基于COS Marker分析柑橘屬及其近緣、遠(yuǎn)緣屬植物的遺傳與進(jìn)化

王炯，龔桂芝，彭祝春，李一兵，王艷杰，洪棋斌

（西南大學(xué)柑桔研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所/國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712）

基于COS Marker分析柑橘屬及其近緣、遠(yuǎn)緣屬植物的遺傳與進(jìn)化

王炯，龔桂芝，彭祝春，李一兵，王艷杰，洪棋斌

（西南大學(xué)柑桔研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所/國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712）

【目的】研究柑橘屬及其近緣、遠(yuǎn)緣屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，為柑橘類果樹的遺傳和進(jìn)化關(guān)系提供新的視點，也為遺傳育種以及種質(zhì)資源深入的收集、保護(hù)及評價利用提供新工具和參考。【方法】下載Phytozome網(wǎng)站公布的全部克里邁丁Conserved ortholog sequences，并在NCBI中與測序甜橙序列比對，獲得具有Gap的序列，從中設(shè)計60對COS引物，篩選并利用多態(tài)性標(biāo)記對柑橘屬及其近緣、遠(yuǎn)緣屬植物進(jìn)行擴增檢測，通過Structure、PowerMarker和GenAlEx等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?！窘Y(jié)果】從設(shè)計引物中篩選出譜帶清晰、穩(wěn)定性好、具有多態(tài)性且分布在柑橘不同連鎖群的引物25對，對45份柑橘屬及其近緣、遠(yuǎn)緣屬種質(zhì)資源進(jìn)行擴增檢測，共得到584條譜帶，平均每對引物約為23.36條；基因多樣性為0.26—0.88，平均0.49；PIC為0.26—0.87，平均0.48。群體遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示，在K=9時，群體結(jié)構(gòu)圖清晰地揭示了柑橘屬及其近、遠(yuǎn)緣屬植物間的遺傳組成關(guān)系，可區(qū)分為寬皮柑橘類群、柚類群、枸櫞類群、大翼橙類群、金柑類群、枳及澳沙檬澳圓檬類群、花椒類群、黃皮酒餅簕九里香類群以及印度野橘和莽山野柑雜合類群，類群關(guān)系與聚類分析結(jié)果總體比較一致。UPGMA聚類分析顯示，COS Marker能夠明確地區(qū)分柑橘屬及其近緣、遠(yuǎn)緣屬種質(zhì)資源，柑橘屬在較高分類層次與金柑屬、枳屬、澳沙檬屬、澳圓檬屬、花椒屬以及黃皮、酒餅簕、九里香等近、遠(yuǎn)緣植物分離；在柑橘屬內(nèi)，枸櫞和大翼橙類首先聚類，然后與寬皮柑橘、柚類等其他柑橘屬植物聚類；寬皮柑橘類群里，道縣野橘、岑溪酸橘等半野生寬皮柑橘與椪柑等栽培寬皮柑橘可以明確區(qū)分，而莽山野柑和印度野橘不在本類群?！窘Y(jié)論】根據(jù)甜橙和克里邁丁基因測序信息設(shè)計的COS引物，在柑橘近緣、遠(yuǎn)緣屬植物中均能獲得有效擴增，能夠有效區(qū)分柑橘屬及其近緣、遠(yuǎn)緣屬種質(zhì)資源；莽山野柑和印度野橘的遺傳組成表現(xiàn)雜合，聚類分析中與寬皮柑橘距離比較遠(yuǎn)，可能并非寬皮橘類群最原始類型。

