邢臺地區(qū)血小板志愿捐獻(xiàn)者HPA基因資料庫的建立

呂冉 劉郁 王朋蕊 高秀俊 王志森

邢臺地區(qū)血小板志愿捐獻(xiàn)者HPA基因資料庫的建立

呂冉 劉郁 王朋蕊 高秀俊 王志森

目的 對邢臺地區(qū)血小板志愿捐獻(xiàn)者進(jìn)行人類血小板抗原（human platelet antigen，HPA）基因分型，建立已知HPA基因型的血小板捐獻(xiàn)者資料庫。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物（polymerase chain reaction-sequence specific primers，PCR-SSP）方法對隨機(jī)抽取的150例血小板捐獻(xiàn)者進(jìn)行HPA-1～6和HPA-15抗原系統(tǒng)共14個抗原基因分型。結(jié)果邢臺地區(qū)血小板志愿捐獻(xiàn)者HPA的基因頻率分別為：HPA-1a 0.953，1b 0.010；2a 0.953，2b 0.086；3a 0.596，3b 0.394；4a 1.000，4b 0；5a 0.967，5b 0.015；6a 0.986，6b 0.010；15a 0.475，15b 0.506。結(jié)論邢臺地區(qū)血小板志愿捐獻(xiàn)者HPA-1～6和HPA-15抗原系統(tǒng)的基因頻率符合Hardy-weinberg遺傳定律，與其他地區(qū)和國家的同類資料相比顯示出種族和地域性差異，應(yīng)建立邢臺地區(qū)已知HPA基因型的血小板捐獻(xiàn)者資料庫。

邢臺地區(qū) HPA基因型 血小板血型

血型是人類血液細(xì)胞的主要特征之一，也是人類的一種遺傳標(biāo)記，具有種族差異，血小板血型也是如此。研究證明血小板表面具有復(fù)雜的血型抗原，這些抗原由遺傳決定，通常分兩類，一類是與其他細(xì)胞表面或組織共同的抗原，稱血小板相關(guān)抗原；另一類為血小板特異性抗原。相關(guān)抗原主要與紅細(xì)胞的ABO血型系統(tǒng)以及人類白細(xì)胞抗原（HLA）有關(guān)；特異性抗原由血小板特有的抗原決定簇組成，表現(xiàn)為血小板獨(dú)特的遺傳多態(tài)性，在其他細(xì)胞和組織上不能發(fā)現(xiàn)[1]。

血小板輸注用于預(yù)防和治療血小板減少或血小板功能缺失引起的出血，是臨床上重要的支持方法；然而臨床上盲目反復(fù)輸注血小板患者的血清中可產(chǎn)生血小板同種抗體，當(dāng)再輸入血小板后，會迅速產(chǎn)生血小板抗原和抗體的免疫反應(yīng)，患者出現(xiàn)畏寒、發(fā)熱等癥狀。輸入的血小板會迅速破壞，血小板計(jì)數(shù)不僅不升高，有時反而會下降，陷入血小板輸注無效狀態(tài)，輸注血小板后產(chǎn)生抗體的頻率主要取決于輸注次數(shù)，次數(shù)越多，抗體產(chǎn)生的頻率越高[2]。同時在臨床血小板輸注過程中，如果血小板抗原不相匹配，可導(dǎo)致受血者機(jī)體產(chǎn)生同種抗體，抗原不配合的比例越高，產(chǎn)生抗體的機(jī)會就越多，引起患者出現(xiàn)血小板輸注無效的概率越大。所以在輸注血小板時，除積極對患者進(jìn)行血小板抗體篩選外，建立HPA基因型血小板捐獻(xiàn)者資料庫對臨床醫(yī)學(xué)和輸血實(shí)踐具有十分重要的意義。

血清學(xué)方法是目前實(shí)驗(yàn)室普遍應(yīng)用的HPA分型方法，但難以獲得高質(zhì)量的抗血清且價格昂貴，同時患者難以提供大量的血小板用以血清學(xué)分型，使得該方法難以開展。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多方法開始應(yīng)用于HPA 的基因分型，目前國外已報道的HPA基因分型方法有限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）序列特異性寡核苷酸-聚合酶鏈反應(yīng)（SSO-PCR）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）序列特異性引物-聚合酶鏈反應(yīng)（PCR -SSP）等，其中以PCR-SSP應(yīng)用最廣泛。本研究采用PCR-SSP法對邢臺地區(qū)150例隨機(jī)獻(xiàn)血者進(jìn)行HPA-1～6和HPA-15抗原14個等位基因的檢測分析，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以根據(jù)分布頻率來預(yù)測血小板同種免疫發(fā)生的可能性，確定有臨床意義的血小板抗原系統(tǒng)，以尋找更合適的血小板輸注，保證輸血安全性和有效性。

