血栓彈力圖法和光學(xué)比濁法監(jiān)測(cè)PCI術(shù)后氯吡格雷療效的對(duì)比研究*

李廣華 李陽華 范小斌 謝年謹(jǐn) 李正康 劉長(zhǎng)鈺 古俊蘭

血栓彈力圖法和光學(xué)比濁法監(jiān)測(cè)PCI術(shù)后氯吡格雷療效的對(duì)比研究*

李廣華 李陽華 范小斌 謝年謹(jǐn) 李正康 劉長(zhǎng)鈺 古俊蘭

目的 探討光學(xué)比濁法（LTA）和血栓彈力圖法（TEG）檢測(cè)氯吡格雷抵抗（CPGR）的療效。方法收集2015年1～11月心內(nèi)科經(jīng)雙聯(lián)抗血小板治療并行冠狀動(dòng)脈介入（PCI）后的急性冠狀動(dòng)脈綜合征（ACS）患者425例，對(duì)ADP誘導(dǎo)的光學(xué)比濁法血小板聚集率（LTAADP）與血栓彈力圖法ADP誘導(dǎo)的血小板抑制率（TEGADP）檢測(cè)氯吡格雷抵抗（CPGR）進(jìn)行一致性和相關(guān)性分析，結(jié)合CYP2C19基因表達(dá)的酶活性程度，分析其與LTA和TEG法檢測(cè)CPGR的關(guān)系。結(jié)果LTA和TEG法所測(cè)血小板聚集率檢測(cè)CPGR分別為12.0%和11.8%，兩者存在負(fù)相關(guān)（r=-0.351，P＜0.01）；CYP2C19基因酶活性程度與LTA法檢測(cè)CPGR存在一定的等級(jí)相關(guān)（r=0.239，P＜0.01），與TEG法檢測(cè)CPGR的關(guān)聯(lián)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=-0.088，P=0.70），且在兩法檢測(cè)CPGR上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論TGE與LTA法在監(jiān)測(cè)氯吡格雷療效上有很好的一致性，CYP2C19基因酶活性程度與這兩種方法檢測(cè)CPGR的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

氯吡格雷抵抗 雙聯(lián)抗血小板 血栓彈力圖 光學(xué)比濁法CYP2C19基因

氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林抗血小板治療已成為臨床防治急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)或防止經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention，PCI)后再發(fā)缺血事件的經(jīng)典治療方案[1-2]，國(guó)內(nèi)外研究表明不同患者對(duì)氯吡格雷有著不同的反應(yīng)性[3-6]提示應(yīng)針對(duì)服用氯吡格雷患者制定個(gè)體化抗血小板治療方案，通過及時(shí)、準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)血小板功能，對(duì)抗血小板藥物療效進(jìn)行評(píng)價(jià)和監(jiān)控，從而大大提高抗血小板藥物的預(yù)防與治療效果?？寡“逅幬飸?yīng)用無效甚至抵抗進(jìn)而達(dá)不到預(yù)期目的，這一現(xiàn)象稱為氯吡格雷抵抗（CPGR）。氯吡格雷通過阻斷血小板P2Y12受體發(fā)揮抗血小板作用[7，8]。此外也可使血小板膜蛋白乙?；?，抑制血小板膜酶，有助于抑制血小板功能[9]。本文采用TEG與LTA法對(duì)425例ACS患者行PCI術(shù)后的血小板功能監(jiān)測(cè)，比較不同方法在腺苷二磷酸（ADP）誘導(dǎo)下檢測(cè)CPGR的相關(guān)性，以及CYP2C19基因表達(dá)的酶活性程度與這兩種方法檢測(cè)CPGR的差異性。

