不同沙棘品種間蘆丁含量的比較

張瓊姝，王斌，楊雪芳，張洋洋，郭海利，張小民

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西金科海生物技術(shù)有限公司，山西太原030006）

不同沙棘品種間蘆丁含量的比較

張瓊姝1，王斌1，楊雪芳1，張洋洋1，郭海利2，張小民1

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西金科海生物技術(shù)有限公司，山西太原030006）

通過(guò)反相HPLC法，采用Diamonsil@C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），流動(dòng)相甲醇-0.5%磷酸（33∶67），檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，對(duì)太谷試驗(yàn)區(qū)的6個(gè)雜交沙棘品種和本地野生中國(guó)沙棘葉中的蘆丁含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，雜優(yōu)1號(hào)蘆丁含量為0.081 3%，雜優(yōu)2號(hào)為0.052 3%，雜優(yōu)10號(hào)為0.130 0%，雜優(yōu)12號(hào)為0.132 7%，雜優(yōu)54號(hào)為0.068 2%，豐寧雄為0.086 9%，中國(guó)沙棘♀為0.136 1%，中國(guó)沙棘♂為0.146 6%。研究結(jié)果不僅可為沙棘品種鑒定、適應(yīng)性研究和種植推廣提供參考，同時(shí)也可為進(jìn)一步的產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

沙棘；蘆丁；反相高效液相色譜

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）是我國(guó)防風(fēng)固沙的先鋒樹種[1]，并且其葉果含有極高的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和輕工業(yè)等領(lǐng)域，故有較高的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2-4]。2012年水利部沙棘中心在太谷建立了雜交沙棘苗木種植試驗(yàn)區(qū)，從內(nèi)蒙古鄂爾多斯市東勝區(qū)九成宮沙棘育種基地引進(jìn)了雜交沙棘6個(gè)雌性沙棘品種和1個(gè)雄性沙棘品種，共計(jì)5 000多株。2016年是太谷試驗(yàn)區(qū)引種第4年，除了每年對(duì)物候期、適應(yīng)性及葉果產(chǎn)量調(diào)查外，還對(duì)太谷試驗(yàn)區(qū)各個(gè)品種以及本地的中國(guó)沙棘的化學(xué)成分進(jìn)行了測(cè)定。近年來(lái)，越來(lái)越多的人研究沙棘葉和果中的化學(xué)成分，溫秀鳳等[5]對(duì)親子群體沙棘葉黃酮成分含量及其變化進(jìn)行了研究；李春英等[6]進(jìn)行了沙棘不同部位總黃酮含量的測(cè)定及比較；李德鑫等[7]用HPLC法測(cè)定沙棘顆粒中的蘆丁含量；趙二勞等[8]測(cè)定了沙棘葉中綠原酸和蘆丁的含量；李敏等[9]用HPLC法同時(shí)測(cè)定中亞沙棘中的原兒茶酸、蘆丁和異鼠李素的含量；吳哲等[10]用HPLC測(cè)定了沙棘葉中科羅索酸的含量；田曉東等[11]對(duì)沙棘葉中科羅索酸的濃縮工藝進(jìn)行了研究；張璐等[12]確定了沙棘濃縮物中科羅索酸的測(cè)定方法；付陽(yáng)等[13]采用UPLC-ESIMS法同時(shí)測(cè)定沙棘黃酮中5種主要成分含量。但通過(guò)高效液相色譜法對(duì)太谷試驗(yàn)區(qū)的不同品種沙棘葉蘆丁含量的測(cè)定尚未見報(bào)道。

評(píng)價(jià)一個(gè)沙棘品種，不僅要從適應(yīng)性、葉果產(chǎn)量等方面入手，也要進(jìn)一步對(duì)其化學(xué)成分，尤其是生物活性物質(zhì)的含量進(jìn)行研究，方能對(duì)一個(gè)品種作出全面評(píng)價(jià)。本研究通過(guò)高效液相色譜法對(duì)水利部沙棘中心太谷試驗(yàn)區(qū)的6個(gè)品種以及本地野生中國(guó)沙棘葉中的蘆丁含量進(jìn)行了測(cè)定，旨在為品種鑒定以及進(jìn)一步的種植推廣提供參考。

