超高效液相色譜法測(cè)定糜子中4種B族維生素

田翔，王海崗，喬治軍

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與

遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山西太原030031）

超高效液相色譜法測(cè)定糜子中4種B族維生素

田翔1，王海崗1，喬治軍2

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與

遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山西太原030031）

建立同時(shí)測(cè)定糜子中4種B族維生素的超高效液相色譜法。糜子樣品用0.01 mol/L鹽酸超聲加熱溶解，醋酸鋅沉淀蛋白后提取濾液，采用Waters HCLASS超高效液相色譜儀，以C18柱為固定相，乙腈-1%甲酸溶液（pH＝2.63）為流動(dòng)相，流速0.25 mL/min梯度洗脫，利用紫外檢測(cè)器在波長(zhǎng)275 nm處進(jìn)行檢測(cè)，分析時(shí)間為11 min。結(jié)果表明，維生素B1，B2，B6，B9這4種維生素線性關(guān)系良好，R2均在0.999以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.42%～1.56%，回收率范圍為91.70%～101.02%。該法快速簡(jiǎn)便，精密度好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于同時(shí)測(cè)定糜子中水溶性維生素的含量，可對(duì)糜子營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，鑒選優(yōu)良種質(zhì)。

糜子；超高效液相；維生素B

糜子的基本結(jié)構(gòu)由4個(gè)部分組成，包括含有纖維素的麩皮，含較豐富營(yíng)養(yǎng)素的糊粉層，含大量淀粉的胚乳，富含蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、B族維生素和維生素E的谷胚[1]。糜子作為常見的谷物，是人們膳食金字塔中最基礎(chǔ)的部分，其最突出的營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)是含有豐富的B族維生素。

B族維生素是水溶性維生素中重要的一類，其中多種是酶的輔基和酶的組成部分[2]。當(dāng)人體內(nèi)缺乏B族維生素時(shí)，可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，而人體自身又無(wú)法合成這些化合物，必須通過(guò)食物或服用復(fù)合維生素制劑給予補(bǔ)充。隨著人們對(duì)生活品質(zhì)要求的提高以及復(fù)合維生素制劑及高檔營(yíng)養(yǎng)品的出現(xiàn)，測(cè)定谷物中B族維生素的含量引起了人們的廣泛關(guān)注。已有的B族維生素檢測(cè)方法很多[3-4]，如熒光法、微生物法、分光光度法、自動(dòng)測(cè)定法、高效液相色譜法[5-7]和高效毛細(xì)管電泳法[8]等。這些方法多是針對(duì)某個(gè)單一維生素的測(cè)定，且超高效液相色譜法用于糜子中B族維生素的測(cè)定還未見報(bào)道。

本研究采用HPLC建立了糜子中B族維生素的測(cè)定方法，對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行了研究，并對(duì)儀器測(cè)定條件各影響因素進(jìn)行了優(yōu)化。該方法簡(jiǎn)便快速，準(zhǔn)確可靠，對(duì)糜子樣品中水溶性維生素的測(cè)定具有重要的參考價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

維生素B1（硫胺素）、維生素B2（核黃素）、維生素B6（鹽酸吡多醇）、維生素B9（葉酸）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲酸、甲醇均為色譜純；氫氧化鈉、鹽酸、三氟乙酸、磷酸二氫鉀、醋酸鋅及辛烷磺酸鈉均為優(yōu)級(jí)純。實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。樣品材料為山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所提供的山西河曲紅糜子。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀（Waters HClass，美國(guó)waters）；色譜柱：C18（2.1 mm×100 mm，1.8 m）；電子天平（BSA124S，德國(guó)Sartorius）；高速離心機(jī)（5804R，德國(guó)Eppendorf）；恒溫水浴鍋（HHS，上海博訊）；漩渦混合器（VORTEX-5，海門市其林貝爾）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 維生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制分別準(zhǔn)確稱取10 mg維生素B1，B6標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL棕色容量瓶中，加入15 mL濃度為0.01 mol/L的鹽酸溶液并充分振蕩，超聲15 min，待全部溶解后，用0.01 mol/L的鹽酸溶液定容，即得質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的儲(chǔ)備液[9]。

分別準(zhǔn)確稱取7.5 mg維生素B2，B9標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL棕色容量瓶中，先用1.5 mL濃度為2 mol/L的NaOH溶液溶解后，再加0.01 mol/L的鹽酸溶液定容，超聲15 min，即得質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL的儲(chǔ)備液。低溫避光保存。