對(duì)象與方法

1 研究對(duì)象 選取2015年1～11月廣東省人民醫(yī)院心內(nèi)科425例行PCI后ACS 患者，男性347例，女性78例，平均年齡（62±1）歲，包括ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死以及不穩(wěn)定心絞痛。所有患者入院后均同時(shí)給予阿司匹林腸溶片（拜阿司匹林，Bayaspirin）100 mg/d和氯吡格雷（波立維，Plavix）75 mg/d口服雙聯(lián)抗血小板治療，并且至少3 d后12 h內(nèi)抽取血液測(cè)定血小板聚集功能，所有患者血小板計(jì)數(shù)在正常范圍（100×109/L＜ PLT＜350×109/L）。排除：①已知雙聯(lián)抗血小板治療禁忌證患者；②近期服用過甾體或非甾體抗炎藥者；③近3個(gè)月內(nèi)有出血史或腦血管疾病相關(guān)事件；④有慢性炎癥性疾病者；⑤已知對(duì)研究藥物或器械過敏者（如氯吡格雷、阿司匹林、普通肝素、造影劑不銹鋼等）或過敏體質(zhì)者；⑥可疑的亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、心包炎和主動(dòng)脈夾層；⑦有血液疾病、出血傾向者、出血體質(zhì)，以及有活動(dòng)性出血者；⑧研究者認(rèn)為不適合參加本研究。

2 儀器與試劑 CHRONO-LOG MODEL 700血小板聚集分析儀及配套誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷（ADP）。美國(guó)Haemoseope公司生產(chǎn)的TEG 5000血栓彈力圖儀及配套試劑盒，試劑包括ADP（5 ul／L） ，激活劑F（由蝮蛇血凝酶和血小板ⅩⅢa因子混合而成），高嶺土（含1%的kaolin液）。上海百傲科技有限公司生產(chǎn)的CYP2C19基因芯片檢測(cè)試劑盒，采用PCR-基因芯片法檢測(cè)CYP2C19基因表達(dá)的酶活性程度。

3 方法

3.1 光學(xué)比濁法（LTA）：使用枸櫞酸鈉抗凝管空腹采集靜脈血2 ml，立即混勻，動(dòng)作要輕，不可劇烈晃動(dòng)。經(jīng)800 r/min 離心10 min和3000 r/ min離心10 min得到富含血小板血漿（PRP）和乏血小板血漿（PPP），在PRP加入誘導(dǎo)劑10μmol/ LADP，用PPP為空白參照，采用LTA法測(cè)定，當(dāng)PRP中透光度改變最大時(shí)得到血小板最大聚集率（LTAADP），以百分?jǐn)?shù)表示，4 h內(nèi)完成檢測(cè)。

3.2 血栓彈力圖測(cè)定（TEG）：使用枸櫞酸鈉和肝素抗凝管空腹采集靜脈血2 ml，用3個(gè)通道（ADP激活劑，激活劑F，高嶺土）檢測(cè)，MA（maximal amplitude）表示最大血塊強(qiáng)度，MAADP值由激活劑ADP激活測(cè)定，MA（fibrin）由激活劑F激活測(cè)定，MA thrombin通過高嶺土和氯化鈣激活測(cè)定。合成3個(gè)通道的測(cè)試圖得出血小板ADP抑制率（TEGADP ），4 h內(nèi)完成檢測(cè)。TEGADP=100-100×[（MAADP-MAfibrin）/（MAthrombin-MAfibrin）]

3.3 氯吡格雷抵抗標(biāo)準(zhǔn)：光學(xué)比濁法： 在ADP誘導(dǎo)下血小板最大聚集率≥50%為氯吡格雷抵抗。血栓彈力圖法： 在ADP誘導(dǎo)下血小板最大抑制率＜30%為氯吡格雷抵抗[5-7]。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，一致性分析采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)，兩種檢測(cè)方法采用Pearson相關(guān)分析，酶活性程度與兩種檢測(cè)方法采用Spearman秩相關(guān)分析，兩獨(dú)立組分層比較采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。散點(diǎn)圖利用excel軟件制作。

結(jié) 果

1 兩法檢測(cè)氯吡格雷抵抗的發(fā)生率 采用LTA法檢出CPGR 51例（12.0%），NCPGR 374例（88.0%）；TEG法檢出CPGR 50例（11.8%），NCPGR 375例（88.2%）。見圖1、2。

2 LTA與TEG法檢測(cè)氯吡格雷抵抗(CPGR)的一致性 兩法檢測(cè)CPGR的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

3 兩法檢測(cè)CPGR的相關(guān)性分析 對(duì)ADP誘導(dǎo)的LTAADP與TEGADP進(jìn)行Pearson相關(guān)分析：r=-0.351，P＜0.01，呈負(fù)相關(guān)。見圖3。