柑橘；COS Marker；親緣關(guān)系；種質(zhì)資源；遺傳與進(jìn)化

0 引言

【研究意義】蕓香科有約150屬900余種植物，進(jìn)化層次差異大，地域分布范圍廣，既有栽培價值高、種類豐富、進(jìn)化程度高的柑橘屬，也有種類相對單一的枳屬、澳沙檬屬等，以及進(jìn)化層次較低的黃皮、九里香等。由于無融合生殖、屬種間易于雜交、無性變異、栽培歷史悠久等影響，學(xué)術(shù)界對柑橘的分類及系統(tǒng)演化關(guān)系并未形成被廣泛接受的結(jié)論。通過開發(fā)新標(biāo)記，開展柑橘屬及其近、遠(yuǎn)緣屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究，闡明其親緣及進(jìn)化關(guān)系，將為柑橘類果樹的遺傳和進(jìn)化關(guān)系提供新的視點，也為遺傳育種以及種質(zhì)資源深入的收集、保護(hù)及評價利用提供新工具和有價值的參考。【前人研究進(jìn)展】SWINGLE和REECE[1]根據(jù)雄蕊的數(shù)目和汁胞構(gòu)造將多蕊橘屬、澳沙檬屬、澳指檬屬、枳屬、金柑屬以及柑橘屬等6屬植物歸為真正柑橘類果樹，并將柑橘屬劃分為16個種，形成了一個比較有影響力的柑橘分類系統(tǒng)。BARRETT和RHODES[2]采用更多的形態(tài)性狀進(jìn)行數(shù)值分析，提出SWINGLE分類的柑橘亞屬中只有柚、枸櫞和寬皮柑橘3個真正生物學(xué)種，其余都是雜種起源或后生變異類型。分子標(biāo)記對研究柑橘及近緣屬親緣關(guān)系提供了新的技術(shù)和視角。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，不同的分子標(biāo)記技術(shù)不斷開發(fā)出來，并被廣泛應(yīng)用到柑橘及近緣屬的分類和種質(zhì)資源鑒定等研究中。RFLP、RAPD、AFLP[3-4]、SSR[5-6]、ISSR[7]、SRAP[8]等標(biāo)記在柑橘的分類、種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性分析中得到應(yīng)用。分子標(biāo)記在研究柑橘及近緣屬親緣關(guān)系中，得到了與BARRETT和RHODES[2]性狀數(shù)值分類法相一致的結(jié)論，如柑橘屬由柚類、枸櫞和寬皮橘3個種構(gòu)成，但也提出了許多不一致的論斷。例如，當(dāng)使用不同的分子標(biāo)記和聚類策略時，金柑屬與柑橘屬的聚類結(jié)果有很大的變化，有支持金柑屬獨立地位的[4,9]，也有認(rèn)為金柑屬從屬于柑橘屬的[3,10]。導(dǎo)致不一致的原因，既與研究采用材料的代表性和全面性有關(guān)，也受到所采用的分子標(biāo)記本身的影響。RFLP標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，但操作復(fù)雜、費用高，難以對眾多代表性資源類型獲得大量廣泛覆蓋的標(biāo)記；AFLP標(biāo)記為顯性標(biāo)記，有成簇聚集在基因組部分區(qū)域的傾向；RAPD理論上能夠覆蓋全部基因組，但其同樣為顯性標(biāo)記，穩(wěn)定性和產(chǎn)物的檢測和解讀存在不足；SSR標(biāo)記比較高效穩(wěn)定，但在遺傳背景差異大時，難以確定其差異的系譜來源的一致性，進(jìn)而影響對親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的資源類型的相互關(guān)系的準(zhǔn)確判斷。COS Marker 是基于保守直序同源序列Conserved ortholog sequence（COS）開發(fā)的一種比較新型的分子標(biāo)記。COS概念首次由FULTON等[11]提出，通過對擬南芥基因組序列和番茄EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行計算比對，共鑒別出大約130 000個長度大于 1 000 bp的 EST序列，將其命名為Conserved ortholog sequence（COS），據(jù)此設(shè)計COS引物并成功應(yīng)用于茄科植物的圖譜比較?！颈狙芯壳腥朦c】COS是高度保守且拷貝數(shù)低的基因序列，以PCR為基礎(chǔ)的COS Marker為親緣關(guān)系快速鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和基因組比較等提供了有效的工具，已在不同植物中得到迅速應(yīng)用，如松屬[12-13]、菊屬[14]、谷屬[15]、煙草屬[16]、薔薇屬[17]和蕓苔屬[18]等。而COS Marker在柑橘中的應(yīng)用尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于公布的柑橘基因組測序結(jié)果，開發(fā)一套分布于柑橘不同染色體的COS Marker，并將其運用到真正柑橘果樹類的 5個近緣屬植物和花椒、黃皮等5個遠(yuǎn)緣屬植物的分類和進(jìn)化關(guān)系研究。

1 材料與方法

試驗于 2015年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所進(jìn)行。

1.1 試驗材料

45份柑橘屬及其近、遠(yuǎn)緣屬材料（表1）均來源于國家果樹種質(zhì)重慶柑桔圃。

表1 用于COS Marker分析的45份材料Table 1 Forty-five Plant materials for COS Markers analysis

1.2 試驗方法

1.2.1 總 DNA的提取與檢測 采取試驗材料的新鮮幼嫩葉片帶回實驗室，清水洗凈表面，去除葉片主葉脈后稱取1.0 g，采用CTAB法提取DNA，參照文獻(xiàn)[5]并對其方法略做改動：研缽中加入少量PVPP與試驗材料一起研磨；CTAB溶液中加入體積分?jǐn)?shù)為0.2%的β-巰基乙醇；體積比為24∶1的氯仿/異戊醇抽提2次，第1次抽提時加入5 mol·L-1的醋酸鉀，冰上放置5 min后10 000 r/min離心10 min；預(yù)冷的異丙醇沉淀DNA；1/10體積4 mol·L-1醋酸鈉和2倍體積預(yù)冷的無水乙醇沉淀DNA。200 μL超純水溶解DNA，經(jīng)NanoDrop 2000微量紫外分光光度計檢測DNA濃度和 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測譜帶完整度后，配制擴增檢測的工作模板。

