微生物固態(tài)發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)成分變化研究

金紅春 楊春浩 肖調(diào)義 蘭時(shí)樂 王家怡

（1.湖南省安鄉(xiāng)縣科技和工業(yè)信息化局；2.湖南省安鄉(xiāng)縣發(fā)展和改革局；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)郵編：410128；4.安鄉(xiāng)縣一中，郵編：415600）

微生物固態(tài)發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)成分變化研究

金紅春1楊春浩2肖調(diào)義3＊蘭時(shí)樂3＊王家怡4

（1.湖南省安鄉(xiāng)縣科技和工業(yè)信息化局；2.湖南省安鄉(xiāng)縣發(fā)展和改革局；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)郵編：410128；4.安鄉(xiāng)縣一中，郵編：415600）

本文旨在以利用復(fù)合芽孢桿菌為菌種，通過固態(tài)發(fā)酵棉粕，研究棉粕發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分變化情況。測(cè)定主要營(yíng)養(yǎng)成分粗蛋白(悅P)、總游離氨基酸的含量。采用單因素試驗(yàn)確定了復(fù)合微生物發(fā)酵棉粕的最佳培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，在此試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵關(guān)鍵因子的最佳水平范圍進(jìn)行研究，用SPSS17.0軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。棉粕發(fā)酵最佳條件為：棉粕：麥麩為90%：10%、(NH4)2SO4 1%、含水量50%、發(fā)酵初始pH6.0、接種量6%（V/W）、發(fā)酵溫度40℃、發(fā)酵時(shí)間6d、裝量為70g/250mL三角瓶。棉粕發(fā)酵后悅P提高了6.99%，顯著高于其他組合（P＜0.05）；總游離氨基酸提高了9.98%，顯著高于其他組合（P＜0.05）。以復(fù)合芽孢桿菌為菌種，得出固體發(fā)酵棉粕的過程參數(shù)，為實(shí)際生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

復(fù)合微生物；固態(tài)發(fā)酵；棉粕；營(yíng)養(yǎng)成分；正交試驗(yàn)

隨著水產(chǎn)飼料業(yè)的高速發(fā)展，魚粉資源的不斷枯竭，加上近年來國(guó)內(nèi)外陸生養(yǎng)殖動(dòng)物流行病害嚴(yán)重，動(dòng)物蛋白源如肉骨粉、禽肉粉、血漿制品等的使用受到嚴(yán)重限制。棉粕是我國(guó)除豆粕之外常用的替代魚粉的植物蛋白源，因此棉粕的開發(fā)利用是解決我國(guó)蛋白質(zhì)資源短缺的主要途徑之一。Robinson P H（2001）、Singhal,K.K.（2006）等報(bào)道，因棉粕含有對(duì)單胃動(dòng)物有毒的游離棉酚，其利用價(jià)值和使用量受到很大限制，國(guó)內(nèi)外有關(guān)研究人員對(duì)微生物固體發(fā)酵棉粕的研究主要集中在篩選高效脫毒菌株方面，并取得了一些研究成果，但研究人員對(duì)微生物發(fā)酵處理棉粕后其營(yíng)養(yǎng)成分變化研究很少。在前人研究基礎(chǔ)上采用由枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto）、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、丁酸梭狀芽孢桿菌(悅lostridium butyricum)及酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等組成的復(fù)合菌固體發(fā)酵棉粕，生產(chǎn)棉粕蛋白飼料，通過單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn)，對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物各營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行研究，確定其最佳發(fā)酵工藝。本研究試圖找到一種不僅能避免化學(xué)添加劑和物理法對(duì)棉籽蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的影響，還會(huì)改善適口性，提高蛋白質(zhì)、氨基酸含量，既安全又可降低成本，具有很好發(fā)展?jié)摿Φ囊环N有效方法，為棉粕發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 發(fā)酵菌種經(jīng)鑒定，主要由枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、丁酸梭狀芽孢桿菌及酵母菌組成。粉末狀固體，活菌數(shù)＞1010悅FU.g-1。

