高濃度彈力蛋白酶不同灌注保持時間對建立兔腹主動脈瘤模型的影響

聶毛曉 趙全明 閆云峰 李昕和 馮婷婷 趙欣 張明多

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100029)

高濃度彈力蛋白酶不同灌注保持時間對建立兔腹主動脈瘤模型的影響

聶毛曉 趙全明 閆云峰 李昕和 馮婷婷 趙欣 張明多

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100029)

目的 通過經(jīng)腹主動脈腔內(nèi)灌注高濃度彈力蛋白酶建立兔腹主動脈瘤(AAA)模型，觀察不同灌注保持時間對兔AAA成瘤率及死亡率的影響。方法 24只新西蘭雄兔隨機(jī)分為A組、B組、C組各8只，每組均經(jīng)雙腔導(dǎo)管注入10 μl、濃度為100 U/ml的彈力蛋白酶，灌注保持時間A組3～5 min，B組7～10 min，C組20～30 min；后用生理鹽水沖洗管腔3次；分別于術(shù)前及術(shù)后第7天行腹主動脈彩超檢查，術(shù)后第7天處死動物，行組織學(xué)病理染色觀察血管灌注部位組織學(xué)變化。結(jié)果 A組存活8只，灌注局部血管擴(kuò)張率40.3%～63.1%，其中5只擴(kuò)張率大于50%，達(dá)到AAA成瘤標(biāo)準(zhǔn)，成瘤率62.5%，術(shù)后7 d存活率100%；B組存活8只，局部血管擴(kuò)張率87.5%～109.2%，均達(dá)到成瘤標(biāo)準(zhǔn)，成瘤率100%，術(shù)后7 d存活率100%；C組存活3只，灌注局部血管擴(kuò)張率237.7%～252.0%，成瘤率100%，術(shù)后7 d存活率為37.5%。結(jié)論 高濃度彈力蛋白酶制作兔AAA模型，灌注時間保持7～10 min具有成瘤率高、死亡率低、操作簡易等優(yōu)點，易于推廣。

腹主動脈瘤；彈力蛋白酶

腹主動脈瘤(AAA)的發(fā)病原因和機(jī)制尚不完全清楚，制作AAA動物模型對于研究人類AAA的發(fā)病機(jī)制、病理生理進(jìn)程以及早期防治均具有非常重要的作用。目前，彈力蛋白酶腔內(nèi)灌注法已成為制作AAA模型最常用的方法，不同文獻(xiàn)顯示，在制作不同種類動物AAA模型過程中，彈力蛋白酶灌注時間3～30 min不等〔1～3〕，模型制作的成功率也有較大差異。本文采用高濃度(100 U/ml)彈力蛋白酶灌注，分組討論不同灌注時間對兔AAA成瘤率及死亡率的影響，進(jìn)而篩選出制造兔AAA模型的最適宜灌注時間。

1 材料與方法

1.1 材料 健康新西蘭雄兔24只〔北京市海淀區(qū)興旺動物養(yǎng)殖場，許可證號：SCXK(京)2006-0006〕，體重(2.50±0.20)kg，自由攝食和進(jìn)水，室溫23℃～25℃，獨籠飼養(yǎng)。豬胰彈力蛋白酶(45124，美國Sigma-aldrich 公司產(chǎn)品)，0.9%氯化鈉(山東華魯制藥有限公司產(chǎn)品)；4F Forgaty雙腔球囊導(dǎo)管(北京生命綠洲科技有限責(zé)任公司)；蘇木精-伊紅(HE)染色、彈力纖維(EVG)染色及馬松(Masson)染色試劑盒(武漢谷歌生物科技公司)；麻醉藥(戊巴比妥鈉)；肝素鈉注射液(北京雙鶴藥業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組 24只新西蘭雄兔隨機(jī)分為A組、B組、C組各8只，每組腹主動脈腔內(nèi)灌注濃度為100 U/ml的彈力蛋白酶溶液10 μl；灌注保持時間A組3～5 min，B組7～10 min，D組20～30 min。