1.2.2 COS引物的開發(fā) 從Phytozome v10.0網(wǎng)站主頁的Citrus clementina v1.0中收集下載全部已知測序克里邁丁保守直序同源序列。為了提高所設(shè)計開發(fā)引物的多態(tài)性，在 NCBI（National Center for Biotechnology Information）上利用nucleotide blast將全部下載的克里邁丁保守直序同源序列與已知測序甜橙序列進(jìn)行比對，獲得在啟動子區(qū)或編碼區(qū)內(nèi)克里邁丁和甜橙具有一個或多個 Gap的保守直序同源序列275條。按目的序列應(yīng)滿足要求：Gap位置應(yīng)處于目的序列中；均勻分布在不同染色體上，且平均每條染色體上有6—7條目的序列，運用NCBI網(wǎng)站的Pick Primers來設(shè)計所有滿足目的序列要求的引物，且所設(shè)計開發(fā)的引物應(yīng)盡量保證其具有唯一性，從275條具Gap的序列中挑選并成功設(shè)計60對引物。

按照引物類型COS，染色體（Chromosome，C）編號以及在該染色體上的設(shè)計的引物序號進(jìn)行引物命名。1.2.3 COS引物的篩選及產(chǎn)物的檢測 開發(fā)的60對COS引物均委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行合成。應(yīng)用琯溪蜜柚、8號椪柑、梨橙2號、檸檬、金豆、飛龍枳、九里香、酒餅簕等8種代表性材料進(jìn)行COS引物篩選，從中篩選出譜帶清晰、穩(wěn)定性好、具有多態(tài)性且分布在不同連鎖群的25對COS引物。PCR反應(yīng)體系為優(yōu)化的 15 μL反應(yīng)體系：1×PCR Buffer，1.5 mmol·L-1的Mg2+，0.2 mmol·L-1的dNTPs， 0.33 nmol·L-1的上、下游引物，1 U的Taq DNA聚合酶，DNA模板約75 ng。

PCR擴增反應(yīng)在Biometra PCR儀上進(jìn)行。擴增程序: 94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，64℃退火40 s，72℃延伸45 s，每次循環(huán)降低0.5℃，10個循環(huán)；94℃變性45 s，58℃退火40 s，72℃延伸 40 s，22個循環(huán)；72℃延伸5 min；最后PCR產(chǎn)物4℃保存。

取PCR擴增產(chǎn)物2 μL上樣，8%非變性聚丙烯酰胺凝膠、恒定電壓140 V，電泳約2 h（根據(jù)目的片段大小，電泳時間長短略有調(diào)整），銀染檢測并照相。1.2.4 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)PCR擴增后電泳譜帶的有無及清晰程度，按照二倍體基因型格式讀取譜帶，之后根據(jù)相關(guān)分析軟件的要求作相應(yīng)格式的轉(zhuǎn)換。

應(yīng)用Structure軟件基于數(shù)學(xué)模型進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。設(shè)置MCMC（Markov Chain Monte Carlo）開始時內(nèi)循環(huán)burn-in迭代為10 000次，再將burn-in迭代后的MCMC設(shè)為20 000次，亞群數(shù)量（K）設(shè)置為2—10，每個K值運行10次，運行完畢后在每個K值中取Ln P(D)最大和最小兩個數(shù)值，分別繪制10個最大值和10個最小值的折線圖，找出拐點，并參考系統(tǒng)聚類分析結(jié)果來判定合適的亞群數(shù)，選出合適的K值。當(dāng)無明顯拐點時，參照并修改 EVANNO等[19]、強海平等[20]、劉志齋等[21]和GARCIA等[22]的△K算法選取合適的K值。

采用PowerMarker軟件進(jìn)行聚類分析，計算等位基因（Allele）、基因多樣性（Gene Diversity）、多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）。采用Nei’ 1983方法計算遺傳距離、UPGMA法聚類，并對結(jié)果500次bootstrap重復(fù)抽樣，利用MEGA繪制遺傳聚類圖。

運用GenAlEx軟件進(jìn)行主坐標(biāo)軸分析。

圖1 引物COSC1-12的COS Marker擴增結(jié)果Fig. 1 The COS Marker amplified profile using the primer COSC1-12

