荷斯坦牛TLR6基因多態(tài)性分析

周秀敏，李強子，畢英杰，任衛(wèi)合，張 麗（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

遺傳育種與繁殖

荷斯坦牛TLR6基因多態(tài)性分析

周秀敏，李強子，畢英杰，任衛(wèi)合，張 麗
（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

為研究中國荷斯坦牛TLR6基因的多態(tài)性，確定其等位基因數(shù)以及核苷酸變異位點，探討其遺傳特性，采用PCR-SSCP技術對303頭荷斯坦牛的TLR6基因進行了遺傳多態(tài)性檢測。結果表明：TLR6基因在擴增區(qū)域的209 bp處發(fā)生G→A的錯義突變，導致TLR6蛋白中第70位天冬氨酸（Asp）變?yōu)樘於０罚ˋsn），并產生AA、BB、AB三種基因型，基因型頻率分別為0.214 5、0.122 1和0.663 4，經χ2適合性檢驗，荷斯坦牛在該位點偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.05）。說明中國荷斯坦牛TLR6基因多態(tài)性豐富，該位點可以作為荷斯坦?？共∮N的分子標記位點。

荷斯坦牛；TLR6基因；遺傳多態(tài)性

TLRs是一類比較保守模式識別受體，能在微生物病原體感染機體早期做出免疫應答，是機體天然免疫防御中的重要因子［1］，可直接識別病原體的病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），進而啟動免疫應答并建立獲得性免疫。TLR6作為TLRs家族一員，通過激活巨噬細胞、單核細胞等抗原遞呈細胞來對病原體做出免疫應答［2］。Vikki等［3］研究表明，TLR6不能直接識別病原體，而是作為輔助因子增強TLR2對某些病原體PAMPs的識別。研究發(fā)現(xiàn)，TLR6基因位于牛的第6號染色體上，包含2個外顯子和1個內含子［4］。李強子等［5］通過對TLR6基因生物信息學分析表明，該基因能對牛的抗病力和生產性能起作用。而TLR6基因也是奶牛乳房炎抗性相關的候選基因［6］。

近年來，國內對荷斯坦牛TLRs的研究大部分集中在TLR2和TLR4上，而對于TLR6的研究僅見儲明星［6］的相關研究。本實驗通過PCR-SSCP技術對荷斯坦牛TLR6基因進行多態(tài)性分析，旨在豐富荷斯坦牛TLR6基因庫，并為抗病性基因的篩選提供分子理論資料。

1 材料和方法

1.1 樣品采集及基因組DNA提取

血樣采自寧夏賀蘭山奶業(yè)有限公司的303頭中國荷斯坦牛，用醫(yī)用采血管尾靜脈采血10mL，-20℃保存。采用苯酚-氯仿抽提法，從備用凍存血液樣本中提取總基因組DNA，去離子水溶解稀釋，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設計與PCR-SSCP

根據GenBank中已公布的荷斯坦牛TLR6基因的mRNA序列（登錄號：NM_001001159），用Primer6.0軟件設計1對特異性引物，用于擴增荷斯坦牛TLR6基因序列。引物序列為：F：5′-CAACTTGACCCAACTGAAT-3′；R：5′-TTGTAAGCACGCTAAACTA-3′，引物由大連寶生物公司合成，擴增片段為241 bp。PCR擴增體系總體積為20μL：基因組DNA模板2μL，上下游引物各1μL，Taq PCRMasterMix 10μL，ddH2O 6μL。PCR擴增程序：95℃預變性3min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存，并采用1%瓊脂糖凝膠對其進行擴增結果檢測。

取3μL的PCR產物，加入7μL變性上樣緩沖液（0.025%溴酚藍、98%去離子甲酰胺、10mmol/L EDTA、0.025%二甲苯氰），98℃變性10min后再立即冰浴10 min。將變性后的PCR產物點樣至10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上（Acr∶Scr=39∶1），160V電壓室溫電泳2～3 h。結束后用銀染法染色，確定PCR產物的基因型。PCR擴增產物經過SSCP確定基因型后，用試劑盒回收，對于純合子PCR產物送北京華大公司測序。對于雜合子個體，則參照Hu等［7］介紹的方法處理。

1.3 統(tǒng)計分析

使用BioEdit和Lasergene軟件分析測序峰圖并判斷突變位點及突變方式。利用Popgene32軟件計算出TLR6基因不同突變位點的等位基因頻率、基因型頻率、有效等位基因數(shù)（Ne）、遺傳雜合度（He）和多態(tài)信息含量（PIC），并對該位點基因型進行Hardy-Weinberg平衡檢驗及核苷酸序列的比對分析。

