右歸飲對去卵巢血管鈣化大鼠NMDAR1蛋白表達的影響*

黎波　龔向京　何虹材　況珊　楚瑞閣#

（1江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院南昌330006；2江西中醫(yī)藥大學2014級碩士研究生南昌330004；3江西中醫(yī)藥大學2013級碩士研究生南昌330004）

·論著·

右歸飲對去卵巢血管鈣化大鼠NMDAR1蛋白表達的影響*

黎波1龔向京1何虹材2況珊3楚瑞閣1#

（1江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院南昌330006；2江西中醫(yī)藥大學2014級碩士研究生南昌330004；3江西中醫(yī)藥大學2013級碩士研究生南昌330004）

目的：觀察右歸飲對去卵巢血管鈣化中谷氨酸受體變化的影響。方法：將40只遠交群雌性大鼠（sprague dawley，SD）隨機分為假手術組、模型組、低劑量組、高劑量組和辛伐他汀組，采用皮下注射華法令加維生素D3制備血管鈣化模型，造模后，低劑量組、高劑量組分別給予右歸飲濃縮液5.35 g/（kg·d）和16.05 g/（kg·d）灌胃，辛伐他汀組給予辛伐他汀混懸水溶液5.25 mg/（kg·d）灌胃，假手術組和模型組給予等量生理鹽水，共12周；實驗結束時采集血漿標本測定雌二醇及血脂四項，采用蘇木精-伊紅染色法（HE染色）觀察動脈鈣化的情況，并采用免疫印跡試驗檢測N-甲基-D-天門冬氨酸受體（NMDAR，NR）1蛋白的表達。結果：模型組大鼠雌二醇、甘油三酯含量和NR1蛋白表達降低，P＜0.05，低密度脂蛋白升高，P＜0.05；高劑量組和低劑量組雌二醇、甘油三酯含量升高，NR1蛋白表達增加，P＜0.05；高劑量組、低劑量組和辛伐他汀組低密度脂蛋白的含量降低，P＜0.05；辛伐他汀組雌二醇無變化，P＞0.05。結論：右歸飲可抑制大鼠去卵巢血管鈣化的形成，可能與提高雌激素水平和NR1蛋白的表達有關。

血管鈣化；去卵巢；右歸飲；NMDAR1；蛋白表達

血管鈣化是指鈣磷在血管壁的異常沉積，常發(fā)生在血管內膜和中膜層，是動脈粥樣硬化的獨立危險因素，其發(fā)生機理與血管平滑肌、內皮細胞、骨髓間充質干細胞以及造血干細胞相互作用，激活內皮損傷修復過程中相關骨形成相關信號有關，導致血管鈣化的發(fā)生，目前認為血管鈣化是一個類似于骨形成的主動、可逆轉且可被調節(jié)的生物學過程［1～3］。在骨形成過程中，骨細胞通過谷氨酸信號介導類似中樞神經內長時程增強或抑制作用，在分子水平表現為“N-甲基-D-天門冬氨酸受體”（N-methyl-D -aspartate Receptor，NMDAR，NR）的激活和鈣內流，并介導增加和/或激活“突觸”后膜上或者相關聯系細胞的“α-氨基-3羥基-5甲基-4異惡唑受體”（Alpha-Amino-3-Hydroxy-5-Methyl-4-Isoxazolepropionic Acid Receptor，AMPAR），隨之增加受體的活性和谷氨酸介導的生理活性［4］。為了明確血管鈣化過程中谷氨酸信號中NR1的作用以及右歸飲對其的作用，本研究建立了去卵巢血管鈣化大鼠模型并以右歸飲干預，以明確NR1蛋白的表達情況以及相關指標的變化?，F報告如下：

1　材料與方法

1.1實驗動物無特定病原體（Specific pathogen Free，SPF）SD雌性大鼠40只，體重200～250 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（湘）2011-0003。

1.2試驗藥物及制備右歸飲：熟地黃9 g，炒山藥6 g，山茱萸3 g，枸杞6 g，炙甘草6 g，杜仲6 g，肉桂6 g，制附子9 g，按要求制備成生藥濃度為1.594 g/ml的溶液，4℃保存?zhèn)溆茫?0%的華法令注射液：華法令（sigma，BJ121010351A，CAS號129-06-6），精密稱取6 g華法令，加生理鹽水200 ml，混勻至清澈透明，密閉，4℃避光保存?zhèn)溆茫痪S生素K1注射液（國藥準字H41021051）；維生素D3注射液（國藥準字H31021259）；辛伐他汀片（國藥準字H20083839）；辛伐他汀水溶液混懸劑的制備（濃度0.8 mg/ml）：稱取羧甲基纖維素鈉2.5 g，另取注射用水250 ml置于500 ml燒杯中，逐步加入羧甲基纖維素鈉粉劑，放入磁力攪拌器攪拌90 min，若液體中有少許絮狀物，超聲處理10 min，使成透明溶液，另外將辛伐他汀片20片研細，置小燒杯中，加入注射用水20 ml，搖勻，將該容易加入羧甲基纖維素鈉溶液中，超聲處理10 min，使成白色均勻的混懸液，補足注射用水至500 ml，搖勻，密閉，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3試劑與儀器