2 結(jié)果

圖2 不同K值對應(yīng)的Ln P(D)Fig. 2 Ln P(D) of different K values

2.1 COS遺傳多樣性及COS 引物的分析鑒定效果

用篩選的引物對45份試驗材料進(jìn)行擴增，均能擴增出穩(wěn)定的譜帶，范圍100—700 bp。25對引物獲得72個標(biāo)記位點，擴增出584條譜帶，平均每對引物約為23.36條。擴增譜帶最多的引物為COSC4-3，46條，COSC3-8擴增譜帶最少，10條。25對COS引物的平均 PIC為 0.48，變化范圍 0.26（COSC3-9）—0.87（COSC3-11），其中有11個COS引物的PIC≥0.50（表2）。針對所研究的45份試驗材料，其平均基因多樣性為0.49，變化范圍處于0.26（COSC3-9）—0.88（COSC3-11），其中COSC3-11的PIC和基因多樣性值最高，分別為0.87和0.88，COSC3-9的PIC和基因多樣性值則最低，均為0.26。表2為25對COS引物的遺傳多樣性統(tǒng)計結(jié)果。

根據(jù)電泳譜帶結(jié)果分析，COSC1-12引物能夠?qū)纳趁省膱A檬區(qū)分開（圖1）；COSC1-12和COSC3-7引物結(jié)合能夠?qū)⑺写笠沓阮愑行Х珠_；COSC2-8引物能夠有效區(qū)分黃皮、酒餅簕、九里香等遠(yuǎn)緣屬；COSC2-8和COSC3-7引物結(jié)合能夠?qū)?種金柑屬材料分開；COSC4-8引物能夠?qū)㈣讓賰煞N材料區(qū)分開；COSC4-9引物能夠?qū)?種柚類區(qū)分開；COSC9-8引物能夠?qū)⒒ń穼俚膬蓚€種類分離開。由于寬皮橘材料較多，一兩對引物不能有效區(qū)分，需結(jié)合多對引物才能達(dá)到滿意的分類效果。從聚類分析結(jié)果看，所篩選的引物能夠有效區(qū)分柑橘屬及近遠(yuǎn)緣屬。

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

將數(shù)據(jù)按照 Structure軟件數(shù)據(jù)處理要求進(jìn)行處理，找出拐點對應(yīng)的K值，發(fā)現(xiàn)在K=6、8、9時明顯出現(xiàn)拐點，參考UPMGA聚類分析結(jié)果，當(dāng)K=9時，所有材料分為9個類群是較為合適的。

圖3 Structure群體遺傳結(jié)構(gòu)分析圖Fig. 3 The population structure map of 45 materials

應(yīng)用Structure軟件得到的群體遺傳結(jié)構(gòu)圖（圖3）中，將45份材料分為9個類群，分別標(biāo)記為A、B、C、D、E、F、G、H、I，整體符合目前柑橘屬及其近、遠(yuǎn)緣屬的分類。晚白柚（1）、琯溪蜜柚（2）、嶺南沙田柚（3）構(gòu)成柚類一族（A），其遺傳組成單一；黃皮（41）、酒餅簕（42）、九里香（43）構(gòu)成遠(yuǎn)緣類群（B），黃皮和酒餅簕遺傳組成單一，而九里香與花椒屬（44、45）共有少量基因，顯示出它們之間可能有一定的親緣關(guān)系；花椒（44）和野花椒（45）構(gòu)成外類群（C），遺傳組成單一；野生香櫞（22）、合江佛手（23）、檸檬（24）、塔希提萊檬（25）作為枸櫞類組成一類（D），其中野生香櫞和合江佛手的遺傳組成無雜合現(xiàn)象，而檸檬和來檬則顯示有外緣基因滲入，與其明顯的雜種來源一致[23-24]；安江紅橘等寬皮柑橘和塔羅科血橙（20）、梨橙2號（21）等16個柑橘品種組成最多的一類（E），除甜橙、溫州蜜柑、印度酸橘、岑溪酸橘等明顯的雜種外，其余寬皮柑橘的遺傳組成未表現(xiàn)雜合現(xiàn)象；2個甜橙均顯示約3/4的寬皮橘基因以及1/4的其他基因來源，這與甜橙測序的分析結(jié)果比較一致[25]，但關(guān)于另1/4的其他基因來源則有不同；紅河大翼橙（26）、元江宜昌橙08-7（27）、

