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    變應(yīng)性鼻炎對小鼠嗅覺神經(jīng)元的作用

    2017-02-18 09:19:24宋宮儒安麗娜2彭碧波
    關(guān)鍵詞:嗅覺酸性粒細(xì)胞

    宋宮儒,安麗娜2,彭碧波

    變應(yīng)性鼻炎對小鼠嗅覺神經(jīng)元的作用

    宋宮儒1,安麗娜2,彭碧波1

    目的 探討變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)對嗅覺神經(jīng)元(olfactory sensory neuron,OSN)的作用。方法 以卵清蛋白建立野生型BALB/c小鼠AR模型(AR組,n=15),并采用隨機(jī)數(shù)字表法設(shè)置正常對照組(n=15)。通過埋藏食物小球?qū)嶒?yàn)(buried food pellet test,BFPT)對小鼠進(jìn)行嗅覺檢測,以蛋白質(zhì)免疫印跡法(western blot)檢測小鼠嗅區(qū)黏膜內(nèi)OSN凋亡程度及其與嗜酸性粒細(xì)胞的相關(guān)性。結(jié)果 (1)AR組小鼠BFPT所用時間較對照組顯著延長[(18.71±3.93)s vs(12.53±2.70)s, t=5.01,P<0.05];(2)與對照組相比,AR組小鼠鼻嗅黏膜內(nèi)成熟OSN嗅標(biāo)識蛋白(olfactory marker protein,OMP) 顯著降低(t=15.55, P<0.05),凋亡通路Caspase-3(t=10.98, P<0.05)及嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶[(eosinophil peroxidase,EPX),(t=33.52, P<0.05)]顯著增多;(3)AR組小鼠鼻嗅黏膜內(nèi)Caspase-3與EPX蛋白呈正相關(guān)(r=0.78,P<0.05)。結(jié)論 AR狀態(tài)下嗜酸性粒細(xì)胞向嗅黏膜內(nèi)浸潤,可損傷OSN造成神經(jīng)性嗅覺減退。

    變應(yīng)性鼻炎;嗅覺減退;嗅覺神經(jīng)元;嗜酸性粒細(xì)胞

    變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是一種鼻科常見病,以鼻黏膜接觸變應(yīng)原后迅速引發(fā)由IgE介導(dǎo)的非感染性炎性反應(yīng)為病理學(xué)特征[1]。嗅覺減退是AR主要癥狀之一,患者群中發(fā)病率為10%~88%[2]。與季節(jié)性AR相比,常年性AR患者嗅覺減退癥狀的嚴(yán)重程度及發(fā)作頻率更為顯著[3]。一般認(rèn)為,AR導(dǎo)致嗅覺減退的主要病理機(jī)制是由于鼻呼吸黏膜(nasal respiratory mucosa,NRM)水腫及分泌物增多,導(dǎo)致鼻腔通氣功能受限,鼻嗅黏膜內(nèi)嗅覺神經(jīng)元(olfactory sensory neuron,OSN)感知的氣味分子數(shù)量減少。因與傳導(dǎo)性聽力損失相似,有學(xué)者將鼻腔通氣機(jī)械性阻塞而引起嗅覺功能下降稱之為傳導(dǎo)性嗅覺減退[2]。然而臨床研究發(fā)現(xiàn),給予AR患者鼻噴腎上腺素緩解NRM水腫程度后,嗅覺無明顯改善[4],提示NRM病變并不是AR導(dǎo)致嗅覺減退的唯一病因。

    2010年,Sivam等[5]首先報道了季節(jié)性AR患者鼻嗅黏膜中存在嗜酸性粒細(xì)胞浸潤;同年,Ozaki等[6]通過卵清蛋白腹腔致敏及鼻腔刺激的方法建立AR模型小鼠,發(fā)現(xiàn)AR小鼠鼻嗅黏膜內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞分布于OSNs軸突束周圍,提示AR狀態(tài)下鼻嗅黏膜內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞可能參與損傷OSNs。因此,筆者依據(jù)上述假設(shè)開展動物模型研究,以嗅標(biāo)識蛋白(olfactory marker protein,OMP)標(biāo)識成熟OSN,以經(jīng)典凋亡標(biāo)記物半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)標(biāo)識凋亡OSN,以嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶(eosinophil peroxidase,EPX)標(biāo)識嗜酸性粒細(xì)胞。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法(western blot)檢測AR小鼠鼻嗅黏膜內(nèi)OSN凋亡情況,以研究AR對于小鼠嗅覺功能的影響及AR狀態(tài)下小鼠鼻嗅黏膜內(nèi)OSN凋亡及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤及二者相互關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物 8周齡BALB/c 雌性小鼠30只,無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級,由北京維通利華公司提供[實(shí)驗(yàn)動物證編號:33214]。飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動物室,給予標(biāo)準(zhǔn)化配方飼料及過濾純水。飼養(yǎng)環(huán)境為12 h晝夜交替,溫度為22~24℃,濕度55%~70%。