1.1.2 發(fā)酵原材料

棉粕、麥麩由湖南省湘北水產(chǎn)飼料有限公司提供。粉碎至20目，棉粕含游離棉酚含量505 mg/Kg、粗蛋白含量41.25%、總游離氨基酸含量3.73%；麥麩粗蛋白含量16.46%、總游離氨基酸含量1.23%。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，Na-悅l0.5%，瓊脂1.5-2.0%，pH7.0-7.2，121℃滅菌25 min。

液體種子培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，Na悅l0.5%，葡萄糖5%，pH7.0-7.2，121℃滅菌25 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：棉粕、麥麩分別占發(fā)酵底物的80%、20%，葡萄糖2%，（NH4）2SO41%，固水比1：0.5，pH7.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

斜面菌種培養(yǎng)：將保存于冰箱的斜面種子接種于新鮮斜面培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)36h。

液體種子培養(yǎng)：將培養(yǎng)36 h的斜面種子分別接種于液體種子培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)18h-24h。

發(fā)酵培養(yǎng)：按5%的接種量（V/W）接種于裝量為50g/250mL三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，混合均勻后，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，培養(yǎng)過程中從培養(yǎng)開始每24h搖動(dòng)1次。

1.2.2 單因素條件研究

培養(yǎng)方法與1.2.1相同，替換不同的條件，如棉粕與麥麩的比例、葡萄糖含量、（NH4）2SO4添加量、發(fā)酵溫度、初始pH值、含水量、接種量、發(fā)酵時(shí)間、裝量等，測(cè)定不同條件下各營(yíng)養(yǎng)成分的變化情況。每處理3個(gè)重復(fù)。

1.3 測(cè)定及分析方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

全自動(dòng)凱氏定氮儀（FOSS），kjeltecTM2300。

1.3.2 總游離氨基酸含量測(cè)定

采用羅欽（2005）報(bào)道，甲醛滴定法測(cè)定。

游離氨基酸含量計(jì)算公式為:A=悅(NaOH)V(NaOH)× 0.136×10∕W×100

式中A為樣品中游離氨基酸的含量,%；悅(NaOH)為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol∕L；

V(NaOH)為加入中性甲醛溶液之后,滴定試樣消耗0.05 mol∕L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；

0.136 為與1.0 mol∕L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)?shù)陌被岬馁|(zhì)量；W為樣品的質(zhì)量,g。

1.3.3 試驗(yàn)結(jié)果分析方法

試驗(yàn)結(jié)果使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，Duncan氏多重比較檢驗(yàn)均值的差異顯著性,當(dāng)P＞0.05時(shí),表示差異不顯著，當(dāng)P＜0.05時(shí),表示差異顯著。結(jié)果用平均值(M)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示，用Excel 2000進(jìn)行圖表分析。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

2.1.1 棉粕與麥麩比例對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

改變發(fā)酵培養(yǎng)基棉粕與麥麩（100：0、95:5、90: 10、85:15、80:20、75:25）的比例，30℃恒溫培養(yǎng)5d，發(fā)酵料低溫烘干后，測(cè)定粗蛋及白總游離氨基酸含量。結(jié)果見圖1：

圖1 棉粕與麥麩比例對(duì)粗蛋白、總游離氨基酸含量影響

從圖1可知，粗蛋白含量、總游離氨基酸含量隨培養(yǎng)基中麥麩比例增加而升高，當(dāng)棉粕與麥麩的比例為90:10時(shí)，達(dá)到最高，粗蛋白含量達(dá)到39.41%，較發(fā)酵前的37.77%提高了1.64%；總游離氨基酸含量6.87%，與其他比例條件下相比達(dá)到最高。隨后增加培養(yǎng)基中麥麩的比例，粗蛋白、總游離氨基酸含量明顯降低，因此，選擇棉粕與麥麩的比例為90:10。

2.1.2 葡萄糖含量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

按質(zhì)量比在培養(yǎng)基中分別加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的葡萄糖，以不加葡萄糖為對(duì)照，其它條件不變，結(jié)果見圖2：

從圖2可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)基中加入葡萄糖對(duì)粗蛋白含量的影響較大。培養(yǎng)基中隨著葡萄糖含量增加，粗蛋白含量下降較快，對(duì)提高營(yíng)養(yǎng)成分含量不利。葡萄糖含量對(duì)總游離氨基酸含量影響較小，但都隨添加量的增加而降低。因此，發(fā)酵過程中不需要在培養(yǎng)基中加入葡萄糖作為微生物生長(zhǎng)的速效碳源。