材料與方法

1 標(biāo)本來源 150份標(biāo)本來源于邢臺市漢族人群中健康無血緣關(guān)系的無償獻(xiàn)血者。

2 主要儀器和試劑 PCR擴(kuò)增儀（eppendorf）、電泳儀（北京市六一儀器廠DYY-6C型）、JS-860B凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司）；Taq酶（美國Promaga公司）、血小板基因DNA提取試劑盒（北京康為公司，批號00071408）、血小板抗原基因分型試劑盒（天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司 201409011）

3 DNA提取 采集EDTA抗凝靜脈血3～5 ml，按照血小板基因DNA提取試劑盒說明書操作，提取DNA，并儲存–20℃?zhèn)溆谩?/p>

4 PCR-SSP擴(kuò)增 嚴(yán)格按照血小板抗原基因分型試劑盒說明書對HPA-1～6和HPA-15共14個抗原進(jìn)行基因分型。HPA引物濃度為：HPA-1、2、4、6濃度0.2 μmol/L，HPA-3、5、15濃度1 μmol/L。配制dNTP-Buffer工作液：440 μl濃縮dNTP-Buffer加入560 μl無菌水配制成1 000 μl dNTP-Buffer工作液。配制Buffer-酶-標(biāo)本混合液（每人份用量）：取320 μl dNTP-Buffer工作液、3.3 μl Taq酶、50 μl DNA標(biāo)本混合，總反應(yīng)體積373.3 μl混合液。漩渦混勻Buffer-酶-標(biāo)本混合液，并瞬間離心，使液體置于管底，分別向PCR反應(yīng)板每個引物孔各加入10 μl上述混合液，每孔再分別加入15～20 μl石蠟油，用密封膜封好。將反應(yīng)板放入設(shè)置好循環(huán)參數(shù)的PCR擴(kuò)增儀內(nèi)，擴(kuò)增程序：96℃/3 min，1個循環(huán)；，96℃/25 s，68℃/45s，72℃/30 s，5個循環(huán)；96℃/25 s，61℃/45 s，72℃/30 s，22個循環(huán)；96℃/20 s，55℃/45 s，72℃/60 s，8個循環(huán)；72℃/3 min，1個循環(huán)；4℃保存。

5 瓊脂糖凝膠電泳 將每個PCR產(chǎn)物5～10 μl轉(zhuǎn)移到2.5%瓊脂糖凝膠孔中，在140～150 V電壓電泳15～20 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 基因頻率采用基因計(jì)數(shù)法，并進(jìn)行基因分布的Hardy-weinberg平衡驗(yàn)證；不同人群間基因頻率分布的比較采用 χ2檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 HPA-1～6，15基因分布 本地區(qū)人群HPA-1～6，15系統(tǒng)基因分型頻率符合Hardy-weinberg平衡定律；HPA-15和HPA-3是具有高雜合度的血型系統(tǒng)，尤其是HPA-15雜合度最高。HPA-3，15系統(tǒng)抗原頻率相近；HPA-1、2、4、5、6系統(tǒng)以aa基因型為主，HPA-1檢出4例a/b雜合子；HPA-2檢出20例a/b雜合子，檢出1例b/b純合子；HPA-5檢出5例a/b雜合子；HPA-6檢出4例a/b雜合子；HPA-1，4，5，6均未檢出b/b純合子（表1）。

2 不同人群HPA-1～6，15基因分布比較 HPA-3與我國其他地區(qū)同類資料比較χ2=4.82，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與印尼、英國、剛果等相比χ2=5.64，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HPA-5和HPA-15和剛果、喀麥隆比較χ2=20.50、χ2=31.20，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表1 150例獻(xiàn)血者HPA的基因型和基因頻率

表2 不同人群HPA等位基因頻率的比較

討 論

人類血小板表面存在眾多復(fù)雜的血型抗原，主要有白細(xì)胞抗原、紅細(xì)胞抗原和HPA。HPA為血小板自身特異性抗原，位于血小板膜糖蛋白上，由多個基因座位決定，每個基因座位上存在共顯性遺傳的雙等位基因，具有高度多態(tài)性。在現(xiàn)今的血液輸注治療中，血小板成分輸注會產(chǎn)生輸注后紫癜、輸注無效等同種免疫反應(yīng)的發(fā)生，占全部輸血反應(yīng)的10.04%，其中約20%的反應(yīng)因HPA抗體產(chǎn)生。由于HPA抗體引起的輸血反應(yīng)程度遠(yuǎn)高于HLA抗體[11]，這是因?yàn)檠“蹇乖缓系妮斪⒖蓪?dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生同種抗體，引起病理性同種免疫反應(yīng)而致血小板破壞，此類患者輸注HPA同型的單采血小板則顯得尤為重要。在已命名的23個HPA抗原中，有12個抗原組成了6個抗原系統(tǒng)，包括HPA-1～5、15。其中HPA-3和HPA-15在中國人群具有廣泛的多態(tài)性，而HPA-1、2、3、15這4個系統(tǒng)也具有一定的分布，在臨床輸血與疾病相關(guān)性研究中具有重要意義。不同特異性的HPA抗原經(jīng)輸血和妊娠免疫產(chǎn)生血小板特異性抗體，可引起血小板輸注無效癥及新生兒同種免疫血小板減少癥。國內(nèi)已先后報道抗-HPA-2b，-3a，-4b，-5b，-15a等血小板特異性抗體[12，13]。因此，對患者HPA抗原進(jìn)行準(zhǔn)確快速的分型并從已知血小板供者庫中尋找同型供者，對血小板配合性輸注十分重要。

