珍珠層生物性能及成骨誘導(dǎo)能力研究進(jìn)展

鄭斌，徐普

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院·海南省口腔醫(yī)學(xué)中心口腔種植科，海南?？?70208)

珍珠層生物性能及成骨誘導(dǎo)能力研究進(jìn)展

鄭斌，徐普

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院·海南省口腔醫(yī)學(xué)中心口腔種植科，海南?？?70208)

珍珠層作為骨修復(fù)材料，具有誘導(dǎo)成骨作用、合適的降解性能以及良好的力學(xué)性能。文章綜述了珍珠層的結(jié)構(gòu)及成分、細(xì)胞相容性和生物降解性及對(duì)前成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)作用，同時(shí)展望了其作為骨缺損修復(fù)材料的應(yīng)用前景。

珍珠層；前成骨細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)；成骨誘導(dǎo)

牙周病、外傷、腫瘤和炎癥均可導(dǎo)致骨缺損，難以恢復(fù)的骨缺損困擾著成千上萬人，并且嚴(yán)重影響他們的生活質(zhì)量。有些情況下，骨結(jié)構(gòu)改變能影響人機(jī)體平衡。因此，適用于人體生物材料的研發(fā)顯得尤為重要，促進(jìn)骨移植材料研發(fā)水平不斷提高。目前，來源于人的異體骨和動(dòng)物的異種骨因不受供應(yīng)限制而被廣泛使用，但存在著介導(dǎo)免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)[1]。人工骨替代異體骨或異種骨避免了不良反應(yīng)出現(xiàn)，具有良好的應(yīng)用前景。Lopez等[2]于1992年發(fā)現(xiàn)貝殼珍珠層具有良好的生物相容性和成骨誘導(dǎo)性，促進(jìn)了人工骨修復(fù)材料應(yīng)用研發(fā)進(jìn)展。相繼其他學(xué)者發(fā)現(xiàn)，珍珠層能夠在體外實(shí)驗(yàn)環(huán)境中誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖和礦化，進(jìn)一步確定其成骨誘導(dǎo)性[3-5]。珍珠主要由珍珠層組成，比貝殼珍珠層含有更多的有機(jī)基質(zhì)和微量元素[6]，并且產(chǎn)量豐富，引起了較多學(xué)者的關(guān)注，期望珍珠能有更好的成骨誘導(dǎo)性能。文章從珍珠層的理化特性、生物性能及成骨誘導(dǎo)方面展開綜述。

1 珍珠層結(jié)構(gòu)及包含成分

珍珠層具有典型的“磚-泥”結(jié)構(gòu)，即文石板片呈層狀分布，板片之間為有機(jī)質(zhì)。對(duì)文石板片進(jìn)一步觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，它的結(jié)構(gòu)單元并不是一個(gè)完整的單晶，而是納米晶粒的聚集體，晶粒周圍都包裹有機(jī)基質(zhì)，整個(gè)板片就是一個(gè)有機(jī)-無機(jī)復(fù)合的“偽單晶”[7]。顯微結(jié)構(gòu)下發(fā)現(xiàn)了文石板片中礦化橋的存在，位于文石板片層之間，表現(xiàn)為“磚-橋-泥”的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)了珍珠層結(jié)構(gòu)[8]。Rousseau等[9]利用原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)觀察到了這種納米晶粒的存在，平均大小約45 nm。納米顆粒被鑲嵌到連續(xù)網(wǎng)狀有機(jī)質(zhì)框架中，并且每個(gè)納米顆粒是獨(dú)立的，相互間無直接接觸；同時(shí)，通過高倍透射電子顯微鏡觀測(cè)到了有機(jī)質(zhì)橋的存在。文石晶型碳酸鈣構(gòu)成貝殼珍珠層和珍珠主要無機(jī)成分，約占總量的95%，還包含Na、K、Mg、Cu、Fe、Zn等多種微量元素[10]；有機(jī)成分近似5%主要為蛋白質(zhì)。研究表明，珍珠層EDTA提取出的可溶蛋白質(zhì)可以在體外實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)文石和球文石晶體定向生成，并且具有相同多晶相和形態(tài)；而不可溶蛋白對(duì)晶體聚集密度、大小數(shù)量有影響[11]。學(xué)者們進(jìn)一步從珍珠層中純化分離出一些蛋白質(zhì)，進(jìn)行更深入的研究分析。多項(xiàng)研究表明它們能調(diào)控CaCO3沉積速度及表面形態(tài)，調(diào)節(jié)與鈣離子結(jié)合狀況[12-16]。P10這種蛋白在生物礦化中不僅加速碳酸鈣晶體的成核，還促進(jìn)堿性磷酸酶的活性，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化[17]；P60作用于前成骨細(xì)胞和骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)形成[18]；N16能誘導(dǎo)小鼠前成骨細(xì)胞分化及促進(jìn)其生物礦化；抑制破骨細(xì)胞分化和骨組織吸收，對(duì)治療骨質(zhì)疏松有較大應(yīng)用潛力[19]。