1.3.1試劑NR1兔抗多克隆抗體（博士德生物，批號BA0612）100 KD；抗β-Actin鼠單克隆抗體（博士德生物）；SDS-PAGE凝膠配置試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號P0012A）。

1.3.2儀器均漿器，離心機，凝膠成像系統（美國UVP公司），全自動顯微鏡系統（德國Leica公司）。

1.4模型制備將SD雌性大鼠雙側去卵巢，飼養(yǎng)1周后，參考文獻［5］制作血管鈣化模型，均給予維生素K115 mg/（kg·d），皮下注射至第6天；第3天開始，血管鈣化模型組另給予皮下注射維生素D330× 105U/（kg·d）至試驗第5天和背部皮下注射華法令注射液150 mg/kg，q12 h至第6天，試驗第7天造模完成。

1.5動物分組及處理將40只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、低劑量組、高劑量組和辛伐他汀組，每組8只。給藥劑量參照文獻［6］，造模結束后給予藥物干預，共12周，其中假手術組和模型組給予相同體積生理鹽水灌胃，1次/d；低劑量組和高劑量組給予右歸飲溶液，按低劑量5.35 g/（kg·d），高劑量組16.05 g/（kg·d）給予灌胃。辛伐他汀組給予辛伐他汀水溶液混懸劑5.25 mg/（kg·d）灌胃［7］。均于第12周后，給予2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉（40 mg/kg）后開胸，心臟采血并獲取主動脈到髂動脈組織。

1.6觀察指標及方法

1.6.1血清和血漿標本的采集檢測雌二醇（E2）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL），由江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢測中心檢測。

1.6.2病理切片沿胸主動脈上段同一部位取材約10 mm，置于10%多聚甲醛溶液中固定；石蠟包埋制成經主動脈橫徑的石蠟切片，連續(xù)切片4 μm厚，HE染色觀察主動脈病變情況。

1.6.3免疫印跡試驗檢測NR1蛋白的表達另取余下胸主動脈髂動脈組織，用PBS沖掉殘留在動脈腔和表面的血液，迅速置于經DEPC處理過的1.5 ml離心管中，凍存于-80℃的冰箱中，用于免疫印跡試驗的檢測。按試劑盒要求提取蛋白并測定蛋白濃度之后，取相同份量的蛋白用7.5%SDS-PAGE凝膠電泳分離后，用電轉移法將蛋白質從SDS-PAGE凝膠轉移至PVDF膜上，再用5%的脫脂奶粉在冰箱中封閉2 h后，依次加兔抗鼠一抗及抗兔二抗，孵育洗滌后采用化學發(fā)光法檢測相關蛋白。凝膠成像分析系統進行灰度值掃描分析，灰度比（GSR）=（測得NR1強度×面積）/（內參蛋白β-Actin強度×面積），即NR1/actin灰度比值。

1.7統計學分析采用SPSS12.0統計軟件包進行數據分析，計量數據以（±s）表示，各組數據間的比較采用單因素方差分析。

2　結果

2.1各組動脈形態(tài)學改變假手術組血管內皮細胞連接緊密、完整，內膜無增厚，中膜平滑肌細胞排列規(guī)則，分布均勻，未見泡沫細胞、鈣化組織和軟骨樣組織；模型組血管大體可見整個主動脈節(jié)段性分布鈣化灶，呈環(huán)形，質地較脆硬，HE染色可見血管內膜完整性消失，內膜下可見多核細胞以及軟骨樣細胞呈現鋪路石樣或線狀排列，血管壁內膜下組織變性多向管腔隆起，沿著血管壁散在分布數個成簇樣骨樣堆積，病灶部位中膜結構消失，間有壞死物沉積，偶見病灶部位增殖性血管。右歸飲干預高、低劑量組均可見內膜下少量多核細胞以及軟骨樣細胞呈現鋪路石樣或線狀排列，血管壁內膜下組織變性明顯減少，可見少許成簇樣骨樣堆積物（1～2個），病灶部位中膜結構扭曲或者擠壓，管腔隆起較少。而辛伐他汀組血管鈣化與模型組形態(tài)大體一致。