元江宜昌橙08-9（28）、金刀峽宜昌橙（29）、馬蜂柑（30）、馬來西亞大翼橙（31）構(gòu)成另一個柑橘屬類群（F），除馬來西亞大翼橙外，其余大翼橙的遺傳組成無雜合現(xiàn)象；金豆（32）、羅紋（33）、金彈（34）、羅?。?5）、四季橘（36）作為金柑屬組成一類（G），除四季橘顯示出有外緣基因滲入外，其余材料遺傳組成無雜合現(xiàn)象；莽山野柑（17）和印度野橘（18）單獨成為一類（H），與其他寬皮橘有較大差異，遺傳來源較為獨特，但二者的遺傳組成表現(xiàn)出雜合現(xiàn)象，印度野橘有較少量的枸櫞血緣，莽山野柑有較多的寬皮橘血緣，顯示二者可能有比較獨特的遺傳來源，但并非該類群最原始類型；近緣屬中的旺蒼大葉枳（37）、飛龍枳（38）與澳沙檬（39）、澳圓檬（40）組成一個類群（I），除澳沙檬、澳圓檬顯示極少的外緣基因外，遺傳組成也未表現(xiàn)雜合現(xiàn)象。

表2 COS引物及其揭示的遺傳多樣性統(tǒng)計Table 2 Summary of COS Markers and genetic diversity revealed

2.3 聚類分析

運用PowerMarker軟件對45份試驗材料聚類分析，構(gòu)建UPGMA聚類樹（圖4）。第一條分割線將材料分成A、B兩個類群：A類群為近遠(yuǎn)緣屬植物；B類群為柑橘屬植物。第二條分割線將柑橘屬及其近遠(yuǎn)緣屬進(jìn)一步劃分為C、D、E、F、G、H六個類群：C類群為外緣屬植物，包括黃皮（41）、酒餅簕（42）、九里香（43）、花椒（44）、野花椒（45）；四季橘（36）與其他金柑屬植物聚成D類群，但它與其他金柑屬植物遺傳距離較遠(yuǎn)，Structure群體遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示四季橘有金柑屬血緣并占主導(dǎo)地位，說明四季橘與金柑屬植物親緣關(guān)系較近；E類群為枳屬（37、38）和澳沙檬（39）、澳圓檬（40）構(gòu)成的近緣屬類群；枸櫞類植物和大翼橙類植物構(gòu)成F類群；G類群包括興津溫州蜜柑（12）、兩個甜橙（20、21）；H類群為柚類、寬皮柑橘類植物類群。第三條分割線將H類群進(jìn)一步劃分為H1、H2兩個類群：莽山野柑（17）、印度野橘（18）、柚類（1、2、3）構(gòu)成H1類群；其余寬皮橘構(gòu)成H2類群，在H2類群中，又可細(xì)分為以安江紅橘（4）、萬州少核紅橘（5）、砂糖橘（9）、土橘（6）等為代表的栽培種和以旺蒼皺皮柑（13）、細(xì)皮狗屎柑（14）等為代表的野生、半野生寬皮橘兩類。聚類分析結(jié)果顯示，COS Marker能夠明確的區(qū)分柑橘屬及其近、遠(yuǎn)緣屬種質(zhì)資源，并對成員眾多、關(guān)系復(fù)雜的寬皮類群進(jìn)行有效區(qū)分。

2.4 群體主坐標(biāo)軸分析

采用GenAlEx軟件基于遺傳距離數(shù)據(jù)對45份材料進(jìn)行的PCoA分析結(jié)果見圖5。可以看到在第一主坐標(biāo)軸區(qū)，顯示綠色方形部分的寬皮柑橘和藍(lán)色三角形部分甜橙類塔羅科血橙（20）、梨橙2號（21）關(guān)系較近；在第二主坐標(biāo)軸區(qū)，柚類和莽山野柑（17）、印度野橘（18）關(guān)系較近，與聚類分析結(jié)果一致；第三主坐標(biāo)軸區(qū)的紫色菱形部分的大翼橙類和黃色圓形部分的枸櫞類關(guān)系較近，聚類分析也顯示兩者有較近的親緣關(guān)系；第四主坐標(biāo)軸區(qū)的淺藍(lán)色部分的金柑屬聚在一起，四季橘（36）又遠(yuǎn)離于其他金柑屬，這與 Structure群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果、聚類分析結(jié)果一致；近遠(yuǎn)緣屬的枳屬（37—38）、澳沙檬（39）、澳圓檬（40）、黃皮（41）、酒餅簕（42）、九里香、（43）花椒屬（44—45）等與柑橘屬距離較遠(yuǎn)，與聚類分析結(jié)果一致。

3 討論

3.1 柑橘及其近、遠(yuǎn)緣屬植物的分離分化時間

一個比較明確的時間點對認(rèn)知植物的分類與進(jìn)化關(guān)系非常有價值。地質(zhì)事件和化石提供了比較準(zhǔn)確的分離分化時間估計[26]。在柑橘屬及其近、遠(yuǎn)緣屬植物起源和分布的“桶形”區(qū)域內(nèi)[1]，發(fā)生了古大陸的分離和漂移以及印度板塊與亞歐板塊碰撞而帶來喜馬拉雅運動等重大地質(zhì)事件，對柑橘屬及其近、遠(yuǎn)緣屬植物的分離分化和分布產(chǎn)生了重要影響，也為研究其分離分化提供了比較客觀的參考時間點。

