鎘對背角無齒蚌組織中金屬硫蛋白含量的影響

任玉娟，劉蒙南，王蘭，劉娜

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

鎘對背角無齒蚌組織中金屬硫蛋白含量的影響

任玉娟，劉蒙南，王蘭，劉娜

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

為研究鎘（Cd2+）對背角無齒蚌（Anodonta woodiana）鰓和消化腺中金屬硫蛋白（MT）含量的影響，設(shè)置1個對照組和3個鎘處理組（Cd2+質(zhì)量濃度分別為0.5，5，50 mg/L），采用鎘血紅蛋白飽和法分別測定Cd2+處理后第1，4，7，14天和Cd2+清除的第1，4，7，14天鰓和消化腺中MT的含量。結(jié)果顯示，鰓MT含量在5，50 mg/LCd2+處理的不同階段均顯著或極顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），而消化腺MT含量只在第7，14天時明顯上升（P＜0.05，P＜0.01），0.5 mg/LCd2+僅在第14天時對鰓和消化腺MT含量影響顯著或極顯著（P＜0.05，P＜0.01）；移入清水后，鰓和消化腺MT含量隨著時間延長逐漸回落至對照組水平，但是在后期出現(xiàn)了反彈。由此推斷，鎘處理可不同程度地誘導(dǎo)背角無齒蚌鰓和消化腺MT含量升高，而清除試驗可能對由鎘引起的誘導(dǎo)效應(yīng)有一定的修復(fù)作用。

背角無齒蚌；消化腺；鰓；金屬硫蛋白；鎘

近年來，重金屬污染物對自然環(huán)境的破壞以及對人類健康的威脅已引起社會的廣泛關(guān)注，其中尤以鎘污染最為突出。鎘（Cadmium，Cd）是一種自然界中廣泛存在的重金屬污染物，主要通過工業(yè)生產(chǎn)活動排放到環(huán)境中[1]。研究表明，鎘對人體的腎、肺、肝、睪丸、腦、骨骼及血液系統(tǒng)均可以產(chǎn)生毒性，引起一系列嚴(yán)重的疾病[2]，還可以導(dǎo)致植物以及動物DNA結(jié)構(gòu)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，組織損傷[3-5]。金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是一類廣泛存在于各種微生物、高等動植物和人類的各種組織、器官中的低分子量金屬結(jié)合蛋白[6]。MT參與生物體內(nèi)必需金屬元素的調(diào)節(jié)和非必需金屬元素的解毒。但是，MT的解毒和調(diào)節(jié)作用是有限的，當(dāng)重金屬超過一定閾值時，有機體就會出現(xiàn)病理變化，嚴(yán)重時甚至?xí)＜皞€體生命[7]。許多海洋貝類，例如青蛤（Cyclina sinensis）、文蛤（Meretrix meretrix）、大珠母貝（Pinctada maxima）、美洲牡蠣（Crassostrea virginica）、貽貝（Mytilus edulis）、海灣扇貝（Argopecten irradians）等MT的研究已有報道[8-13]。但是，關(guān)于淡水貝類MT的研究報道較少。

背角無齒蚌（Anodonta woodiana）俗稱河蚌，對外界環(huán)境的變化非常敏感，易采易養(yǎng)，是理想的水環(huán)境污染指示生物。因此，本研究以背角無齒蚌為試驗材料，分析鎘對其消化腺和鰓組織中MT含量的影響，旨在為鎘對貝類致毒作用機制的研究提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

背角無齒蚌（簡稱河蚌），購自太原市五龍口水產(chǎn)批發(fā)市場，殼長（10.1±1.6）cm，寬（6.6±1.2）cm，高（4.5±1.2）cm。在實驗室馴養(yǎng)14 d以上，每48 h換水一次，養(yǎng)殖用水為曝氣48 h自來水（pH值7.5，溶氧量8.0～8.3 mg/L）。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 主要儀器高速冷凍離心機（Eppendorf，5804R型），電動勻漿儀（FLUKO，F(xiàn)6/10型），火焰原子吸收光譜儀（美國瓦里安，AA240FS型）。