4 CYP2C19基因酶活性程度與兩法檢測(cè)CPGR相關(guān)性的比較。

圖1 425例患者LTAADP分布散點(diǎn)圖

圖2 425例患者TEGADP分布散點(diǎn)圖

表1 LTA與TEG法檢測(cè)CPGR的一致性

圖3 LTAADP與TEGADP相關(guān)性

4.1 CYP2C19基因酶活性程度與LTA法檢測(cè)CPGR的相關(guān)性：Spearman等級(jí)相關(guān)分析：r=0.239，P＜0.01，呈等級(jí)相關(guān)。見表3。

4.2 CYP2C19基因酶活性程度與TEG法檢測(cè)CPGR相關(guān)性 Spearman等級(jí)相關(guān)分析：r=-0.088，P＞0.05，可認(rèn)為酶活性程度與TEGADP的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表3 CYP2C19基因酶活性程度與LTA法檢測(cè)CPGR的相關(guān)性

表4 CYP2C19基因酶活性程度與TEG法檢測(cè)CPGR的差異性

5 CYP2C19基因酶活性程度在LTA法和TEG法檢測(cè)CPGR上的差異性 采用秩和檢驗(yàn)，Z=-0.984，P＞0.05，可認(rèn)為L(zhǎng)TA和TEG法檢測(cè)CPGR在CYP2C19基因酶活性程度表達(dá)上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5。

表5 CYP2C19基因酶活性程度在兩法檢測(cè)CPGR上的相關(guān)性

討 論

氯吡格雷是一種新型的噻吩吡啶類抗血小板藥物，在體內(nèi)經(jīng)CYP2C19代謝后產(chǎn)生活性產(chǎn)物，起到抗血小板作用。人體CYP2C19基因型決定CYP2C19酶代謝能力。氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林雙重抗血小板治療是目前ACS及PCI經(jīng)典的治療方案，能明顯降低心血管事件及術(shù)后再狹窄的發(fā)生率。但抗血小板藥物的應(yīng)用存在無效甚至抵抗或用藥過量的問題，有分析認(rèn)為氯吡格雷存在無效甚至抵抗的可能原因是，氯吡格雷作為噻吩并吡啶類藥物通過阻斷與ADP結(jié)合的P2Y12受體，阻斷激活血小板聚集反應(yīng)的途經(jīng)，抑制血小板聚集功能，但血小板上的ADP受體還有P2Y1，這個(gè)受體并未被阻斷，血小板聚集率無明顯降低，相當(dāng)一部分患者對(duì)氯吡格雷的抗血小板反應(yīng)性較差，從而在應(yīng)用氯吡格雷后達(dá)不到充分的抗血小板聚集的功效[10]。

LTA法檢測(cè)血小板聚集功能被認(rèn)為是血小板功能檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[11-13]，血栓彈力圖儀是一種能監(jiān)測(cè)凝血全過程的儀器，TEG法是一種較新穎的檢測(cè)抗血小板藥物療效的方法。氯吡格雷抵抗的檢測(cè)方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)尚不統(tǒng)一。本研究采用口服雙聯(lián)抗血小板藥物負(fù)荷劑量12 h后的LTAADP與TEGADP 檢測(cè)值作為CPGR的診斷標(biāo)準(zhǔn)[14-16]，結(jié)果顯示，LTA與TEG法通過ADP誘導(dǎo)檢出CPGR的發(fā)生率分別為12%，11.8%，兩法檢出NCPGR概率分別為88%，88.2%。提示兩法對(duì)于CPGR檢出率大致相同。