本研究所采用的材料，按SWINGLE和REECE[1]的分類，包括了親緣關(guān)系很近的5個真正柑橘果樹類植物，也包括了關(guān)系較近、與真正柑橘類位于相同亞族（subtribe）的酒餅簕，還有與真正柑橘類位于相同亞科但不同族的黃皮和九里香，以及與真正柑橘類不同亞科的花椒和野花椒。這些材料中，采樣分析的遠(yuǎn)緣屬材料均來自中國，但花椒屬在世界范圍內(nèi)廣泛分布，九里香屬、黃皮屬和酒餅簕局限在中國、東南亞、澳大利亞等地，分布區(qū)域與真正柑橘類非常一致；5個近緣屬中，中國是柑橘屬的主要起源地，是金柑屬和枳屬的唯一起源地，而澳大利亞和新幾內(nèi)亞地區(qū)是澳指檬、澳沙檬和多蕊橘3個屬的唯一起源地。由于古大陸的分離和漂移而造成的廣闊海洋分隔，澳洲 3屬與中國的3屬以及九里香等遠(yuǎn)緣植物間難以完成遺傳物質(zhì)的交流，如果它們是同步由共同祖先分離分化并獨立演進(jìn)形成，反映到分支或聚類關(guān)系上，6個柑橘近緣屬植物應(yīng)該首先屬內(nèi)聚類，然后澳洲3屬與中國起源3屬各自聚類，再在近緣屬聚類后與其他遠(yuǎn)緣屬植物聚類。然而在本研究中各近、遠(yuǎn)緣屬卻展示了不同的遺傳一致性和聚類層次。

圖4 基于COS Marker數(shù)據(jù)構(gòu)建的UPGMA聚類樹（500次bootstrap檢驗）Fig. 4 An UPGMA tree of 45 different materials derived from bootstrap analysis (500 replications) of COS Marker data

采用COS Marker能夠?qū)⒏涕賹偌捌浣?、遠(yuǎn)緣屬植物進(jìn)行有效區(qū)分，但遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示枳屬和澳指檬屬與澳沙檬屬有非常一致的遺傳組成，黃皮、酒餅簕和九里香也顯示高度一致的遺傳組成；UPGMA聚類分析則顯示枳屬和澳指檬屬與澳沙檬屬在屬一級的分類中關(guān)系更近，它們先聚類后再與柑橘屬、金柑屬及其他屬構(gòu)成較高級分類單元，花椒、九里香、酒餅簕和黃皮等遠(yuǎn)緣植物彼此在分類上更接近。FEDERICI等[27]也得到類似結(jié)果，在其應(yīng)用RFLP數(shù)據(jù)進(jìn)行非雜種來源的材料聚類分析中，顯示枳屬與多蕊橘屬和澳指檬屬的M. warburgiana具有較近關(guān)系，它們先聚類后再與澳沙檬及澳指檬類型聚類；在應(yīng)用RFLP數(shù)據(jù)進(jìn)行所有材料聚類分析中，顯示枳屬與澳沙檬及多蕊橘屬和澳指檬屬的M. warburgiana聚類后，再與其他澳指檬類型聚類。

圖5 基于COS Marker數(shù)據(jù)的主坐標(biāo)軸分析圖Fig. 5 PCoA plot constructed with COS Marker data

枳屬與3個澳洲近緣屬有更近似的遺傳組成和親緣關(guān)系，超越與其有長期共同地域分布的柑橘屬和金柑屬的關(guān)系，一個重要的分類學(xué)意義就是表明枳屬與澳洲3近緣屬分離分化的時間應(yīng)該可能晚于它們與柑橘屬和金柑屬的分離分化。真正柑橘類的共同祖先可能是先分化形成柑橘屬原始類型、金柑屬原始類型以及枳屬與澳洲3近緣屬的共同原始類型，然后在長期的生殖隔離作用下，枳屬與澳洲3近緣屬的共同原始類型分別演化，形成了形態(tài)和適應(yīng)生境差異甚大的枳、澳沙檬和多蕊橘等類型。真正柑橘類的最近共同祖先在分化形成不同分支類型時，理論上應(yīng)該仍處于未完全割裂的陸地環(huán)境，花粉、種子或果實擴散能夠順利完成，對應(yīng)的大地質(zhì)背景應(yīng)該是中國所在的歐亞古陸與澳大利亞所在的岡瓦納古陸尚未徹底分離。從古植物學(xué)方面看，在歐洲早始新世到晚上新世的第三紀(jì)地層中就有大量花椒屬種子化石被發(fā)現(xiàn)，在北美早中新世也發(fā)現(xiàn)有該屬種子化石，在中國山東臨朐中新世地層曾報道有花椒屬的葉片化石。在廣東和廣西第四紀(jì)地層中找到黃檗屬及酒餅簕屬的葉片化石[28]。SWINGLE和REECE[1]曾認(rèn)為有充足的理由推測，澳沙檬是由澳指檬經(jīng)過2千萬至3千萬年的漫長干旱適應(yīng)演化形成，結(jié)合澳洲大陸分離的重大地質(zhì)事件和被子植物出現(xiàn)的時期，認(rèn)為真正柑橘類植物的產(chǎn)生應(yīng)該在6 500萬年前的晚白堊紀(jì)。