2 結果與分析

2.1 中國荷斯坦牛TLR6基因PCR擴增

對303頭荷斯坦牛的DNA樣品擴增后，經1%瓊脂糖凝膠（100V，30min）電泳檢測后均得到一條如圖1所示的特異性好、條帶清晰、長度約241 bp的PCR產物，且與預期目的片段大小一致?？梢杂糜赟SCP檢測。

圖1 荷斯坦牛TLR6基因PCR擴增產物檢測結果

2.2 中國荷斯坦牛TLR6基因PCR-SSCP檢測及序列測定分析

荷斯坦牛TLR6基因擴增序列區(qū)域共檢測到2種等位基因A和B，形成AA、BB、AB三種基因型（圖2），其中等位基因A和B均具有純合型個體。PCR產物純化后的測序結果顯示，擴增片段長度為241 bp，在GenBank中基因引物擴增區(qū)域核苷酸序列與牛TLR6基因序列的同源性為97%以上，這表明擴增產物的確為荷斯坦牛TLR6基因，而不是其他的TLR6基因。與普通牛TLR6基因（GenBank no.NM_001001159）序列對比發(fā)現(xiàn)，在擴增區(qū)域的209 bp處發(fā)生了堿基G→A的堿基突變（如圖3），使編碼蛋白質的氨基酸由酸性天冬氨酸（Asp）變?yōu)闃O性中性天冬酰胺（Asn）（如圖4）。

圖2 荷斯坦牛TLR6基因第3外顯子部分序列PCR產物SSCP檢測結果

圖3 荷斯坦牛和普通牛TLR6等位基因序列比對

圖4 荷斯坦牛和普通牛TLR6基因氨基酸序列比對

2.3 遺傳參數(shù)分析

統(tǒng)計分析結果表明，等位基因A和B的頻率分別為0.546 2和0.453 8，基因型AA、BB和AB的頻率分別為0.214 5、0.122 1和0.663 4。有效等位基因數(shù)（Ne）、遺傳雜合度（He）、純合度（Ho）和多態(tài)信息含量（PIC）分別為1.983 1、0.663 4、0.336 6和0.372 9。PIC介于0.25和0.5之間，屬中度多態(tài)。經χ2適合性檢測表明，荷斯坦牛在該位點已偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.05）。

3 討論

近年來，國內外對TLR6基因的多態(tài)性報道相對較少。Kesh等［8］和Pierik等［9］在人的TLR6基因中共發(fā)現(xiàn)了4個SNPs。Opsal等［10］在挪威紅牛TLR6基因中發(fā)現(xiàn)了1個SNP。Shinkai等［11-12］在豬的TLR6基因中發(fā)現(xiàn)了11個SNPs。儲明星等［6］在荷斯坦牛TLR6基因中檢測到6個SNPs。魏麟等［13］在豬的TLR6基因中檢測到1個SNPs。Xiao［14］等在廣東人TLR6基因中發(fā)現(xiàn)了1個SNPs。

本研究在中國荷斯坦牛TLR6基因擴增序列區(qū)域檢測到G→A錯義突變，引起第70位非極性酸性天冬氨酸（Asp）變?yōu)闃O性中性天冬酰胺（Asn）。蛋白質的結構決定其功能，由于編碼蛋白質活性中心的大多數(shù)氨基酸殘基為非極性的疏水氨基酸，這些小基團位置的變化，很有可能改變該蛋白質的活性中心構象，甚至空間構象，因而會進一步影響其功能的發(fā)揮。但該研究中兩處發(fā)生替換的氨基酸的極性水平發(fā)生了改變，有可能導致其編碼蛋白質的高級結構發(fā)生改變，進而使荷斯坦牛的信號轉導、脅迫應答和免疫應答等的生理功能發(fā)生改變。

在遺傳多態(tài)性分析中，可以將有效等位基因數(shù)（Ne）、遺傳雜合度（He）和多態(tài)信息含量（PIC）作為衡量某群體遺傳變異大小的指標，其中指標數(shù)值越大，遺傳變異越高，選擇的潛力就越大。該荷斯坦牛群體在該位點表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），該突變位點已偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.05），說明群體的遺傳變異較大，受到的選擇壓力相對較大，因此該位點可以作為荷斯坦牛泌乳性狀的分子標記位點。

［1］Buwitt-Beckmann U，Heine H，Wiesmüller K H，et al.TLR1-and TLR6-independent recognition of bacterial lipopeptides［J］.Journal of BiologicalChemistry，2006，281（14）：9049-9057.