2 珍珠層生物相容性及降解性

眾所周知，生物相容性是生物材料在組織工程中應(yīng)用的基礎(chǔ)條件。納米珍珠粉細(xì)胞毒性試驗(yàn)相關(guān)結(jié)果表明符合生物材料的細(xì)胞毒性要求，未見溶血反應(yīng)、內(nèi)刺激反應(yīng)及體內(nèi)毒性反應(yīng),可以初步的認(rèn)為納米珍珠粉具有一定的血液和組織相容性[20]。有學(xué)者通過觀測(cè)珍珠和貝殼珍珠層磨片，羥基磷灰石片(模擬體液沉積制作)對(duì)新生小鼠成骨細(xì)胞增殖和分化的作用，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在珍珠片上的增殖更快，細(xì)胞外基質(zhì)面積最大[21]。Gao等[22]對(duì)比了納米和微米珍珠粉生物利用率，表明納米珍珠粉生物利用率效果更好。Chen等[23]研究表明口服納米級(jí)珍珠粉未出現(xiàn)急性毒性反應(yīng)，但長(zhǎng)期慢性毒性反應(yīng)有待于觀測(cè)。

生物材料體內(nèi)降解性能是評(píng)價(jià)生物材料安全性的重要指標(biāo)。骨修復(fù)材料充填于骨缺損區(qū)，其體內(nèi)生物降解速率應(yīng)和新骨改建形成相適應(yīng)。由于珍珠層僅含有1%～5%的有機(jī)質(zhì)，而骨組織含有22%左右有機(jī)質(zhì)，造成珍珠層的持續(xù)吸收速率低于骨吸收速率，珍珠層降解慢可能影響骨改建過程[24]。對(duì)于珍珠層降解，也有學(xué)者認(rèn)為破骨細(xì)胞降解珍珠層種植體的能力有限，其中珍珠層種植體大小、由光滑到粗糙的形態(tài)及周圍細(xì)胞環(huán)境是決定其生物降解的關(guān)鍵因素[25]。珍珠層粉粒徑的大小也是影響其降解的關(guān)鍵因素之一，湯勇智等[26]發(fā)現(xiàn)，納米級(jí)珍珠粉降解率高于微米級(jí)，骨修復(fù)能力也強(qiáng)于微米級(jí)。因此，珍珠層生物降解率與粒徑大小和形態(tài)相關(guān)，當(dāng)珍珠層的粒徑逐漸變小，形態(tài)由光滑到粗糙，其降解吸收呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。

3 珍珠層對(duì)前成骨細(xì)胞成骨誘導(dǎo)

珍珠層植入人、羊和大鼠體內(nèi)均能刺激骨形成細(xì)胞，促進(jìn)新骨形成，未發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)[3，27-28]。大量實(shí)驗(yàn)表明，珍珠層水溶有機(jī)質(zhì)(water-soluble organic matrix，WSM)才具備實(shí)際意義上的成骨誘導(dǎo)性，不僅能促進(jìn)小鼠前成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，而且誘導(dǎo)其礦化成骨[27，29-30]。珍珠層水溶有機(jī)質(zhì)含有約110種有機(jī)分子，分子量從100～700 Da不等，含有多肽氨基酸，分子量低于1 kD的有機(jī)分子是珍珠層水溶有機(jī)質(zhì)主要組成部分[31]。為了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)珍珠層有機(jī)基質(zhì)中的成骨相關(guān)因子，Mouriès等[32]用高效液相色譜法根據(jù)有機(jī)基質(zhì)分子量大小劃分為SE1～SE4四段，其中相對(duì)分子量較小的SE4段成骨活性最明顯，能夠顯著促進(jìn)MCR5細(xì)胞的ALP活性，與骨形態(tài)蛋白(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)作用相似，不同細(xì)胞略有不同。Moutahir-Belqasmi等[33]將WSM配成不同的濃度：1 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL，研究對(duì)小鼠的成骨細(xì)胞作用，其中濃度為50 μg/mL的WSM對(duì)于ALP的增殖效果最好，100 μg/mL次之，余幾乎沒有影響，表明能促進(jìn)細(xì)胞ALP增加的濃度為50～100 μg/mL。珍珠層水溶有機(jī)質(zhì)對(duì)成骨有積極促進(jìn)作用，同時(shí)對(duì)骨吸收也有影響，能促進(jìn)前破骨細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞吸收珍珠層基質(zhì)，但吸收速度相比慢于骨的吸收，對(duì)破骨細(xì)胞有一定的抑制作用[34-35]。雖然珍珠層水溶有機(jī)質(zhì)表現(xiàn)出良好的促成骨效應(yīng)和破骨調(diào)控作用，但它畢竟是一種混合物，包含多種分子，珍珠層水溶有機(jī)質(zhì)良好性能可能是多種分子共同作用的結(jié)果。