CYP2C19作為氯吡格雷氧化代謝的關(guān)鍵酶，其基因的多態(tài)性與氯吡格雷抵抗的關(guān)系成為近年來的研究熱點(diǎn)。本研究所納入的425例患者均進(jìn)行了CYP2C19 基因型檢測(cè)，酶活性程度的高、中、低表示雙聯(lián)抗血小板藥物代謝的快、中、慢。因此本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)CYP2C19基因酶活性程度與LTA和TEG法檢測(cè)CPGR相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。最終認(rèn)為L(zhǎng)TA和TEG法檢測(cè)CPGR在CYP2C19基因酶活性程度表達(dá)上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，LTA與TEG法檢測(cè)CPGR無明顯差異且兩個(gè)指標(biāo)存在低度負(fù)相關(guān)，但兩法在檢測(cè)CPGR對(duì)于CYP2C19基因酶活性程度的表達(dá)卻出現(xiàn)了差異，LTAADP與酶活性程度存在一定的等級(jí)相關(guān)，TEGADP與酶活性程度不存在等級(jí)相關(guān)，兩者作為獨(dú)立組等級(jí)資料進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。究其原因，考慮有以下幾個(gè)方面：一是部分臨床患者存在CPGR現(xiàn)象與個(gè)體基因型相關(guān)，但不同患者對(duì)氯吡格雷反應(yīng)性并不相同，個(gè)體差異大；二是不能排除發(fā)生CPGR假陰性的可能性，對(duì)于氯吡格雷抵抗的影響因素尚需大樣本前瞻性研究來評(píng)估；三是通過分析既往患者服用氯吡格雷后總體上CYP2C19基因?qū)€(gè)體代謝的影響，發(fā)現(xiàn)基因型與酶活性快慢及機(jī)體代謝快慢有關(guān)，但具體反映到個(gè)體身上，除基因多態(tài)性外，藥物吸收和活性代謝清除的個(gè)體差異、飲食、生活習(xí)慣、疾病等都有可能影響。有的個(gè)體基因影響因素占主導(dǎo)地位，與整體符合率一致，而有的個(gè)體其他因素的影響作用更大，蓋過了基因的影響作用，所反映出來的是基因表現(xiàn)型決定的酶活性程度與CPGR無明顯相關(guān)。所以也從另一個(gè)方面說明CYP2C19 基因多態(tài)性表達(dá)的酶活性程度不同與氯吡格雷抵抗尚未有明確關(guān)系。

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Comparatively Study on the Thromboelastography and Light Transmission Aggregometry for Platelet Aggregation in Acute Coronary Syndrome Patients after Percutaneous Coronary Intervention under Antiplatelet Therapy

LI Guang-hua，LI Yang-hua，F(xiàn)AN Xiao-bin，et al. Department of Clinical Laboratory，Guangdong General Hospital，Academy of Medical Sciences，Guangzhou，510080

Objective The dual antiplatelet drug for the treatment of percutaneous coronary intervention after operation of acute coronary syndrome patients，the by optical than Light Transmission Aggregometry （LTA） and method of thromboelastography（TEG） detection of clopidogrel resistance（CPGR） consistency analysis，and compare the correlation with the levels of CYP2C19 enzyme activity.MethodsA total of 425 patients with acute coronary syndrome treated with dual antiplatelet therapy and PCI in the Department of Cardiology during the period of January 2015 to November were collected. Consistency and correlation analysis of CPGR induced platelet aggregation rate （LTAADP）and ADP induced platelet inhibition rate （TEGADP） as well as the relationship between the two methods to detect CPGR and CYP2C19 gene expression level were done.ResultsThe platelet aggregation rate measured by the LTA method was used to detect the CPGR as 12%. The platelet inhibition rate measured by the TEG method was used to detect the CPGR as 11.8%. There is a negative correlation between LTAADP and TEGADP （r=-0.351，P＜0.01）; There was a certain degree of correlation between the activity of CYP2C19 gene and the detection of CPGR by LTA method （r=0.239，P=0.00）. No correlation between the degree of activity of CYP2C19 gene and the detection of CPGR by TEG method （r=-0.088，P=0.70）. And no significant difference between the two methods in the detection of CPGR was found.ConclusionTGE method and LTA method to monitor the efficacy of clopidogrel has well consistency，There was no significant difference between the two methods for the detection of CPGR with the degree of CYP2C19 gene activity.

Clopidogrel resistance Dual antiplatelet Thromboelastography Light transmission aggregometry CYP2C19

R541.4 R331.1+43

A

1671-2587（2017）01-0059-05

2016-09-30）

（本文編輯：王虹）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.01.017

*本課題受廣東省醫(yī)學(xué)科研基金（No.A2015442）資助

510080 廣州，廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院檢驗(yàn)科（李廣華，范小斌，李正康，劉長(zhǎng)鈺，古俊蘭）；深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科（李陽華）；心內(nèi)科（謝年謹(jǐn)）

李廣華（1974–），男，廣東梅州人，副主任技師，碩士，主要從事血栓止血工作，（Tel）13925119975。