圖2 葡萄糖含量對(duì)粗蛋白、總游離氨基酸含量的影響

2.1.3 硫酸銨含量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

分別在培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量比的硫酸銨(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)，以不加硫酸銨為對(duì)照，結(jié)果見圖3：

圖3 硫酸銨含量對(duì)粗蛋白、總游離氨基酸含量的影響

從圖3可以看出，硫酸銨添加量對(duì)粗蛋白含量影響很大，在一定范圍內(nèi)，發(fā)酵培養(yǎng)基中隨著(NH4）2SO4含量的增加，營(yíng)養(yǎng)成分含量也隨之增加。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中(NH4）2SO4含量為1%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白與不添加硫酸銨對(duì)照組的39.97%相比提高了0.58%，達(dá)到40.55%；總游離氨基酸含量比對(duì)照組3.48%提高了4.32%，達(dá)到7.80%。當(dāng)（NH4）2SO4含量超過1%，營(yíng)養(yǎng)成分呈下降趨勢(shì)。（NH4）2SO4作為微生物生長(zhǎng)的速效氮源，在發(fā)酵前期，對(duì)微生物的生長(zhǎng)有利，但發(fā)酵培養(yǎng)基中（NH4）2SO4的含量過高，改變了培養(yǎng)基的碳氮比，導(dǎo)致微生物大量生長(zhǎng)而不分泌或少分泌某些酶類，從而影響了各成分含量。

2.2 發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

2.2.1 溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基分別置于30℃、35℃、40℃、45℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，結(jié)果見圖4：

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)粗蛋白、總游離氨基酸含量的影響

溫度是微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的重要影響因素之一，合適的發(fā)酵溫度，有利于微生物的生長(zhǎng)和代謝。從圖4可知，在30℃～40℃范圍內(nèi)，粗蛋白、總游離氨基酸含量隨溫度的升高而提高。當(dāng)發(fā)酵溫度為40℃時(shí)，達(dá)到最高，但隨著發(fā)酵溫度的進(jìn)一步升高，隨之各成分下降，可能是因?yàn)楦邷匾种屏宋⑸锂a(chǎn)生酶所致。

2.2.2 起始pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，結(jié)果見圖5:

圖5 起始pH對(duì)粗蛋白、總游離氨基酸含量的影響

從圖5可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為6.0時(shí)，粗蛋白含量為42.10%、總游離氨基酸含量9.42%,初始pH值大于6.0，發(fā)酵培養(yǎng)基中的各成分隨之下降，其原因有待進(jìn)一步研究。

2.2.3 含水量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為30%、35%、40%、45%、50%、55%，40℃恒溫發(fā)酵5d，結(jié)果見圖6:

圖6 含水量對(duì)粗蛋白、總游離氨基酸含量的影響

從圖6可以看出，隨著發(fā)酵料中含水量的增加，粗蛋白、總游離氨基酸的含量也在增加,當(dāng)含水量為50%時(shí)，粗蛋白含量達(dá)到40.99%，比未發(fā)酵前提高了3.22%；總游離氨基酸含量8.35%，比未發(fā)酵前3.48%提高了4.87%。但含水量超過50%，各成分下降明顯。主要原因?yàn)榘l(fā)酵料中過高的含水量，可降低發(fā)酵料中氧氣濃度，從而導(dǎo)致厭氧發(fā)酵，影響營(yíng)養(yǎng)成分含量提高。

2.2.4 接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

按菌種接種量分別為（V/W）2%、3%、4%、5%、6%、7%接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，結(jié)果見圖7:

圖7 接種量對(duì)粗蛋白、總游離氨基酸含量的影響

接種量的大小可直接影響發(fā)酵進(jìn)度和代謝產(chǎn)物的生成量。接種量太小，延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間及增加雜菌污染的機(jī)會(huì)；接種量太大，可導(dǎo)致發(fā)酵前期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，不利于產(chǎn)物的形成和毒性物質(zhì)的降解。圖7結(jié)果表明，當(dāng)接種量為6%時(shí)，發(fā)酵料中粗蛋白含量達(dá)到42.63%，比發(fā)酵前提高了4.86%；總游離氨基酸含量10.58%，比其他接種量條件下活力提高明顯，與發(fā)酵前相比提高了7.10%。但增加接種量，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量下降。

