JAK/STAT3抑制劑對創(chuàng)傷性休克致兔腎損傷影響

劉學磊， 柳云恩， 佟 周， 佟昌慈， 張玉彪， 施 琳，叢培芳， 史秀云， 劉 穎， 金紅旭， 侯明曉

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院1.急診醫(yī)學部；2.全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實驗室及遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護重點實驗室，遼寧 沈陽 110016

·創(chuàng)傷性休克·

JAK/STAT3抑制劑對創(chuàng)傷性休克致兔腎損傷影響

劉學磊1,2， 柳云恩1,2， 佟 周1,2， 佟昌慈1,2， 張玉彪1,2， 施 琳1,2，叢培芳1,2， 史秀云1,2， 劉 穎1,2， 金紅旭1,2， 侯明曉1,2

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院1.急診醫(yī)學部；2.全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實驗室及遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護重點實驗室，遼寧 沈陽 110016

目的 探討JAK/STAT3抑制劑AG490對創(chuàng)傷性休克致兔腎損傷的影響。方法 將30只健康新西蘭兔分為對照組、模型組與AG490治療組，每組10只。模型組與AG490治療組兔建立創(chuàng)傷性休克致腎損傷動物模型。通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR)和蛋白質印跡法(Western-blot)檢測腎組織中STAT3、Kim-1、TGF-β1的表達情況。結果 與對照組比較，模型組腎組織肌酐與尿素氮水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，AG490治療組肌酐與尿素氮水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組比較，模型組臟組織中STAT3、TGF-β1的mRNA與蛋白表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，AG490治療組STAT3、TGF-β1的mRNA與蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 JAK/STAT3抑制劑可能通過TGF-β1來阻斷JAK/STAT3信號通路的激活，進而抑制創(chuàng)傷性休克腎損傷發(fā)展。

創(chuàng)傷性休克； 腎損傷； JAK/STAT3信號通路； TGF-β1； AG490

隨著社會的進步和經濟的發(fā)展，因交通肇事傷、自殺、職業(yè)傷等因素造成的創(chuàng)傷導致死亡的人數(shù)逐漸上升。嚴重創(chuàng)傷往往伴有機體大量失血甚至引起休克，長時間休克會引起急性腎功能不全，成為死亡率上升的又一重要原因。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，JAK/STAT3信號途徑可參與細胞的增值、分化及凋亡等過程[1-3]。JAK/STAT3信號通路主要由3種成分組成，即酪氨酸激酶相關受體、酪氨酸激酶(JAK)和轉錄因子(STAT)。研究發(fā)現(xiàn)，早期阻斷JAK/STAT3信號通路在一定程度上可緩解重癥胰腺炎導致的腎損傷[4]。但其在創(chuàng)傷性休克腎損傷中的作用機制尚不明確，本研究通過建立創(chuàng)傷性休克的兔模型，觀察抑制JAK/STAT信號通路對創(chuàng)傷性休克合并急性腎損傷的影響，為臨床防治創(chuàng)傷性休克合并腎損傷提供新的理論依據(jù)及治療靶點。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器 大鼠抗兔GAPDH、STAT3和TGF-β1抗體均購自美國Abcam公司，AG490阻斷劑購自美國Sigma公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗大鼠IgG購自武漢博士得生物公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，RevertAidTM First strand cDNA Synthesis Kit、Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix 購自美國Thermo Fisher scientific公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR)儀、蛋白質印跡法(Western-blot)電泳儀、轉膜儀均為美國Bio-Rad公司產品。

1.2 實驗動物與分組 將30只新西蘭兔(由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心提供)隨機分為對照組、模型組和AG490治療組，每組各10只。

1.3 研究方法

1.3.1 模型構建 水合氯醛(0.49 mg/kg)和阿托品(0.03 mg/kg)腹腔注射麻醉。頸動脈置管并連接多道生理信號監(jiān)測儀監(jiān)測心率、呼吸頻率、平均動脈壓等生理信息。在血壓、心率監(jiān)測下予2 500 g鐵陀垂直砸傷兔股骨造成雙側股骨完全性骨折。30 min后，自頸動脈快速放血，直至平均動脈壓降至30 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的休克水平。維持60 min后進行液體復蘇，5 min內快速回輸全血，并輸注等量5%葡萄糖生理鹽水，兔蘇醒后可自由飲水進食。AG490治療組常規(guī)AG490給藥治療。

1.3.2 Real-time PCR檢測 按Trizol試劑操作說明書進行創(chuàng)傷性休克腎總RNA提取。RNA沉淀干燥后，加入50 μl DEPC水溶解。根據(jù)RevertAidTM First strand cDNA Synthesis Kit說明書，反轉錄生成第1鏈cDNA。應用SYBR Green Real-time PCR，以GAPDH為參比基因，對STAT3和Kim-1進行實時熒光定量分析，計算各目的基因/參比基因的相對定量。

1.3.3 Western blot檢測 提取腎組織總蛋白，采用BCA法對已提取的蛋白進行定量，制備聚丙烯酰胺凝膠。對腎總蛋白進行電泳與轉膜，使用脫脂奶粉對已經轉到PVDF膜上的蛋白進行封閉，滴加一抗(STAT3一抗1∶1 500滴加；TGF-β1一抗1∶2 000滴加；GAPDH一抗1∶2 500滴加)，4℃冰箱過夜，滴加1∶500羊抗大鼠IgG二抗，ECL發(fā)光顯色，以GAPDH作為內參，軟件分析測定灰度值，計算蛋白的相對含量。