4 珍珠層對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)及相關(guān)應(yīng)用

珍珠層對(duì)前成骨細(xì)胞的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明，WSM能釋放相關(guān)信號(hào)因子促進(jìn)細(xì)胞成骨分化。有學(xué)者推測(cè)WSM信號(hào)因子也能影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，使其向成骨細(xì)胞分化。在1999年Lamghari等[36]研究發(fā)現(xiàn)WSM在1.6 mg/mL時(shí)，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rats bone marrow mesenchymal cells，rBMSCs) ALP活性明顯提高，同時(shí)在830 g/mL降低細(xì)胞增殖率，說明較高濃度WSM才能促進(jìn)ALP活性增加，作用類似于BMPs。隨著研究進(jìn)展，低濃度WSM及特定提取蛋白也表現(xiàn)出促成骨作用。Mouriès等[32]發(fā)現(xiàn)WSM在135 g/mL、270 g/mL和540 g/mL均增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞ALP活性，作用與地塞米松作用相似，同時(shí)能促進(jìn)細(xì)胞增殖并且沒有表現(xiàn)出劑量相關(guān)性，而地塞米松對(duì)增殖幾乎沒有影響。也有研究表明WSM能影響相關(guān)成骨相關(guān)信號(hào)因子，尤其是在150～200 μg/mL時(shí)BMP-2的基因表達(dá)量增強(qiáng)，成骨誘導(dǎo)作用明顯，表現(xiàn)為兔BMSCs中堿性磷酸酶的活性提高，成骨細(xì)胞分化增強(qiáng)[37]。珍珠層提取蛋白P60能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞和MSCs細(xì)胞周圍礦化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生，在第8天左右均開始礦化，MSCs細(xì)胞礦化程度弱于MC3T3-E1細(xì)胞[18]。Green等[38]研究發(fā)現(xiàn)珍珠層片(500～750 μm)與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，比rhBMP-2的成骨誘導(dǎo)性更強(qiáng)；EDTA提取的珍珠層可溶基質(zhì)蛋白(nacre soluble protein matrix，SPM)尤其富含酸性天冬氨酸，具有良好的成骨誘導(dǎo)性，并能促進(jìn)細(xì)胞增殖及骨鈣素的表達(dá)。

5 展望

珍珠層具有有機(jī)和無機(jī)完美結(jié)合的生物礦化結(jié)構(gòu)，尤其是有機(jī)基質(zhì)包含促進(jìn)骨形成和骨改建主要信號(hào)因子，使珍珠層具有良好的成骨誘導(dǎo)潛能。大量實(shí)驗(yàn)對(duì)珍珠層作為骨替代材料展開了深入研究，尤其是對(duì)前成骨細(xì)胞和髓間質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)，但是珍珠層誘導(dǎo)成骨機(jī)制目前還沒有明確闡明。雖然相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道成骨因子存在于小分子量有機(jī)基質(zhì)中，但具體調(diào)控因子及相關(guān)通路未完全明確，有待于進(jìn)一步深入研究。珍珠層作為復(fù)合材料應(yīng)用在復(fù)合支架材料中，能復(fù)合PLLA、PLGA、生物凝膠[39-41]等，表現(xiàn)出良好的生物相容性和安全性，具有可觀應(yīng)用前景。珍珠層各方面的優(yōu)良性能也展現(xiàn)了珍珠應(yīng)用潛力，尤其是納米級(jí)珍珠粉，期待進(jìn)一步的深入研究。

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R68

A

1003—6350（2017）11—1836—03

2016-12-06)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.11.038

海南省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（編號(hào)：ZDYF2016018）；海南省?？谑兄攸c(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目-2013-58（編號(hào)：2013-SKG-06023）

徐普。E-mail：hnxupu@163.com