1.2.2 主要試劑氯化鎘（CdCl2·H2O，分析純），Tris-HCl緩沖液（pH值為8.60，0.01 mol/L），濃硝酸（分析純），高氯酸（分析純），牛血紅蛋白（Sigma）。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設(shè)計選擇個體大小相似的河蚌分為1個對照組和3個處理組，對照組用清水飼養(yǎng)。根據(jù)Cd2+對河蚌96 h LC50（134.9 mg/L）[14]及《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB 11607—92）》中Cd2+含量標(biāo)準(zhǔn)（＜0.005 mg/L），Cd2+質(zhì)量濃度設(shè)置為0.5，5，50 mg/L，每個處理組設(shè)3個平行。經(jīng)Cd2+染毒14 d的各濃度組河蚌再移入清水中繼續(xù)飼養(yǎng)，實施Cd2+的清除試驗。分別在染毒第1，4，7，14天和清水處理的第1，4，7，14天隨機從各處理組中取出3只河蚌，取鰓和消化腺各0.1～0.2 g，經(jīng)液氮速凍后于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 MT含量的測定利用鎘血紅蛋白飽和法[15-16]并稍加改進(jìn)，每克濕組織加入4 mL Tris-HCl緩沖液，電動勻漿器冰浴勻漿后12 000 g，4℃離心15 min。在0.5 mL上清液中加入0.5 mL20 mg/L的CdCl2溶液，混合后室溫放置5 min，加入新配制的2%（w/v）牛血紅蛋白0.2 mL，混勻，冰浴5 min后沸水浴2 min，冷卻后10 000 g，4℃離心10 min，重復(fù)2次加牛血紅蛋白之后的步驟。上清液消化后，用火焰原子吸收儀檢測鎘含量，根據(jù)MT與鎘原子的結(jié)合原理，每分子MT結(jié)合6個鎘原子換算出MT的含量。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果以3個平行組數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘暴露和清水處理后背角無齒蚌鰓中MT含量分析

由圖1可知，0.5 mg/L Cd2+染毒處理1，4，7 d時并未對河蚌鰓中MT含量產(chǎn)生顯著的影響（P＞0.05），只有在染毒14 d時MT含量才被極顯著誘導(dǎo)（P＜0.01），但是較高質(zhì)量濃度的Cd2+（5，50 mg/L）處理則可顯著或極顯著誘導(dǎo)MT含量升高（P＜0.05，P＜0.01）；清水處理的第1天，除了0.5 mg/L組，其他處理組MT水平仍顯著高于對照組水平（P＜0.05），第4，7天鰓MT含量回落至對照組水平，但在第14天時各處理組MT含量又出現(xiàn)明顯上升趨勢（P＜0.01）。

2.2 鎘暴露和清水處理后背角無齒蚌消化腺中MT含量分析

由圖2可知，鎘處理1，4 d時，消化腺MT含量未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05），當(dāng)處理時間延長至7 d時，5，50 mg/LCd2+處理組的消化腺MT含量顯著升高（P＜0.05），處理14 d時，各Cd2+處理組的MT含量均顯著增加（P＜0.05），且在5 mg/L Cd2+處理組達(dá)到最大值；當(dāng)河蚌被移入清水后，各Cd2+處理組的消化腺MT含量基本都回落至對照組水平，只有7，14 d的0.5 mg/L處理組和14 d的50 mg/L處理組的MT含量仍高于對照組（P＜0.05）。

3 討論

近年來，關(guān)于重金屬對水生生物MT毒性影響的相關(guān)研究日益增多[17-19]。MT所富含的半胱氨酸的巰基可以與重金屬配位結(jié)合并將其排出體外，從而對機體中的重金屬起到一定的解毒作用。SERAFIM等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在鋅、鎘、銅聯(lián)合染毒下，隨著處理時間的延長，溝紋蛤仔（Ruditapes decussatus）的鰓、消化腺和其他組織的MT含量基本呈上升趨勢，說明重金屬可能對MT有一定的誘導(dǎo)作用。本研究結(jié)果顯示，隨著鎘濃度的增大和處理時間的延長，河蚌鰓中MT含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），這與鎘對南極帽貝（Laternula elliptica）[21]和貽貝（Mytilus galloprovincialis）[22]的鰓MT含量的影響類似。在相同的處理時間內(nèi)，河蚌鰓中MT含量隨著鎘濃度的增大基本呈先升后降的趨勢，這可能是由于高濃度鎘處理下動物組織內(nèi)蓄積的重金屬量大大超過MT的結(jié)合能力所致。由此推測，過量的鎘將可能對機體引起明顯的毒性效應(yīng)，如鰓結(jié)構(gòu)的改變，酶活性中心被破壞，導(dǎo)致酶失活及DNA的損傷等[23-25]。本試驗中，短時間（1，4 d）的鎘處理未對消化腺MT含量產(chǎn)生顯著影響，直至鎘處理時間延長至7 d時，較高鎘濃度組（5，50 mg/L）的消化腺MT含量出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05）。由此推測，低濃度、短時間的鎘暴露，消化腺中MT含量維持在正常水平，可能在解毒和穩(wěn)態(tài)維持方面并沒有發(fā)揮明顯的作用，而對鎘的解毒作用可能更多的是通過機體中其他的金屬結(jié)合蛋白等實現(xiàn)的。處理時間延長、鎘濃度增大時，消化腺MT含量顯著升高，說明當(dāng)機體中鎘含量增加到一定程度時，MT才可能被大量地誘導(dǎo)表達(dá)而發(fā)揮解毒作用，以緩解鎘脅迫對機體造成的損傷。