    1.2 儀器及耗材 醫(yī)用超聲霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司);有機(jī)玻璃霧化箱(山東泰安市儀器設(shè)備制造廠);10~100 μl移液槍(美國Eppendorf公司);高速離心機(jī)、Thermo病理切片機(jī)購自美國Thremofisher公司;超凈工作臺、-80℃冷藏柜購自Thermo公司;Ⅳ級卵清蛋白及明礬(上海Sigma-Aldrich公司);磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)購自上海Gibco公司;10%水合氯醛(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院);小鼠血清卵清蛋白特異性IgE酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunoassay,ELISA)試劑盒(美國Chondrex公司);兔抗小鼠OMP多克隆抗體、兔抗小鼠Caspase-3多克隆抗體購自美國Abcam公司;山羊抗小鼠EPX多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。

    1.3 建立AR模型小鼠 采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只BALB/c雌鼠分為AR組與對照組,每組15只。AR模型建立分前期致敏階段與后期刺激階段。于第0天和第7天,將10 μg卵清蛋白及2 mg明礬溶于0.5 ml PBS后注射入AR組及對照組小鼠腹腔。第14日始,AR組開始接受1%卵清蛋白(10 mg/ml PBS)霧化吸入,1次/d,30 min/次,連續(xù)14 d。同時間內(nèi),對照組接受PBS霧化吸入。第30天,兩組小鼠行行為學(xué)嗅覺測試后處死,取材。以血清卵清蛋白特異性IgE升高與NRM嗜酸性粒細(xì)胞浸潤作為小鼠AR模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)[7]。

    1.4 行為學(xué)測試 采用埋藏食物小球?qū)嶒?yàn)(buried food pellt test,BFPT)對AR組及對照組小鼠進(jìn)行嗅覺檢測,BFPT參照經(jīng)典方法[8]。選取形狀一致的新鮮鼠料以減少外源性食物味道干擾。實(shí)驗(yàn)前小鼠空腹24 h,測試前將食物小球埋在鼠料表面以下5 cm處,記錄小鼠從被隨機(jī)放置于盒子中開始,到揭開食物小球并用前爪或牙齒抓住食物小球的時間,如果5 min(300 s)內(nèi)小鼠未找到食物小球,即被移走。

    1.5 血清卵清蛋白特異性IgE檢測 將AR組與對照組小鼠以10%水合氯醛0.6 ml深度麻醉,固定于動物解剖臺,頸部與腹部常規(guī)消毒、鋪巾,以眼科剪暴露小鼠心臟,將1 ml注射器垂直刺入小鼠右心房,抽取靜脈血0.2~0.3 ml,收集血液標(biāo)本于4℃離心機(jī)14000 r/min,高速離心5 min以分離血清,每管分裝。按照ELISA試劑盒說明書測量血清中卵清蛋白特異性IgE濃度。

    1.6 小鼠鼻黏膜獲取及嗜酸性粒細(xì)胞檢測 暴露深度麻醉小鼠的心臟,自心尖部灌注生理鹽水30 ml,至肝、肺等器官顏色退色。取下小鼠頭部,去除頭部軟組織。一部分小鼠以兩側(cè)鼻骨為解剖標(biāo)志物,行矢狀位切割,顯露小鼠鼻中隔兩側(cè)嗅區(qū)黏膜和呼吸區(qū)黏膜,分別在顯微鏡下剝離獲取嗅區(qū)黏膜后,在-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩A硪徊糠中∈箢^骨置于10%甲醛內(nèi)固定處理,并過夜保存。以小鼠上腭表面切牙(截面Ⅰ),第2腭嵴(截面Ⅱ)及第2上磨牙(截面Ⅲ)為解剖標(biāo)志物,行冠狀位切割,從而將每只小鼠鼻腔分為3份組織塊,標(biāo)記后的組織塊經(jīng)乙醇梯度脫水,二甲苯透明后,浸潤石蠟;將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī),以4 μm為層厚,切成薄片。切下薄片放入45℃水中鋪平,貼至載玻片表面,放60℃恒溫箱過夜烘干。蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosinstaining,HE)染色,組織病理學(xué)觀察肥大細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量。