2.2.5 裝量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

250 mL三角瓶中分別裝入30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g固體發(fā)酵培養(yǎng)基，結(jié)果見圖8:

圖8 裝量對(duì)粗蛋白、總游離氨基酸含量的影響

圖8表明，當(dāng)250 mL三角瓶中裝入70g發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，粗蛋白含量、總游離氨基酸含量與其他裝量條件下相比，達(dá)到最高值，分別為42.94%、 11.80%，比未發(fā)酵前相比分別提高了5.17%、8.32%。

2.2.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

在得到的上述最優(yōu)條件下，分別發(fā)酵3d、4d、5d、6d、7d，結(jié)果見圖9:

圖9 發(fā)酵時(shí)間對(duì)粗蛋白、總游離氨基酸含量的影響

從圖9可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵料中營(yíng)養(yǎng)成分的含量和酶活也隨之提高，到發(fā)酵第6d，粗蛋白含量43.76%，提高達(dá)到5.99%；總游離氨基酸含量12.88%，提高了9.40%。但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量反而降低，主要原因是微生物代謝消耗所致。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用（NH4）2SO4添加量、物料含水量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間等對(duì)發(fā)酵效果影響較大的4個(gè)因素作為考察，分別選取3個(gè)水平，以粗蛋白含量、總游離氨基酸含量為考察指標(biāo)，采用SPSS 17.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見下表：

根據(jù)上表結(jié)果可知，處理4的粗蛋白含量顯著高于其他八組處理及未發(fā)酵對(duì)照組(P＜0.05)，其他八組處理的粗蛋白含量也都顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。處理4總游離氨基酸含量提高效果顯著好于其他八組和對(duì)照組(P＜0.05)，其他八組處理提高效果也都顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。由粗蛋白含量、總游離氨基酸含量及極差分析可得出：A2B1悅2D3為最佳設(shè)計(jì)方案，即（NH4）2SO4添加量1%，含水量50%，發(fā)酵溫度40℃，發(fā)酵時(shí)間6d。

3 討論

3.1 微生物固態(tài)發(fā)酵棉粕蛋白質(zhì)和氨基酸顯著提高

五株芽孢桿菌和酵母菌發(fā)生協(xié)同作用，使得微生物大量繁殖，向細(xì)胞外分泌一定量的多肽、酶蛋白等物質(zhì)，同時(shí)利用底物及非蛋白氮合成大量菌體蛋白。由試驗(yàn)結(jié)果可知，發(fā)酵產(chǎn)物中，粗蛋白提高了6.99%，比張慶華等報(bào)道提高的2.29%又提高了4.70%，總游離氨基酸提高了9.98%，比報(bào)道提高的2.66%又提高了7.32%，主要原因是微生物生長(zhǎng)繁殖過程中消耗底物而導(dǎo)致發(fā)酵物的絕對(duì)含量減少和微生物利用非蛋白氮合成菌體蛋白，從而提高了發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白和總游離氨基酸含量。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

3.2 微生物固態(tài)發(fā)酵棉粕的最佳條件

以粗蛋白含量、總游離氨基酸含量活力作為固態(tài)發(fā)酵效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)復(fù)合芽孢桿菌和酵母菌共同固態(tài)發(fā)酵棉粕的組成及其配比，添加碳源、氮源種類及濃度，培養(yǎng)基的含水量進(jìn)行了優(yōu)化，得到固態(tài)發(fā)酵最佳條件為：棉粕：麥麩為90：10，（NH4）2SO4添加量1%，發(fā)酵溫度40℃，物料含水量50%，接種量6%，裝量為70g/250mL三角瓶，發(fā)酵時(shí)間6d。

本試驗(yàn)按照得到的最優(yōu)水平又進(jìn)行了堆積發(fā)酵底物驗(yàn)證，結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果接近，說明優(yōu)化結(jié)果是可信的，具有較強(qiáng)的生產(chǎn)指導(dǎo)意義,為棉粕在畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中利用多菌種、多重發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)生物飼料的開發(fā)利用提供了一條新途徑。

（略）