2.2各組大鼠血清雌二醇含量比較模型組雌二醇含量下降明顯，差異明顯，P＜0.05；高劑量組和低劑量組雌二醇的含量升高，糾正去卵巢后體內雌二醇的含量，與模型組比較，差異明顯，P＜0.05；辛伐他汀組雌二醇含量并未升高，與模型組比較，無顯著性差異，P＞0.05。見表1。

表1　各組大鼠血清雌二醇含量比較（pg/ml，±s）

表1　各組大鼠血清雌二醇含量比較（pg/ml，±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別n雌二醇假手術組模型組低劑量組高劑量組辛伐他汀組88888 762.29±283.35 235.04±89.32*430.91±87.08#*477.10±87.04#252.71±65.98*

2.3各組大鼠血清血脂含量比較模型組TG下降、LDL升高，與假手術組比較，具顯著差異，P＜0.05；高劑量組TG升高，P＜0.05；高劑量組、低劑量組以及辛伐他汀組LDL含量下降，P＜0.05；TC和HDL在各組含量比較無明顯差異，P＞0.05。見表2。

表2　各組大鼠血清血脂含量比較（mmol/ml，±s）

表2　各組大鼠血清血脂含量比較（mmol/ml，±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別nTCTGLDLHDL假手術組模型組低劑量組高劑量組辛伐他汀組88888 2.36±0.59 2.15±0.28 1.90±0.31 1.97±0.47 1.88±0.26 2.06±0.85 1.19±0.35*1.25±0.66 1.96±0.26#1.53±0.80 1.41±0.41 1.97±0.59*1.09±0.37#1.25±0.37#0.93±0.29#*0.96±0.48 0.84±0.37 0.55±0.18 0.72±0.17 0.65±0.18

2.4各組大鼠動脈硬化NR1蛋白表達比較模型組灰度明顯下降，提示NR1蛋白表達減低，有顯著差異，P＜0.01；高劑量組和低劑量組NR1蛋白表達升高，有顯著差異，P＜0.01。見表3。

表3　各組大鼠血管組織NR1蛋白GSR的比較（±s）

表3　各組大鼠血管組織NR1蛋白GSR的比較（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別nGSR假手術組模型組低劑量組高劑量組辛伐他汀組88888 0.235 2±0.024 6 0.060 8±0.003 8*0.112 2±0.007 6#*0.211 5±0.016 6#*0.057 0±0.004 6*

3　討論

在血管鈣化過程中，炎癥反應、雌激素及血脂代謝等均影響其進程，而谷氨酸信號又介導類似中樞神經內長時程增強或抑制作用，促使局部鈣磷沉積的擴大化。谷氨酸受體（glutamate receptors，GluRs）可分為離子型谷氨酸受體和代謝性受體兩類，其中NR屬于配體門控離子通道復合物，包括NR1、NR2A-2D和NR3三種亞型，均以異源性蛋白的多聚體形式存在［8］；NR激活可致Na+和Ca2+內流，K+外流。NR屬于配體門控離子通道，是由不同的亞單位組成的四聚體或五聚體，編碼這些亞單位的基因屬3個家族：NR1、NR2（包括NR2A-D）和NR3（包括NR3A-B）。局部細胞NR是以NR1與一個或一個以上NR2和/或NR3亞基聚合的復合體。多受體亞基的復合體連同多種受體復合物成分并存的事實可以產生巨大谷氨酸受體功能多樣性，并允許單一激動劑谷氨酸分別激活不同信號通路［9～11］，其中NR1是功能單位，NR2是調節(jié)單位。單獨的NR2或NR3不形成功能性受體，只能和NR1聚合形成功能性聚合物，由不同亞單位組成的受體往往表現出不同的生理和藥理學特性。NR主要是由NRl和NR2亞基構成的四聚體復合物。NRl是NR受體的基本亞基，是實現通道的功能所必須的，NR2起輔助NR形成多元化結構的作用。構成NR的亞基組織成2個雙體（dimerofdimers），而受體的裝配主要由亞基的N-端決定。NR1、NR2a和NR2b可以組成同源二聚體，這種同源二聚體也存在于由NR1和NR2構成的雜合NR中［12～13］。

對于血管鈣化過程中谷氨酸信號的研究極少，最初的工作只是表明腦血管內皮細胞和心肌細胞表達有代謝型谷氨酸受體的表達［14～15］，進一步研究證明腦血管內皮細胞不但表達有Ⅰ型mGluR，而且具有抑制損傷引起的凋亡，通過mGluR維持膜不對稱性抑制微血栓的形成［16～18］。另外，在腦膜微血管中存在mGluR1、mGluR2/3、mGluR4a、mGluR5和mGluR7［19］。本研究發(fā)現大鼠血管組織存在NR1的蛋白表達，在血管鈣化組織中其含量明顯降低，補腎中藥右歸飲可以提高血管鈣化模型大鼠NR1蛋白表達水平并同時提高血清雌二醇含量，而且提高甘油三酯水平接近正常（與模型組比較差異明顯），而辛伐他汀組既不能升高血清雌二醇含量，也不能改善NR1水平，但對低密度脂蛋白在低于正常水平時還進一步降低其含量，說明他汀類藥物降脂具有單一方向性。這可能與右歸飲多重調節(jié)功能有關，而辛伐他汀只能單一降低血脂組份。