1.2.2 建立模型過程 ① 準(zhǔn)備：所有試驗動物術(shù)前進(jìn)食10 h以上，禁水4 h，術(shù)前30 min，靜脈注射肝素鈉(125 U/kg)，3%戊巴比妥鈉(1～1.5 ml/kg)腹腔注射麻醉，去毛，消毒鋪巾，嚴(yán)格無菌操作。② 游離股動脈：右側(cè)股總動脈處切口，分離并游離股總動脈約0.5～1 cm，分別于近心端、遠(yuǎn)心端穿線備用。③腹腔手術(shù)：取腹正中切口，暴露腹主動脈，選取一段分支較少的腹主動脈段約1.5～2.0 cm(較小分支可用0號絲線結(jié)扎)，游離該段腹主動脈，放置橡膠濾線備用，注意避免損傷腰動脈。于近心端、遠(yuǎn)心端分別放置橡膠濾線備用。④ 股動脈穿刺放置導(dǎo)管：股動脈切一小口，送入導(dǎo)管。松開股動脈近心端，將導(dǎo)管輕柔送入游離出的主動脈段內(nèi)，將腹主動脈近心端用動脈夾+橡膠濾線阻斷，遠(yuǎn)心端用橡膠濾線阻斷，形成與導(dǎo)管相通的封閉管腔，回抽腔內(nèi)血液，并用生理鹽水沖洗3次。⑤通過雙腔導(dǎo)管加壓約100 mmHg，將豬胰彈力蛋白酶溶液10 μl注入動脈腔內(nèi)。⑥根據(jù)分組設(shè)計，各組保持不同灌注時間，然后回抽藥物并自副管注入肝素鹽水，自主管抽吸，反復(fù)盥洗動脈囊腔。⑦恢復(fù)主動脈血流：去除濾線，拔除微導(dǎo)管，結(jié)扎股動脈近心端，縫合關(guān)腹。⑧防治感染：術(shù)后給予青霉素80萬U/只，連續(xù)腹腔注射3 d。

1.2.3 腹主動脈彩超檢查 各組分別于術(shù)前及術(shù)后第7天行腹主動脈彩超檢查，分別進(jìn)行矢狀位及橫位檢查，并以橫位為標(biāo)準(zhǔn)留取3處肉眼判斷直徑最大的瘤體圖像，經(jīng)超聲儀器后處理軟件測量最大管腔直徑，取平均值作為該實驗動物瘤體直徑，并計算腹主動脈擴(kuò)張率，擴(kuò)張率=(腹主動脈瘤內(nèi)徑-腹主動脈平均內(nèi)徑)/腹主動脈平均內(nèi)徑；腹主動脈平均內(nèi)徑=(瘤上端內(nèi)徑+瘤下端內(nèi)徑)/2。

1.2.4 組織學(xué)觀察 術(shù)后第7天麻醉、開腹，截取灌注動脈段后空氣栓塞法處死動物。組織分別切片染色，片厚5 μm，分別行HE染色、EVG染色及Masson染色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)的組間比較進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

A組存活8只，灌注局部血管擴(kuò)張率40.3%～63.1%，其中5只擴(kuò)張率大于50%，達(dá)到AAA成瘤標(biāo)準(zhǔn)，成瘤率62.5%；B組存活8只，局部血管擴(kuò)張率87.5%～109.2%，均達(dá)到成瘤標(biāo)準(zhǔn)，成瘤率100%；C組僅存活3只，灌注局部血管擴(kuò)張率237.7%～252.0%，成瘤率100%，但術(shù)后7 d存活率為37.5%；其中1只兔出現(xiàn)了雙下肢癱瘓。

2.1 各組AAA模型肉眼觀察 A組灌注部位局部擴(kuò)張，擴(kuò)張程度約為正常管徑的60%左右；B組灌注部位局部擴(kuò)張較A組明顯，擴(kuò)張程度約為正常管徑的90%左右；C組灌注部位明顯擴(kuò)張，擴(kuò)張程度約為正常管徑的250%，并可見瘤體部位管壁明顯變薄。

2.2 超聲下腹主動脈直徑變化 三組術(shù)前直徑、術(shù)后瘤體最大直徑比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，B組擴(kuò)張率、成瘤率顯著高于A組，C組存活率低于B組(P<0.05)。見表1，見圖1。腹主動脈血管超聲形態(tài)顯示，AAA瘤體直徑擴(kuò)張程度隨灌注時間增加而增大。

表1 超聲下腹主動脈直徑變化±s)

與A組比較:1)P<0.05；與B組比較:2)P<0.05

圖1 各組超聲下AAA形態(tài)表現(xiàn)