1 材料和方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀，紫外可見檢測(cè)器，N3000色譜工作站，電子天平（AB104-N，瑞士梅特勒-托利多）；超聲波清洗機(jī)（KQ5200DB型，昆山市超聲儀器有限公司）；循環(huán)真空水泵（SHZ-Ⅲ型，上海亞榮生化儀器有限公司）；純水機(jī)（SMART-N，上?？道追治鰞x器設(shè)備有限公司）。

1.2 試劑

蘆丁對(duì)照品（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所），甲醇為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。

1.3 材料

供試6個(gè)雜交沙棘品種雜優(yōu)1號(hào)、雜優(yōu)2號(hào)、雜優(yōu)10號(hào)、雜優(yōu)12號(hào)、雜優(yōu)54號(hào)和豐寧雄的葉于2016年9月12日采自山西省太谷試驗(yàn)區(qū)。中國(guó)沙棘葉于2016年9月12日采自山西省祁縣。將沙棘葉置于干燥箱中60℃干燥后粉碎，過(guò)0.177 mm篩備用。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件色譜柱Diamonsil@C18（5 μm，4.6 mm×150 mm），流動(dòng)相甲醇-0.5%磷酸（33∶67），檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

1.4.2 溶液的配制

1.4.2.1 對(duì)照品溶液的配制精密稱取蘆丁對(duì)照品31.25 mg，置25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液。精密稱取2 mL儲(chǔ)備液，置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

1.4.2.2 供試品溶液的配制取沙棘葉粉末各5 g，置于50 mL錐形瓶中，加50 mL甲醇稱質(zhì)量，超聲提取45 min，取出放冷，再稱質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足失去的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，即得8種供試品。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁對(duì)照品色譜分析

在1.4.1色譜條件下得到蘆丁對(duì)照品的色譜圖，如圖1所示。

2.2 線性關(guān)系考察

分別精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液1，5，10，15，20 μL，在1.4.1色譜條件下，分別注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。以蘆丁的進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，得回歸方程y＝1.0×106x，r＝0.996 2（n＝5）。結(jié)果表明，對(duì)照品進(jìn)樣量為0.25～5 μg，蘆丁進(jìn)樣量與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖2）。

2.3 精密度試驗(yàn)

分別吸取1.25 mg/mL的蘆丁標(biāo)品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果表明，重復(fù)峰面積的RSD為1.32%，精密度較好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取沙棘雜優(yōu)2號(hào)9月供試品溶液6份，在1.4.1色譜條件下進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果表明，樣品中蘆丁平均含量為1.045%，RSD為1.43%，重復(fù)性較好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取沙棘雜優(yōu)2號(hào)9月供試品溶液，在1.4.1色譜條件下分別于0，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，蘆丁峰面積的RSD為1.03%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 加樣回收試驗(yàn)

分別稱取5份已知蘆丁含量的同一樣品粉末5 g，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶中分別加入相應(yīng)量的對(duì)照品溶液，按供試品溶液的制備方法制備5份供試品溶液，在1.4.1色譜條件下測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)中測(cè)定樣品中的蘆丁含量，加樣回收率均符合要求（表1）。

表1 沙棘加樣回收率試驗(yàn)考察結(jié)果

2.7 樣品含量測(cè)定

分別稱取不同沙棘葉樣品5 g，每樣平行3份，按1.4.2.2供試品溶液的配制方法制備供試品溶液，注入液相色譜儀，按1.4.1色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品中的蘆丁含量（表2）。

從表2可以看出，太谷試驗(yàn)區(qū)雜交品種中雜優(yōu)12號(hào)的蘆丁含量最高，為0.132 7%，與本地野生的中國(guó)沙棘相比基本一致，中國(guó)沙棘（♀）0.136 1%，中國(guó)沙棘（♂）0.146 6%，雜優(yōu)2號(hào)的蘆丁含量最低，為0.052 3%。