1.3.2 超高效液相色譜（UPLC）分析條件色譜柱為C18；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸（pH＝ 2.63）；柱溫20℃；紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)275 nm；進(jìn)樣體積5 μL；流速0.25 mL/min，采用梯度洗脫，梯度洗脫程序如表1所示，分析運(yùn)行時(shí)間11 min[10-12]。

表1 梯度洗脫程序

1.3.3 工作曲線的繪制分別吸取一定量的4種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配成不同系列的濃度，于2 mL離心管中配成0.05～2 g/mL的混標(biāo)溶液。按照1.3.2中的條件進(jìn)樣，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到4種維生素的線性方程，并以3倍信噪比計(jì)算相應(yīng)的檢出限[13]。

1.3.4 樣品預(yù)處理方法準(zhǔn)確稱取5 g樣品置于50 mL離心管中，用20 mL 0.01 mol/L的鹽酸溶解，于50℃超聲提取2 h，加入2 mL 15%醋酸鋅混勻，以4 000 r/min離心10 min。用吸管吸取上清液置于另一個(gè)50 mL的離心管中，對(duì)殘?jiān)凑丈鲜霾襟E再次加入20 mL提取液重復(fù)提取一次，合并提取液于50 mL離心管中，用水定容，混勻，取濾液過(guò)0.22 μm水系濾膜，待上機(jī)[14-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相選擇流動(dòng)相的pH值對(duì)這4種水溶性維生素的保留時(shí)間有影響，pH值越大，保留時(shí)間越短，但考慮到柱子的耐酸范圍，確定pH值為2.63時(shí)最佳。

考慮到流動(dòng)相的選擇對(duì)維生素的色譜分離效果影響較大，分別選擇了乙腈-0.01%三氟乙酸、甲醇-辛烷磺酸鈉及乙腈-0.1%甲酸作為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用乙腈-0.01%三氟乙酸作為流動(dòng)相對(duì)混標(biāo)液中4種維生素進(jìn)行分離測(cè)定時(shí)，色譜峰發(fā)生重疊，分離效果較差。辛烷磺酸鈉溶液本身色譜峰值較大且保留時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)體系干擾較大。乙腈-0.1%甲酸作為流動(dòng)相能較好地實(shí)現(xiàn)混標(biāo)液中4種維生素的分離，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相的分離效果較好，各維生素的出峰順序?yàn)椋壕S生素B1、維生素B6、維生素B9、維生素B2。

2.1.2 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇將4種水溶性維生素分別在190～700 nm處作紫外光譜掃描，得到各物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)，維生素B1為244 nm，維生素B2為266 nm，維生素B6為288 nm，維生素B9為280 nm。當(dāng)以乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)分別為260，275，280 nm時(shí)對(duì)混標(biāo)進(jìn)行分離。結(jié)果表明，波長(zhǎng)調(diào)整后所有維生素的色譜峰積分面積均減小。因此，275 nm為合適波長(zhǎng)。

2.1.3 流速對(duì)色譜分離效果的影響乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相，考察了流速分別為0.4，0.3，0.25mL/min時(shí)混標(biāo)的分離效果。結(jié)果表明，當(dāng)流速為0.25mL/min時(shí)分離效果最佳。

2.1.4 梯度洗脫條件在設(shè)定流動(dòng)相A和B在不同組成比例下的洗脫狀況，根據(jù)4種維生素色譜峰的峰形、分離度和色譜分析時(shí)間，確定了流動(dòng)相A，B在梯度起始和結(jié)束時(shí)的組成比例以及洗脫程序[16]。色譜條件：流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%甲酸，在4min內(nèi)增加乙腈比例可以明顯縮短檢測(cè)時(shí)間，并增大分離度。

2.2 單標(biāo)的UPLC圖譜

在最優(yōu)條件下掃描4種維生素標(biāo)準(zhǔn)品的UPLC圖譜，維生素B1，B6，B9，B2標(biāo)準(zhǔn)品的UPLC保留時(shí)間依次為0.520，0.990，5.572，6.019 min。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限

以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)c，峰面積為縱坐標(biāo)y，得到回歸方程[17]。4種水溶性維生素均具有良好的線性，R2＞0.999，滿足檢測(cè)需要。方法的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限結(jié)果列于表2。在本試驗(yàn)方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件下，取一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行超高效液相色譜測(cè)定，以峰面積y對(duì)濃度c（μg/mL）做圖，找出線性關(guān)系，并確定方法的最低檢測(cè)限。