枳屬與澳洲3近緣屬的相似遺傳組成和相近親緣關(guān)系，以及地理分布特點和區(qū)域內(nèi)的地質(zhì)事件為估計真正柑橘類植物的分離分化提供了參考，而印度野橘和莽山野柑則為柑橘屬內(nèi)的分離分化提供了依據(jù)。印度野橘和莽山野柑是兩個地域來源明確、分布區(qū)域有限、遺傳特性獨特的野生原始柑橘種。前者分布在印度東北的阿薩姆邦區(qū)域，被認(rèn)為是栽培柑橘的原始類型[29-30]；而后者則分布在中國中部的湖南莽山區(qū)域，因其性狀的原始，也被認(rèn)為是寬皮柑橘的原始類型[31]。本研究中COS Marker能夠?qū)⒍哌M(jìn)行有效區(qū)分，但遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示二者有較高的相似性，且相似成分非常獨特，該成分僅在甜橙、檸檬、來檬等明顯雜種來源的其他類型中低比例出現(xiàn)，UPGMA聚類分析也顯示印度野橘和莽山野柑親緣關(guān)系比較近，超過與其他寬皮柑橘或枸櫞類的相近程度。分布區(qū)域遙遠(yuǎn)且其間橫亙了阻斷普通生物交流的喜馬拉雅山的兩個野生柑橘種，有近似的遺傳組成和親緣關(guān)系，表明其在起源上可能有獨特的關(guān)系。從地理上可知，印度東北的阿薩姆邦等區(qū)域?qū)嶋H上位于喜馬拉雅山南麓，本身是中國所在歐亞板塊的一部分，而非印度主體所在的印度板塊的組成部分，只是由于印度板塊向歐亞板塊的伏沖擠壓，強烈的“喜馬拉雅造山運動”，才被喜馬拉雅山分隔開來。印度野橘和莽山野柑可能是在其共同祖先的棲息地被“喜馬拉雅造山運動”分隔后，經(jīng)過第四紀(jì)冰川，才在各自現(xiàn)今的區(qū)域獨自演化為迄今的類型?！跋柴R拉雅造山運動”達(dá)到使普通生物交流困難的時段應(yīng)該可以作為印度野橘和莽山野柑的分離分化參考時間點，可能在2千萬年至3千萬年前。

3.2 莽山野柑、印度野橘與柑橘的起源

處于相對隔絕的地域，未受或少受人工選擇或栽培柑橘的影響，野生柑橘對柑橘及近緣屬的起源和進(jìn)化研究具有重要作用。莽山野柑和印度野橘是目前尚存但瀕危的野生柑橘，被認(rèn)為是栽培柑橘的原始類型[29-31]。廖振坤等[31]根據(jù)汁囊結(jié)構(gòu)、花粉壁的外壁雕紋特征比較及AFLP聚類結(jié)果顯示，莽山野柑是比道縣野橘更原始的類型，并且認(rèn)為南嶺山脈存在莽山野柑→道縣野橘→栽培種的寬皮橘的演化路徑。JOSE等[32]研究發(fā)現(xiàn)寬皮橘多達(dá)38個左右的indels，而莽山野柑僅具有4個indels，并且莽山野柑與宜昌橙之間僅有10%的異質(zhì)一致性，認(rèn)為莽山野柑與寬皮橘、宜昌橙親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但其聚類分析顯示莽山野柑與宜昌橙有較近的親緣關(guān)系，王福生等[33]也得到兩者具有較近的親緣關(guān)系的結(jié)果。而劉勇等[34]的SSR-AFLP聚類分析顯示莽山野柑與宜昌橙和大翼橙親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。MALIK[29]、LASKAR[35]等認(rèn)為印度野橘是最原始的柑橘類型，是柑橘栽培種的祖先之一。劉通等[8]的研究涉及莽山野柑與印度野橘，通過SSR-SRAP聚類分析顯示，在遺傳相似系數(shù)為0.725處，它們和柚類聚為一個分支，表明三者有較近的親緣關(guān)系。而FEDERICI[27]認(rèn)為印度野橘可能是卡西大翼橙或酸橙的雜種，但其RFLP和RAPD標(biāo)記則顯示印度野橘優(yōu)先與枸櫞聚類，NICOLOSI等[36]通過cpDNA聚類分析也顯示印度野橘和枸櫞優(yōu)先聚為一類。