1.3.4 引物設計與合成 從GenBank中檢索兔GAPDH和STAT3的mRNA序列，應用DNA MAN軟件設計引物，引物由Invitrogen公司合成，見表1。

表1 基因引物序列

2 結果

2.1 腎功能檢測結果 與對照組比較，模型組腎組織肌酐、尿素氮水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，AG490治療組肌酐、尿素氮水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 腎功能檢測結果

注：與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

2.2 Real-time PCR檢測結果 與對照組比較，模型組腎組織中STAT3、TGF-β1的mRNA與蛋白表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，AG490治療組STAT3、TGF-β1的mRNA與蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 腎組織STAT3、TGF-β1的mRNA表達量

注：與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

2.3 Western blot檢測結果 模型組STAT3、TGF-β1的表達均顯著升高，腎損傷嚴重，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；AG490治療組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 Western blot檢測結果

3 討論

嚴重創(chuàng)傷往往伴有休克，創(chuàng)傷性休克就其成因及發(fā)展過程均較單純的失血性休克復雜。研究表明，創(chuàng)傷性休克患者死亡的首要原因為外傷直接導致重要器官不可逆轉的損傷，如腎等[5-6]。許多創(chuàng)傷患者在受傷后數(shù)天死亡，但其血容量已正常，主要死亡原因也不是基礎疾病，而是由創(chuàng)傷而造成的急性應激狀態(tài)、伴有全身炎癥反應綜合征，進而并發(fā)急性呼吸窘迫綜合征。研究表明，創(chuàng)傷后休克為第一始動因素，雖然現(xiàn)今診治水平有一定提高，但許多問題仍未解決，尤其是創(chuàng)傷性休克造成肺、腦、腎、腸道等多器官損傷的機制是當前研究的關鍵和難點之一[7-8]。STAT3作為JAK/STAT3信號通路中的關鍵分子，廣泛分布于多種類型的細胞與組織中，多種細胞因子均可誘導JAK的活化，使其酪氨酸位點磷酸化，當細胞或者組織受到信號刺激后，與酪氨酸殘基相結合活化STAT3，參與細胞的各種應答[9-10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，腎系膜細胞和腎小球上皮細胞的JAK/STAT3通路活化可能參與急性腎損傷的發(fā)生與發(fā)展[11-12]。研究表明，JAK-STAT信號通路的特異性抑制劑AG490可以抑制JAK信號通路的激活，拮抗TGF-β1的表達，從而減少細胞外基質的集聚，從而治療腎損傷[13-14]。阻斷JAK/STAT3信號通路能夠顯著抑制TGF-β1的mRNA表達，減少腎組織巨噬細胞浸潤[15]，減少腎損傷。

本研究通過建立新西蘭兔創(chuàng)傷性休克腎損傷模型，觀察到模型組STAT3的表達明顯增高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。應用AG490治療后，STAT3的表達下降，表明AG490有效阻斷JAK-STAT3信號通路的表達；模型組的TGF-β1的表達亦明顯增高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。應用AG490治療后，TGF-β1的表達下降，說明JAK-STAT信號通路的特異性抑制劑AG490可以抑制JAK信號通路的激活，拮抗TGF-β1的表達，從而阻止腎組織的進一步損傷。

綜上所述，AG490可能通過TGF-β1來阻斷JAK/STAT3信號通路的激活，進而抑制創(chuàng)傷性休克腎損傷的發(fā)展，JAK/STAT3信號通路的激活有可能成為治療創(chuàng)傷性休克腎損傷的一個新治療靶點。

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Effects of JAK/STAT3 inhibitor on rabbit traumatic shock renal injury

LIU Xue-lei,LIU Yun-en,TONG Zhou,TONG Chang-ci,ZHANG Yu-biao,SHI Lin,CONG Pei-fang,SHI Xiu-yun,LIU Ying,JIN Hong-xu,HOU Ming-xiao
(Department of Emergency Medicine,Laboratory of PLA Wound and Trauma Center,The General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

Objective To explore the effect of JAK / STAT3 signaling pathway inhibitor AG490 in traumatic shock induced kidney damage.Methods A total of 30 New Zealand rabbits were divided into control group,model group and AG490 treatment group,with 10 rats in each group.Rabbits were made traumatic shock and kidney damage in model group and AG490 treatment group.To detect the expression of STAT3,Kim-1 and TGF-β1 in kidney tissues via real-time quantitative PCR and western blot.Results Compared with control group,renal creatinine and urea nitrogen levels in model group were significantly higher than those in the control group(P<0.05);compared with the model group,serum creatinine and blood urea nitrogen levels in AG490 treatment group were significantly lower(P<0.05);compared with the control group,levels of expression of STAT3 and TGF-β1 mRNA protein in kidney tissue in the model group were significantly increased(P<0.05);compared with the model group,STAT3 and TGF-β1 mRNA and protein expression level in AG490 treatment group were significantly reduced(P<0.05).Conclusion AG490 may be blocked by TGF-β1 activated in JAK/STAT3 signaling pathway,thereby inhibiting the development of traumatic shock and kidney damage.

Traumatic shock; Kidney injury; JAK/STAT3 signaling pathway; TGF-β1; AG490

2013年遼寧省科技攻關(2013225089)；2012年全軍十二五面上項目(CSY12J002)

劉學磊(1987-)，女，遼寧沈陽人，醫(yī)師，碩士

金紅旭，E-mail：hongxuj@126.com；侯明曉，E-mail:houmingxiao188@163.com

2095-5561(2017)01-0018-04 DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2017.01.05

2016-11-21