研究發(fā)現(xiàn)，鎘對MT含量的影響存在組織特異性。本試驗結(jié)果顯示，河蚌鰓和消化腺中的MT水平存在組織差異性，且鎘對2種組織中MT含量的誘導(dǎo)程度也不同。關(guān)于菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）[26]的研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度鎘脅迫下，消化腺和鰓組織中MT含量均顯著高于對照組水平，且消化腺的MT含量明顯高于鰓。本試驗中，鎘脅迫下消化腺MT水平明顯高于鰓中。這可能是由于消化腺是重金屬蓄積的主要組織，是MT合成的重要場所。COSSON等[27]發(fā)現(xiàn)，在試驗條件下貽貝鰓組織中MT比消化腺中MT對重金屬離子的誘導(dǎo)更加敏感，這與本試驗結(jié)果相似。河蚌主要通過鰓的濾水作用來進(jìn)行呼吸、攝食、排泄甚至輔助生殖，而鰓又是最先接觸污染物的組織，因此，其受污染物的影響較嚴(yán)重，污染物對鰓MT的誘導(dǎo)程度也較大，相對來說消化腺是內(nèi)臟團組織，沒有鰓那么容易受外界離子的影響[28]。

本試驗中，在清水處理前期，鰓和消化腺MT含量逐漸下降并回落至對照組水平，但在清水處理的后期（7，14 d）又明顯上升。這可能是因為鎘對河蚌的毒性較大而產(chǎn)生了較強、較持久的影響，恢復(fù)期間MT含量的波動表明機體對鎘引起的損傷修復(fù)可能需要更長的時間，在后續(xù)研究中建議延長清水處理時間直至MT含量恢復(fù)至正常水平穩(wěn)定為止，以便更全面地分析其修復(fù)機制。

綜上所述，不同濃度和時間的鎘處理后，背角無齒蚌鰓和消化腺中MT的含量有不同程度的升高，且消化腺中MT水平明顯高于鰓，鎘對2種組織MT含量的誘導(dǎo)程度不同。清水處理對于鎘引起的背角無齒蚌鰓和消化腺MT含量升高有一定的修復(fù)作用，體現(xiàn)為MT含量的逐漸回落，但在清水處理后期MT含量再次升高。

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Effect of Cadmium on the Content of Metallothionein in the Tissues of the Freshwater Mussel，Anodonta woodiana

RENYujuan，LIUMengnan，WANGLan，LIUNa
（College ofLife Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

The aim ofthis study was to investigate the effect of cadmium（Cd2+）on the content of metallothionein（MT）in the gills and digestive glands of the freshwater mussel（Anodonta woodiana）.The freshwater mussels were exposed to different concentrations of Cd2+（0,0.5,5,50 mg/L）for 14 days then moved intoclean water and cultured for another 14 days.The content ofMTin the tissues ofthe freshwater mussels was measured by Cd-Hb Saturation in different treatment period.The results showed that the content of MT in the gills was induced significantly（P＜0.05,P＜0.01）by 5 and 50 mg/L Cd2+during the exposure period,while the content of MT in the digestive glands was increased notably（P＜0.05,P＜0.01）onlyat 7 d and 14 d.The content ofMTin the gills and digestive glands was induced prominently（P＜0.05,P＜0.01）by 0.5 mg/L Cd2+merely at 14 d.After Cd2+exposure for 14 days,the freshwater mussels were moved into clean water and the content ofMT was decreased gradually with the extension ofclean water treatment,but enhanced again at 14 d（P＜0.05,P＜0.01）.It is concluded that the content ofMTin the gills and digestive glands ofthe freshwater mussels can be induced remarkably by higher concentrations of Cd2+exposure（5,50 mg/L）and the toxicity effect of Cd2+might be repaired by clean water exposure.But further researches are still needed toconfirmthe repairingeffect ofclean water.

Anodonta woodiana;digestive gland;gill;metallothionein;cadmium

X174

：A

：1002-2481（2017）02-0211-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.02.17

2016-09-12

山西省基礎(chǔ)研究計劃項目（2013021022-4）；山西省留學(xué)回國人員科技活動擇優(yōu)資助項目（2014）；山西省回國留學(xué)人員科研資助項目（2014-016）

任玉娟（1992-），女，山西孝義人，在讀碩士，研究方向：水生動物毒理。劉娜為通信作者。