2.3 各組病理組織學(xué)改變 A組：HE染色示動脈壁結(jié)構(gòu)較清晰，炎癥細(xì)胞浸潤較少；EVG染色示彈力纖維尚完整，原有曲度改變，連續(xù)性較差；Masson染色見膠原纖維輕度增多。B組：HE染色示動脈壁結(jié)構(gòu)破壞及炎細(xì)胞浸潤較A組加重；EVG示彈力纖維層次不清，曲度變直，可見斷裂；Masson染色示中膜膠原彈力纖維區(qū)域增多。C組：HE染色示動脈壁結(jié)構(gòu)破壞及炎細(xì)胞浸潤較A、B兩組加重；EVG示彈力纖維破壞加重、層次模糊不清，斷裂明顯；Masson染色示外膜及中膜膠原彈力纖維均明顯增多，見圖2。

圖2 各組病理學(xué)改變

3 討 論

Anidjar等〔4〕于1990年首次報道了彈力蛋白酶腔內(nèi)加壓灌注法制作Wistar大鼠AAA模型，其成瘤原理為彈力蛋白酶溶解腹主動脈灌壁組織，啟動腹主動脈炎癥及平滑肌凋亡程序，導(dǎo)致動脈壁彈力蛋白及膠原蛋白自我更新平衡被打亂，最終導(dǎo)致腹主動脈壁無法抵御動脈壓力而向外擴(kuò)張，形成AAA。此后有學(xué)者將此方法應(yīng)用于AAA模型制作，符洋等〔5〕使用彈力蛋白酶腔內(nèi)加壓灌注成功制備兔AAA模型，但在模型制備過程中腹主動脈結(jié)扎封閉時間高達(dá)30 min。有研究證明，阻斷腹主動脈20 min后，會造成71%的實驗動物后肢癱瘓〔6〕。馬巍等〔7〕及張延輝等〔8〕均報道了開腹后將腹主動脈結(jié)扎25 min左右，容易造成家兔脊髓缺血導(dǎo)致實驗動物脊髓癱瘓，進(jìn)而影響AAA模型的穩(wěn)定性。本研究結(jié)果表明在灌注壓力及灌注酶濃度相同的情況下，灌注時間7～10 min組兔成瘤率最高、死亡率最低，是應(yīng)用彈力蛋白酶建立AAA模型最理想的灌注保持時間。本研究方法改變既往腔內(nèi)高壓灌注的方法，改用腔內(nèi)低壓灌注；血管腔內(nèi)加壓灌注是目前所有建立AAA模型普遍實施的方法，無論實驗動物是大鼠還是兔，均采用300～400 mmHg的灌注壓力，以增加腹主動脈管腔內(nèi)壓力，增強(qiáng)腔內(nèi)彈力蛋白酶對血管壁的作用。有報道稱模型制作時給予高灌注壓不僅容易造成彈力蛋白酶經(jīng)管壁微循環(huán)進(jìn)入血液，有誘發(fā)急性胰腺炎及其他組織損傷的風(fēng)險，而且可因管腔內(nèi)壓力較大造成彈力蛋白酶外滲至管腔外，造成血管腔全層及周圍組織破壞，直接導(dǎo)致血管破裂致使動物大出血死亡〔9，10〕。本實驗證實，低灌注壓力避免了上述意外發(fā)生。灌注結(jié)束后給予充分反復(fù)管官腔沖洗，保證管腔內(nèi)無酶液殘留，避免了再灌注后殘余彈力蛋白酶隨血液循環(huán)流向其他器官組織，導(dǎo)致急性胰腺炎及其他器官損害。本實驗采用雙腔管導(dǎo)管，可進(jìn)行流動生理鹽水反復(fù)盥洗，最大限度減少彈力蛋白酶入血風(fēng)險。

本研究以兔代替大鼠進(jìn)行模型制作，由于兔腹主動脈管徑較大鼠明顯粗大，更易于操作，降低造模手術(shù)難度，增加成功率，而且采用兔成功造模，也為下一步利用PET/CT研究炎癥及高血壓對AAA進(jìn)展的影響提供了理想的動物模型。

1 Chiou AC，Chiu B，Oppat WF，etal.Transrectal ultrasound assessment of murine aorta and iliac arteries〔J〕.J Surg Res，2000；88(2)：193-9.