表2 4種維生素的線性回歸方程與檢出限

2.4 精密度與回收率

本研究方法的回收率實(shí)驗(yàn)選用已知B族維生素含量的糜子樣品為基質(zhì)，設(shè)定了3個(gè)添加水平，對(duì)每個(gè)濃度樣品進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)[18]，測(cè)得4種水溶性維生素回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。維生素B1，B2，B6，B9的RSD分別為1.32%，0.42%，1.56%和0.92%，測(cè)定回收率分別為96.34%，97.01%，91.70%和101.02%，其回收率在91.70%～101.02%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于2%。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

分別用所建立的超高效液相色譜法測(cè)定糜子樣品中的水溶性維生素，得到的實(shí)際測(cè)定數(shù)據(jù)與國(guó)標(biāo)法實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較，結(jié)果表明，相對(duì)誤差在1.5%～2.1%，均在允許范圍內(nèi)，說(shuō)明此法測(cè)得的糜子樣品的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，適用于糜子及谷物中水溶性維生素的同時(shí)測(cè)定。糜子中維生素B1，B2，B6，B9的含量分別為1 233.838，326.191，1 759.678，724.676 μg/100 g（圖2）。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)進(jìn)行測(cè)定糜子中的維生素B1，B2，B6，B9等4種水溶性維生素UPLC法，樣品經(jīng)0.1%甲酸超聲提取，醋酸鋅沉淀蛋白，通過(guò)UPLC進(jìn)行檢測(cè)，11 min內(nèi)可完成4種水溶性維生素含量的測(cè)定，通過(guò)對(duì)高效液相色譜法條件的優(yōu)化，控制流動(dòng)相的pH值，可明顯地改善峰形和分離度，使用超高效液相色譜儀后縮短了保留時(shí)間，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度、精密度[19-20]。測(cè)定結(jié)果與國(guó)標(biāo)法測(cè)定數(shù)據(jù)相比，結(jié)果均在允許范圍內(nèi)，可對(duì)較寬濃度范圍內(nèi)的糜子多種水溶性維生素進(jìn)行同步分析，有助于提高糜子檢測(cè)的分析效率，降低成本，豐富糜子水溶性維生素品質(zhì)評(píng)價(jià)體系，鑒選糜子優(yōu)良種質(zhì)。

4 討論

本研究將糜子中的4種B族維生素分離分析，實(shí)驗(yàn)中提取溫度過(guò)高和光照對(duì)B族維生素可能產(chǎn)生破壞，但低溫提取率降低，因此，選擇酸性條件下超聲提取，也有用淀粉酶和高溫壓力提取技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)的提取條件較為簡(jiǎn)單可操作。今后應(yīng)對(duì)糜子中的其他水溶性有機(jī)物進(jìn)行定性定量研究，對(duì)提取方法進(jìn)行探索，盡量避免其他物質(zhì)如色素等產(chǎn)生，本研究只是一個(gè)初步結(jié)果，今后將對(duì)糜子中的B族維生素化合物進(jìn)行全面探索研究。

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Simultaneous Determination of Four Water-soluble B Vitamins inPanicum miliaceumL.by Ultra Performance Liquid Chromatography

TIANXiang1，WANGHaigang1，QIAOZhijun2
（1.KeyLaboratoryofCrop Gene Resources and GermplasmEnhancement on Loess Plateau，MinistryofAgriculture，Shanxi Key LaboratoryofGenetic Resources and Genetic Improvement ofMinor Crops，Institute ofCrop GermplasmResources，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；2.Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

To establish simultaneous determination of 4 kinds of water-soluble vitamin B in Panicum miliaceum L.used by ultra performance liquid chromatography（UPLC）,samples were dissolved by ultrasonic heating with 0.01 mol/L of hydrochloric acid and filtrate was extracted after protein was precipitated byzinc acetate.C18was stationary phase and acetonitrile-1%formic acid solution was moving phase.Gradient elute was done at the rate of 0.25 mL/min.Detection was done at 275 nm of wave length used by ultraviolet detector and analysis time was 11 min.The result showed that linear relations of vitamin B1,vitamin B2,vitamin B6,and vitamin B9were good.Average value of R2was over 0.999.Relative standard deviation was 0.42%-1.56%,while recovery rate was 91.70%-101.02%. The method is fast,convenient,accurate and reliable,can be applied in determining content of water soluble vitamin and appraising and selectingexcellent Panicum miliaceum L.germplasmresources.

Panicum miliaceum L;UPLC;vitamin B

S516

A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：1002-2481（2017）02-0183-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.02.08

2016-07-14

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-07-13.5）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院攻關(guān)項(xiàng)目（ygg1514）

田翔（1982-），女，山西太原人，助理研究員，碩士，主要從事農(nóng)作物品質(zhì)分析研究工作。喬治軍為通信作者。