本研究觀察到去卵巢血管鈣化模型大鼠雌激素含量明顯下降，并伴有血清甘油三酯下降，與假手術組比較，P＜0.05，差異明顯，而膽固醇和低密度脂蛋白變化無差異。說明在此鈣化模型中血脂成分影響不大，而雌激素的下降可能充當一定的角色；中醫(yī)學理論認為“天癸”漸絕標志著腎虛證形成，而腎陽虛證涉及神經-內分泌-免疫和神經-內分泌-骨代謝兩大基因調控路線的紊亂［20］。女性原發(fā)性骨質疏松患者雌激素依腎氣虛證、腎陰虛證、腎陽虛證逐漸降低［21］，男性冠心病腎陽虛證雌二醇明顯降低［22］，表明雌激素缺乏后所表現的骨質疏松和冠心病等臨床證候與中醫(yī)的腎虛證密切相關。而雌激素缺乏可引起骨重建的偶聯失衡，進而影響鈣化進程，去卵巢大鼠可以在一定程度模擬雌激素缺乏的腎陽虛證。文獻報道［23］補腎中藥可提高雌激素等性激素水平以及性腺雌激素受體含量［24～25］。本次實驗發(fā)現，去卵巢血管鈣化大鼠，雌激素水平下降明顯，而補腎中藥右歸飲可以提高雌二醇并改善NR1蛋白表達。提示右歸飲對于腎虛血管病變具有一定的作用，在一定程度上驗證了腎主骨生髓的理論。眾所周知，雌激素缺乏會導致高代謝骨量丟失從而誘發(fā)骨質疏松，同時也發(fā)現雌激素缺乏大量并存血管鈣化的現象，并與冠心病相關［26］，這種現象尚不能用“骨生長漂移學說”合理解釋。因此，本實驗推測，異位組織骨形成再現的血管鈣化，應該存在一個更加精細的鈣沉積平衡紊亂的適應性調節(jié)，這也許跟有谷氨酸信號通路中NR1聚合體的改變有關，這有待于進一步的定位實驗來驗證。

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Influence of Youguiyin on Expression of NMDAR1 Protein in the Vascular Calcification of Ovariectomized Rats

LI Bo1，GONG Xiang-jing1，HE Hong-cai2，KUANG Shan3，CHU Rui-ge1#
（1The Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang330006；2 2014 Master's Graduate of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang330004；3 2013 Master's Graduate of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang330004）

Objective:To observe the influence of Youguiyin on the changes of glutamate receptors in the vascular calcification of variectomized rats.Methods:Forty SD rats were allocated into the sham operation group，model group，low-dose group，high-dose group and simvastatin group.After the artery calcification models were established by subcutaneously injecting warfarin and vitamin D3，the low-dose group and high-dose group were gavaged with concentrated solution of Youguiyin by 5.35 g/（kg·d）and 16.05 g/（kg·d），the simvastatin group was gavaged with suspensions of simvastatin by 5.25 mg/（kg·d），and the sham operation group and model group were given equal amount of physiological saline，all for 12 weeks.At the end of the experiment，collected plasma samples for the determination of estradiol and serum lipids in four，observed the arterial calcification by hematoxylin and eosin staining method（HE staining），and used the immune blotting to detect the expression of N methyl D aspartic acid receptor（NMDAR，NR）1 protein.Results:The estradiol，triglyceride content and NR1 protein expression of the model group were decreased，P＜0.05，and the low density lipoprotein was elevated，P＜0.05.The estradiol，triglyceride content and NR1 protein expression of the high dose group and low dose group were decreased，P＜0.05. And in the high dose group，low dose group and simvastatin group，the low density lipoprotein content were decreased，P＜0.05.There was no change in the estradiol of the simvastatin group，P＞0.05.Conclusion:Youguiyin can inhibit the formation of vascular calcification in the ovariectomized rats；it may be related to the increases of the levels of estrogen and the expression of NR1 protein.

Vascular calcification；Ovariectomized；Youguiyin；NMDAR1；Protein expression

R363

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2015.12.001

2015-09-18）

江西省科技支撐計劃（編號：20112BBG70033）；江西省自然科學基金（編號：20114BAB205082）

楚瑞閣，E-mail：384861926@qq.com