜的過程，受多種相關(guān)因子和蛋白的多重調(diào)控作用。基因Bcl-2、Bax、p53等在細(xì)胞的凋亡過程中起重要作用。Bcl-2是一種抑癌基因，在細(xì)胞凋亡過程中具有抗凋亡的作用；而Bax、p53基因在細(xì)胞凋亡過程中起到促進(jìn)作用。細(xì)胞凋亡過程中，鈣離子濃度的改變與凋亡信號(hào)傳遞有關(guān)〔8〕。白花蛇舌草可以顯著提高癌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，增加細(xì)胞內(nèi)游離鈣的濃度，從而發(fā)揮抑癌作用。

本研究通過TUNEL〔9〕檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，白花蛇舌草血清作用后的Hela細(xì)胞凋亡率明顯增高，且隨著作用濃度的增加和作用時(shí)間的增加，凋亡率增加。白花蛇舌草可以促進(jìn)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡。

Ki-67增多標(biāo)志著細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，是臨床上常用的一種評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖的指標(biāo)。Ki-67表達(dá)增多表示癌細(xì)胞增長(zhǎng)分化處于活躍狀態(tài)。Ki-67蛋白是一種擁有200多個(gè)的磷酸化的部位的非組蛋白，很容易受到相關(guān)蛋白酶的作用，這為提取和分離該蛋白帶來了困難。Ki-67半衰期短，擁有3個(gè)酰肽化部位，19個(gè)豆蔻?；瘏^(qū)域和50個(gè)富含谷氨酸、蘇氨酸、脯氨酸的部位〔10〕。Ki-67蛋白是由兩個(gè)大小分別約為8 000 bp和9 000 bp的相關(guān)mRNA編碼的蛋白質(zhì)。Ki-67的cDNA由15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子組成。研究表明，細(xì)胞中Ki-67不表達(dá)的時(shí)候，細(xì)胞周期循環(huán)不受影響，說明Ki-67不是細(xì)胞增殖必需的。已經(jīng)有研究表明，Ki-67可以作為膀胱癌患者中診斷腫瘤分級(jí)的一個(gè)重要指標(biāo)，Ki-67可以作為早期前列腺癌和前列腺增生的診斷依據(jù)，另外Ki-67可以作為診斷大腸腫瘤良性還是惡性的指標(biāo)〔11〕。本研究通過RT-PCR檢測(cè)藥物作用后的Hela細(xì)胞中Ki-67 mRNA的表達(dá)情況，藥物作用后的Hela細(xì)胞中Ki-67 mRNA的表達(dá)受到抑制。免疫組化結(jié)果顯示，藥物作用后的Hela細(xì)胞中Ki-67抗原表達(dá)降低，說明白花蛇舌草抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖與Ki-67有關(guān)。

綜上所述，白花蛇舌草可以抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制機(jī)制與Ki-67的表達(dá)有關(guān)。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)觀察白花蛇舌草的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究白花蛇舌草在宮頸癌治療和診斷中的價(jià)值提供了理論依據(jù)。

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11 史漢蒙,司君利,崔偉麗.大腸癌組織中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)與MMP-2、Ki-67表達(dá)的相關(guān)性研究〔J〕.中國(guó)現(xiàn)代普通外科進(jìn)展,2015;18(2):94-8.

〔2016-04-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

文雪梅(1966-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科疾病研究。

R739.5

A

1005-9202(2017)03-0561-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.016

1 武警西藏總隊(duì)醫(yī)院婦產(chǎn)科

2 信陽市中心醫(yī)院

3 西藏民族大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科