［2］Jack C S，Arbour N，Manusow J，et al.TLR signaling tailors innate imune responses in humanmicrogliaand astrocytes［J］.The Journalof Immunology，2005，175（7）：4320-4330.

［3］Abrahams V M，Aldo P B，Murphy S P，et al.TLR6 modulates first trimester trophoblast responses to peptidoglycan［J］.The Journal of Immunology，2008，180（9）：6035-6043.

［4］McGuire K，JonesM，Werling D，etal.Radiation hybridmapping of all 10 characterized bovine Toll-like receptors［J］.Animal Genetics，2006，37（1）：47-50.

［5］李強子，朱國強，劉吳鑫，等.荷斯坦牛TLR6基因CDS區(qū)的生物信息學分析［J］.江蘇農業(yè)學報，2016，32（3）：608-614.

［6］儲明星，李春苗，石萬海，等.荷斯坦母牛TLR6基因多態(tài)性及其與體細胞評分關系的研究［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2009，40（11）：1621-1629.

［7］Hu J，Zhou H，Smyth A，et al.Polymorphism of the bovine ADRB3 gene［J］.Molecular Biology Reports，2010，37（7）：3389-3392.

［8］Kesh S，Mensah N Y A A，Pelerlongo P，et al.TLR1 and TLR6 polymorphisms are associated with susceptibility to invasive aspergillosis after allogeneic stem cell transplantation［J］.Annals of theNew York Academy ofSciences，2005，1062（1）：95-103.

［9］Pierik M，Joossens S，Van Steen K，et al.Toll-like receptor-1，-2，and-6 polymorphisms influence disease extension in inflammatory boweldiseases［J］.Inflamm BowelDis，2006，12（1）：1-8.

［10］Opsal M A，V?ge D I，Hayes B，et al.Genomic organization and transcript profiling of the bovine toll-like receptor gene cluster TLR6-TLR1-TLR10［J］.Gene，2006，384：45-50.

［11］ShinkaiH，Muneta Y，Suzuki K，etal.Porcine Toll-like receptor 1，6，and 10 genes：complete sequencing of genomic region and expression analysis［J］.Mol Immunol，2006，43（9）：1474-1480.

［12］Shinkai H，Tanaka M，Morozumi T，et al.Biased distribution of single nucleotide polymorphisms（SNPs）in porcine Toll-like receptor 1（TLR1），TLR2，TLR4，TLR5，and TLR6 genes［J］.Immunogenetics，2006，58（4）：324-330.

［13］魏麟，陳斌，黎曉英，等.豬TLR6基因Msp I多態(tài)性與生長性狀相關性研究［J］.中國農學通報，2011，27（11）：5-9.

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Polym orphism of TLR6Gene in Chinese Holstein Cattle

Zhou Xiumin，LiQiangzi，Zhang Li，etal
（Collegeof Life Scienceand Engineering,NorthwestUniversity forNationalities,Lanzhou 730030,China）

Inorder tostudy thepolymorphism of TLR6gene in Holstein cattle,theblood samplesof303Holstein cattleweredetected bypolymerasechain reaction-singlestrand conformation polymorphism（PCR-SSCP）.The resultsshowed thattherewasamissense mutation ofG to A in the TLR6 gene,which led to the change ofaspartic acid to asparagine in the TLR6 protein,producing three genotypes（AA，BB，AB）with the frequenciesof0.2145，0.122 1and 0.663 4 respectively.Theχ2testindicated thatthegeneat this sitedeviated from Hardy-Weinbergequilibrium（P＜0.05）.Itwasconcluded that thepolymorphism of TLR6 genewas rich and the locuscould beused asamolecularmarker for resistancebreedingofHolstein cattle.

Holstein cattle；TLR6 gene；polymorphism

S826.2

A

2095-3887（2017）01-0001-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.01.001

2016-10-30

西北民族大學引進人才科研項目（xbmuyjrc201316）；西北民族大學生命科學與工程學院眾創(chuàng)空間扶持項目

周秀敏（1996-），女，在讀本科生。

作者通信：張麗，Email：shiningstar2013@sina.cn