2 Bhamidipati CM，Mehta GS，Lu G，etal.Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase〔J〕.Surgery，2012；152(2)：238-46.

3 Barisione C，Charnigo R，Howatt DA，etal.Rapid dilation of the abdominal aorta during infusion of angiotensin Ⅱ detected by noninvasive high-frequency ultrasonography〔J〕.J Vasc Surg，2006；44(2)：372-6.

4 Anidjar S，Salzmann JL，Gentric D，etal.Elastase-induced experimental aneurysms in rat〔J〕.Circulation，1990；82(3)：973-81.

5 符 洋，黃建華，李孝成，等.家兔腎下腹主動脈瘤模型的建立〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009;9(5)：874-6，918.

6 Yamaguchi T，Yokokawa M，Suzuki M，etal.Factors influencing mortality in the rat elastase-induced-aneurysm model〔J〕.J Surg Res，2000;94(2)：81-3.

7 馬 巍，劉碧波，劉 淼，等.神經(jīng)細(xì)胞凋亡在脊髓缺血再灌注損傷延遲性癱瘓中的作用〔J〕.西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2007;28(3)：300-3.

8 張延輝，劉琳琳，郝琳娜.丹參酮對家兔脊髓缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用〔J〕.牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014;35(4)：71-3.

9 Zhang Q，Huang JH，Xia RP，etal.Suppression of experimental abdominal aortic aneurysm in a rat model by the phosphodiesterase 3 inhibitor cilostazol〔J〕.J Surg Res，2011;167(2)：385-93.

10 Bi Y，Zhong H，Xu K，etal.Performance of a modified rabbit model of abdominal aortic aneurysm induced by topical application of porcine elastase：5-month follow-up study〔J〕.Eur J Vasc Endovasc Surg，2013;45(2)：145-52.

〔2016-03-26修回〕

(編輯 李相軍)

Effect of different perfusion time of high concentration elastase on the aneurysm formation rate in the abdominal aortic aneurysm rabbits model

NIE Mao-Xiao, ZHAO Quan-Ming, YAN Yun-Feng,etal.

Department of Cardiology, Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, Beijing 100029, China

Objective To establish the rabbit abdominal aortic aneurysm model by abdominal aortic perfusion with high concentration, and observe the effect of different perfusion time on the abdominal aorta aneurysms formation rate and mortality in rabbits.Methods 24 male New Zealand male rabbits were randomly divided into three groups (group A, B, C), with 8 rabbits in each group. Using a double-lumen catheter, 10 μl of 100 U/ml elastase was perfused into the abdominal aorta in each group, perfusion retention time were: group A 3 to 5 minutes, group B 7 to10 minutes and 20 to 30 minutes in group C, and then the abdominal aorta was flushed three times with normal saline. Doppler ultrasound examinations of the abdominal aorta were performed before surgery and on day 7 after surgery. The rabbits were sacrificed on day 7 after surgery, and the perfused segment of the abdominal aorta was observed visually and after staining.Results 8 rabbits in group A survived and the perfusion segment dilation rate was 40.3%～63.1%, the dilation rate was greater than 50% in 5 rabbits, which satisfied the criterion of aneurysm formation in the abdominal aorta. Therefore, the aneurysm formation rate of group C was 62.5%, the survival rate was 100% on day 7 after surgery. 8 rabbits survived in group B; the perfusion segment dilation rate was 87.5%～109.2%, the aneurysm formation rate and survival rate were 100%. In group C, 3 rabbits survived, and the perfusion segment dilation rate was 237.7%～252.0%, with an aneurysm formation rate of 100%. However, the survival rate was only 37.5% on day 7 after surgery.Conclusions Abdominal aortic perfusion of high concentrations of elastase , perfusion retention time 7 to 10 minutes is an easy and feasible method to induce AAAs in rabbits with a high aneurysm formation rate, low death rate, and short perfusion time.

Abdominal aortic aneurysm; Elastase

國家自然科學(xué)基金(No.81370437)

趙全明(1960-)，男，主任醫(yī)師，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事冠心病的診斷及介入治療研究。

聶毛曉(1983-)，男，主治醫(yī)師，在讀博士，主要從事冠心病的診斷及介入治療研究。

R543.5

A

1005-9202(2017)03-0535-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.006