本研究發(fā)現(xiàn)HPA-1～6和HPA-15基因均有表達(dá)，除3a、15a均為高頻率表達(dá)基因，HPA-b基因中HPA-1、4、5、6沒有表達(dá)，其余均有表達(dá)；除HPA-3b、15b的基因?yàn)楦哳l率外，其余均為低頻率基因；抗原不配合率的高低反映HPA在輸血治療時，刺激宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生血小板同種抗體幾率的大小。本文結(jié)果顯示HPA-3、15的不配合率較高，在輸血上具有重要的免疫學(xué)意義，通過H-W平衡檢驗(yàn)證實(shí)，隨機(jī)抽取人群的HPA基因分型結(jié)果可以代表本地區(qū)人群的分布。目前我們已建立了固定血小板獻(xiàn)血者150人份已知HPA基因型的血小板供者庫，根據(jù)本地區(qū)基因分布特點(diǎn)，需對供、受者檢測HPA-1～6、15的基因型，今后將每年進(jìn)行一定數(shù)量固定血小板獻(xiàn)血者的基因檢測，以保障臨床治療的需要。

在臨床輸血實(shí)踐中，盡管隨機(jī)輸血導(dǎo)致血小板輸注無效涉及的因素甚多，但與抗-HLA和抗-HPA密切相關(guān)；前者可以通過濾除白細(xì)胞或除去白細(xì)胞活性的血小板，以減少抗-HLA的產(chǎn)生；后者需選擇HPA相合的血小板輸注。預(yù)防血小板輸注無效的有效途徑是調(diào)查HPA分布多態(tài)性，掌握本地區(qū)的優(yōu)勢同種抗原及高?？乖到y(tǒng)，針對特定人群進(jìn)行血小板抗體篩查，同時建立大樣本血小板捐獻(xiàn)者資料庫進(jìn)行HPA匹配輸注。對中國大部分地區(qū)的漢族人群而言，只需檢測供者與受（患）者的HPA-2、3、15基因[14]。只要供受者相合，就可以減少血小板輸注無效的發(fā)生，這樣做不但縮短了實(shí)驗(yàn)時間，同時也節(jié)省了試劑及其耗材，降低了患者的就醫(yī)成本，更重要的是患者能夠及時、有效的輸注血小板制劑，提高臨床治療效果，具有重要的免疫學(xué)意義和社會效益。

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Establishment of HPA Gene Database for Platelet Donors in Xingtai Area of Hebei

LV Ran，LIU Yu，WANG Pengrui，et al. Xingtai Central Blood Station of Hebei Province，Xingtai，054000

Objective The HPA genotyping of platelet donors in xingtai area was performed，and the HPA genotype of the platelet donors was established.MethodPCR-SSP method was used to randomly select 150 platelet donors who carry out a total of 14 antigens of HPA-1-6 and HPA-15 .ResultThe gene frequencies were found to be 0.953 and 0.010 for HPA-1a and -1b：0.951 and 0.086 for HPA-2a and -2b：0.596 and 0.394 for HPA-3a and -3b：1.000 and 0.000for HPA-4a and -4b：0.967 and 0.015 for HPA-5a and -5b：0.986 and 0.010 for HPA-6a and -6b：0.475 and 0.506 for HPA-15a and -15b.ConclusionThe gene frequencies of HPA-1-6 and HPA-15 antigens in xingtai area of Hebei province coincide with the Hardy-Weinberg genetic law，which shows difference among nationalities and regions.This is the first establishment of HPA genotype database in xingtai.

Xingtai region HPA genotyping Blood platelet

R457.1+<1 R392.11 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A class="emphasis_bold">1 R392.11 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A 【文章編號】 1671-2587（2017）01-0055-041 R392.11 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A

1671-2587（2017）01-0055-04

A 【文章編號】 1671-2587（2017）01-0055-04

2016-08-28）

（本文編輯：王虹）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.01.016

054000 河北省邢臺市中心血站（呂冉，劉郁，高秀俊，王志森）；隆堯縣醫(yī)院（王朋蕊）

呂冉（1982–），女，河北邢臺人，主管檢驗(yàn)師，學(xué)士，主要從事免疫血液學(xué)工作，（Tel）15033199688，0319-2158864（E-mail）xuelv1980@163.com。