利用獼猴桃果肉簡化“DNA粗提取與鑒定”實驗

趙 婕

(江蘇省南京田家炳高級中學 210037)

“DNA的粗提取與鑒定”是人教版高中生物學教材選修一《生物技術實踐》中的重要內(nèi)容。同時，也是現(xiàn)行生物學課程中唯一的分子生物學實驗。通過本實驗的操作，學生將進一步了解DNA的理化性質(zhì)，掌握DNA粗提取與鑒定的方法和原理。

1 材料選擇

教材中重點介紹的材料是雞血，但該實驗材料有些不足之處：如實驗步驟煩瑣、成功率較低，學生很難在一節(jié)課時間內(nèi)完成實驗；近年禽流感頻發(fā)，雞血中可能會攜帶某些病原體，危害人體健康；材料不易獲取和長期保存。同樣，其他動物材料也存在類似的不足。其實，該實驗也可選擇植物材料：如菜花、洋蔥和香蕉，但其核DNA數(shù)相對較少，在實驗中可能效果不太明顯。

因此，為了取得較好的實驗效果，選擇一種替代材料就顯得十分重要。經(jīng)過查閱文獻資料[1]，發(fā)現(xiàn)獼猴桃中DNA數(shù)量較多，取材容易、價格適宜。根據(jù)計劃，本節(jié)內(nèi)容的講授時間在12月份左右，正是本市獼猴桃大量上市的季節(jié)。因此，獼猴桃可為實驗教學提供數(shù)量充足、性價比高的實驗材料。

2 實驗原理

為做好該實驗，學生必須進行以下的知識儲備：①DNA的物理、化學性質(zhì)，尤其是DNA的溶解性知識；②DNA粗提取的方法以及DNA提純的方法；③二苯胺法鑒定DNA的方法和原理。

實驗前，學生已理解DNA和蛋白質(zhì)對酶、高溫和洗滌劑的耐受性不同，蛋白酶能分解蛋白質(zhì)，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分離，DNA的耐熱性比蛋白質(zhì)強，一定限度內(nèi)的加熱，可以使蛋白質(zhì)變性，從而與DNA分離。DNA不溶于酒精溶液，但是細胞中的某些物質(zhì)(蛋白質(zhì)、糖類、脂類、鹽類等其他物質(zhì))則可以溶于酒精溶液。利用這一原理，可以進一步提取出含較少雜質(zhì)的DNA。

教材中介紹用二苯胺法鑒定DNA的方法，教師可以引導學生結合教材中的資料，簡單講述二苯胺法鑒定DNA的化學原理及方法，向?qū)W生介紹一下采用其他的方法也可鑒定DNA，如電泳法、紫外燈照射法等。

3 優(yōu)化過程

3.1 提取DNA的步驟 具體如下：

3.1.1 取材 將3種獼猴桃(國產(chǎn)獼猴桃、新西蘭綠果和新西蘭黃金果)置于2℃環(huán)境下，24 h后各稱取30 g，去皮，切碎。并將碎獼猴桃放入塑封袋中充分研磨。

3.1.2 DNA的溶解與釋放 在塑封袋中倒入30 mL提取緩沖液(10 mL洗滌液與20 mL 2 mol/L NaCl溶液混合)，2 g嫩肉粉，充分研磨5 min，使緩沖液與獼猴桃細胞充分反應，制成混合物。

3.1.3 除雜 將混合物放入60℃的恒溫水浴中保溫15 min。

3.1.4 過濾 將獼猴桃研磨液通過紗布過濾到燒杯中，得到含有DNA的濾液。

3.1.5 DNA的析出 取20 mL的DNA濾液，倒入等體積的體積分數(shù)為95%的預冷酒精溶液中，沉淀5～10 min后，可見白色的DNA絮狀物出現(xiàn)。用玻璃棒緩緩旋轉(zhuǎn)，將絮狀物纏繞在玻璃棒上。3種獼猴桃實驗材料都可以得到較明顯的析出粘稠絮狀物，且國產(chǎn)和進口獼猴桃析出物差別不大。

3.2 DNA的鑒定 將3只試管各加入5 mL 2 mol/L的NaCl溶液，加入提取的DNA，再加入4 mL新配置的二苯胺溶液混勻，沸水浴加熱10 min左右，3種獼猴桃都出現(xiàn)明顯的藍色。

4 實驗分析

4.1 DNA提取 DNA酶含量在不少種類的細胞中都很高[2]，根據(jù)酶的特性，低溫下DNA酶的活性降低，降解DNA較少。在實驗前將實驗材料低溫處理，可得到更多析出的DNA。本實驗后續(xù)也可對實驗材料的DNA酶最適溫度進行進一步的探究。

4.2 除雜 洗潔精中含有SDS(十二烷基硫酸鈉)，能夠裂解細胞膜，有利于DNA從細胞中釋放，具有使蛋白質(zhì)變性、與DNA分離的作用，有利于提取DNA。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60℃～80℃的高溫，而DNA在80℃以上才會變性。嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能分解蛋白質(zhì)但不分解DNA，且作用的最適溫度是55℃～60℃。此步驟是成敗的關鍵，可以去除大量的蛋白質(zhì)、脂肪及多糖等物質(zhì)。但獲得的DNA粗制品濾液中，可能還含有少量核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)。如果想進一步提純DNA，除上述提到的提純方法外，也可用高鹽濃度的溶液溶解DNA(如2 mol/L的NaCl溶液)，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)，用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。

因此，通過反復溶解與析出DNA，就能夠進一步除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。提純的方法很多，教學過程中可引導學生搜集有關資料、信息等，進行思維拓展。

4.3 DNA鑒定 二苯胺法鑒定DNA時，若溶液呈藍色，說明實驗基本成功。藍色較深，說明提取的DNA量較多。如果不出現(xiàn)藍色，可能所提取的DNA含量低，或是實驗操作中出現(xiàn)錯誤，需要重新進行實驗。從實驗結果可看出，使用獼猴桃作為實驗材料，顏色反應明顯，可提取到較多且較純的DNA，且國內(nèi)外獼猴桃品種在本實驗中沒有明顯的區(qū)別。

5 反思與建議

“DNA的粗提取與鑒定”實驗采用獼猴桃作為實驗材料可以簡化提取過程、縮短操作時間、提高實驗效率、使實驗現(xiàn)象明顯，大部分學生可在一節(jié)課內(nèi)完成實驗，保證實驗課的正常開展。

另外，對于DNA的粗提取與鑒定，如果由學生利用課外時間去實驗室繼續(xù)進行探究，可采用不同的實驗方法、選取不同的實驗材料，同種材料還可采用不同的方法。教學中要引導學生從多方面比較不同方法、不同材料得出的實驗結果，如DNA的純度、DNA的顏色及二苯胺顯色的深淺等。讓學生寫出實驗報告，教師適時做出評價。