本研究中的遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示莽山野柑和印度野橘有較為獨特的相似遺傳組成，但與其他寬皮橘存在較大差異。莽山野柑有近半的寬皮柑橘遺傳組成，且其遺傳組成表現(xiàn)雜合現(xiàn)象。而印度野橘則含有較少量的枸櫞血緣，這與FEDERICI等[27]、NICOLOSI等[36]結(jié)果類似。UPGMA聚類分析也顯示印度野橘與莽山野柑優(yōu)先聚類而遠(yuǎn)離其他寬皮橘和枸櫞等類型，與劉通等[8]SSR-SRAP聚類結(jié)果一致。因此筆者認(rèn)為莽山野柑和印度野橘是比較獨特原始的柑橘類型，但不應(yīng)該是寬皮柑橘的直接祖先。

4 結(jié)論

根據(jù)甜橙和克里邁丁基因測序信息設(shè)計的 COS引物，在柑橘近緣、遠(yuǎn)緣屬植物中均能獲得有效擴增，能夠有效區(qū)分柑橘屬及其近、遠(yuǎn)緣屬種質(zhì)資源。莽山野柑和印度野橘有獨特的遺傳組成，應(yīng)該是比較獨特的柑橘類型，其遺傳組成表現(xiàn)雜合現(xiàn)象，聚類分析中與寬皮柑橘距離比較遠(yuǎn)，應(yīng)該不是寬皮柑橘的直接祖先。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Genetic and Phylogenetic Relationships Among Citrus and Its Close and Distant Relatives Based on COS Marker

WANG Jiong, GONG GuiZhi, PENG ZhuChun, LI YiBing, WANG YanJie, HONG QiBin
（Citrus Research Institute, Southwest University/Chinese Academy of Agricultural Sciences, National Citrus Engineering Research Center, Chongqing 400712）

【Objective】To reveal genetic diversity and phylogenetic relationships of Citrus and its close and distant relatives with newly developed conserved ortholog sequence (COS) Marker.【Method】According to the published C. sinensis and C. clementina genomic sequencing information, COS Markers were developed and screened. Polymorphic markers were used to amplify and detect Citrus and its close and distant relatives. Structure, Power Marker and GenAlEx were used to analyze the relevantdata.【Result】A total of 60 COS primers were designed, and 25 primer pairs distributed in different linkage groups were selected based on clear and good DNA polymorphic bands. In 45 samples from Citrus and its relatives, 25 COS markers produced 584 bands, with an average of about 23.36 bands per marker, and genetic diversity ranged from 0.26 to 0.88, with an average of 0.49; PIC value was between 0.26 and 0.87, with an average of 0.48. When K = 9, a clear genetic structure relationship of citrus and its relatives were revealed. They were divided into C. reticulata group, C. grandis group, C. medica group, Papeda group, Fortunella group, P. trifoliate and Eremocitrus and M. australis group, Z. bungeanum group, Clausena lansium and Atalantia buxifolia and Murraya paniculata group as well as C. indica and C. mangshanensis hybrid groups. This result was globally consistent with that in the UPGMA clustering analysis. UPGMA clustering analysis revealed that COS Marker could effectively distinguish Citrus from its close and distant germplasm resources. At higher taxonomy level, Citrus was first separated from P. trifoliate, Eremocitrus, M. australis, Z. bungeanum, Clausena lansium, Atalantia buxifolia and Murraya paniculata; In Citrus, C. medica and Papeda group were first clustered, and then they were clustered with C. reticulata and C. grandis and other plants of Citrus. In C. reticulata group, Daoxian yeju and Cenxi suanju and other half wild C. reticulata were clearly distinguished from ponkan and the rest cultivated C. reticulata, but C. mangshanensis and C. indica were not in the group.【Conclusion】COS primers based on Citrus genomic information could get effective amplification and distinguish Citrus from its close and distant relatives effectively. The genetic makeup of C. mangshanensis and C. indica were heterozygous and different from C. reticulata, so they may not be the most primitive types of C. reticulata.

Citrus; COS marker; phylogenetic relationship; germplasm; genetics and evolution

2016-05-06；接受日期：2016-07-15

國家科技支撐計劃（2013BAD02B02）、重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計劃（cstc2014jcyjA80037）

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