表2 不同品種沙棘葉蘆丁含量%

3 討論

目前對(duì)沙棘葉黃酮的測(cè)定主要是對(duì)總黃酮的測(cè)定，最初使用的方法有化學(xué)方法，如肖蓉等[14]根據(jù)黃酮類化合物與金屬離子形成穩(wěn)定的呈色螯合物這一性質(zhì)，應(yīng)用比色法測(cè)定醋柳總黃酮含量，之后使用較多的方法是分光光度法，如侯霄等[15]使用紫外分光光度法測(cè)定山西不同產(chǎn)地沙棘葉中總黃酮的含量。但對(duì)總黃酮中各成分含量的報(bào)道不多，鄒運(yùn)香等[16]、趙二勞等[8]使用了高效液相色譜法對(duì)黃酮各組分含量進(jìn)行測(cè)定，尤其是付陽(yáng)等[13]采用超高效液相-電噴霧質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定沙棘葉黃酮中5種組分的含量，這些都為植物提取物中化合物的測(cè)定提供了更準(zhǔn)確的方法。本研究首次采用高效液相色譜法測(cè)定了雜交品種和山西野生沙棘葉中蘆丁的含量，不僅為品種調(diào)查和鑒定提供依據(jù)，也為進(jìn)一步品種推廣和品種的開發(fā)利用提供參考。

蘆丁有降低毛細(xì)血管通透性和脆性的作用，保持及恢復(fù)毛細(xì)血管的正常彈性，用于防治高血壓、腦溢血、糖尿病、視網(wǎng)膜出血和出血性紫癜等，也有抗炎和抗過(guò)敏作用[17-20]。故不同沙棘品種葉中蘆丁的含量也可作為其藥用價(jià)值的一個(gè)指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，太谷試驗(yàn)區(qū)雜交品種中雜優(yōu)12號(hào)蘆丁含量最高，為0.132 7%，與本地野生的中國(guó)沙棘相比基本一致，中國(guó)沙棘（♀）0.136 1%，中國(guó)沙棘（♂）0.146 6%。也與趙二勞等[8]通過(guò)高效液相色普法所測(cè)定的五臺(tái)縣的野生中國(guó)沙棘的蘆丁含量為0.1%，寧武縣的野生中國(guó)沙棘的蘆丁含量為0.14%相一致。鄒運(yùn)香等[16]所采集的沙棘葉也是9月份在遼寧省建平縣的野生沙棘，與本試驗(yàn)采集沙棘葉的月份一致，所使用的測(cè)定方法也是高效液相色譜法，其中蘆丁含量為0.27%，高于山西祁縣的野生中國(guó)沙棘。

高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分離和分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。隨著先進(jìn)設(shè)備和科學(xué)的方法對(duì)沙棘化學(xué)成分深入和廣泛的研究，將進(jìn)一步推動(dòng)沙棘的開發(fā)和利用。

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Comparison of Rutin Content among Different Seabuckthorn Cultivars

ZHANGQiongshu1，WANGBin1，YANGXuefang1，ZHANGYangyang1，GUOHaili2，ZHANGXiaomin1
（1.College ofLife Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；
2.Shanxi Jinkehai BiotechnologyCo.，Ltd.，Taiyuan 030006，China）

The rutin level of seabuckthron was analysed by using a reversed phase HPLC method with Diamonsil@C18 chromatographic column（5 μm,4.6 mm×150 mm）,mobile phase methanol-0.5%phosphoric acid（33∶67）,a detection wavelength of 254 nm,a column temperature of 30℃,a flow rate of 1.0 mL/min,and sample size of 20 μL.Six hybrid seabuckthorn cultivars in the Taigu experimental area and one wild Chinese seabuckthorn（Hippophae rhamnoides L.subsp.sinensis Rousi）leaves were chosen.The results showed that the rutin levels of cultivar 1,cultivar 2,cultivar 10,cultivar 12,cultivar 54,Fengning male,Chinese seabuckthorn（♀）and Chinese seabuckthorn（♂）were 0.081 3%,0.052 3%,0.130 0%,0.132 7%,0.068 2%,0.136 1%and 0.146 6%,respectively. This study not only provides a reference for the identification,adaptability,and future application of seabuckthorn varieties,but also provides a basis for further product development.

Hippophae rhamnoides;rutin；reversed phase high performance liquid chromatography

S793.6

A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：1002-2481（2017）02-0200-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.02.13

2016-11-15

張瓊姝（1988-），女，山西晉中人，在讀碩士，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)。張小民為通信作者。