    1.7 小鼠鼻嗅黏膜中OMP,Caspase-3及EPX蛋白western blot法檢測 將各組小鼠鼻嗅黏膜組織立即投入液氮中,后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存,將組織置于2.0 ml平頭離心管中,加入冰冷的含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液,用機(jī)械勻漿器冰浴中勻漿30 s,置于冰上靜止15 min,4℃離心10 min(15000 g),上清即為組織總蛋白。蛋白定量變性后,吸取50 μg總蛋白的組織液加入電泳緩沖液,進(jìn)行SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)入到PVDF膜后,再移至到含有5%脫脂奶粉平皿中室溫封閉2 h,加入OMP,Caspase-3或EPX一抗,4℃孵育過夜,漂洗后加入二抗,最后使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)法顯示目的蛋白,內(nèi)參蛋白選用β-肌動蛋白(β-actin),目的蛋白與內(nèi)參蛋白的光密度(optical density,OD)值比較即該樣本蛋白表達(dá)的計量資料。

    1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析,計量資料符合正態(tài)分布,以x ±s表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以雙側(cè)P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Pearson方法進(jìn)行相關(guān)性分析,計算相關(guān)系數(shù)。

    2 結(jié) 果

    2.1 小鼠AR模型的建立 血清卵清蛋白特異性IgE方面,AR組小鼠平均血清卵清蛋白特異性IgE濃度為(114.28±15.28)ng/ml高于對照組的(24.50±4.49)ng/ml,兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=20.07,P<0.05,圖1A)。NRM及鼻嗅黏膜嗜酸性粒細(xì)胞浸潤方面,由圖1B所示:AR組小鼠NRM固有層中嗜酸性粒細(xì)胞顯著分布于血管周圍,鼻嗅黏膜固有層中少量嗜酸性粒細(xì)胞散在分布,而NRM及鼻嗅黏膜上皮層中均無嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。對照組NRM及鼻嗅黏膜固有層及上皮層中均未發(fā)現(xiàn)明顯嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。

    圖1 兩組小鼠血清卵清蛋白特異性IgE濃度及染色

    2.2 行為學(xué)測試結(jié)果 BFPT中,AR組小鼠找到食物小球時間為(18.71±3.93)s,對照組為(12.53±2.70)s,AR組較對照組時間顯著延長,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.01,P<0.05)。

    2.3 小鼠鼻嗅黏膜中OMP,Caspase-3及EPX蛋白western blot法檢測結(jié)果及相關(guān)性分析 AR組小鼠鼻嗅黏膜內(nèi)成熟OSN標(biāo)志物OMP較對照組降低(t=15.55,P<0.05),而鼻嗅黏膜內(nèi)凋亡OSN 標(biāo)志物Caspase-3(t=10.98,P<0.05)及嗜酸性粒細(xì)胞標(biāo)記物EPX(t=33.52,P<0.05)較對照組明顯升高,見圖2、圖3。AR組小鼠鼻嗅黏膜內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞標(biāo)志物EPX與凋亡OSN標(biāo)記物Caspase-3 呈正相關(guān)(r=0.78,P<0.05,圖4)。

    圖2 兩組小鼠鼻嗅黏膜中OMP,Caspase-3及EPX蛋白western blot

    圖3 兩組小鼠鼻嗅黏膜中OMP,Caspase-3及EPX蛋白western blot法檢測結(jié)果

    圖4 AR組小鼠鼻嗅黏膜內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞標(biāo)志物EPX與凋亡OSN標(biāo)記物Caspase-3相關(guān)性分析

    3 討 論

    嗅覺減退是AR主要癥狀之一,卻常易被AR患者所忽視。嗅覺減退可引起食欲減退、情緒低落及無法識別危險信號(食物霉變、煤氣泄漏)等一系列問題,影響患者生活質(zhì)量[9]。一直以來,AR導(dǎo)致嗅覺減退的病因被歸結(jié)于NRM炎性水腫及鼻分泌物分泌過多,到達(dá)鼻嗅黏膜區(qū)域的氣味分子減少。臨床研究證實(shí),AR患者嗅覺減退程度與NRM典型變應(yīng)性炎性反應(yīng)介質(zhì)(如嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白、肥大細(xì)胞胰蛋白酶)濃度呈正相關(guān)性[10,11]。但是另有一部分研究也發(fā)現(xiàn),降低鼻腔NRM炎性水腫,并不能從客觀上改善AR患者嗅覺功能,因此,除了傳導(dǎo)性因素,AR導(dǎo)致嗅覺減退還存在其他潛在機(jī)制。近期臨床研究與動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AR狀態(tài)下,鼻嗅黏膜內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤現(xiàn)象,提示其在鼻嗅黏膜具有潛在影響作用[5,6]。因此,筆者在此基礎(chǔ)上通過建立AR模型小鼠,發(fā)現(xiàn)在AR狀態(tài)下:(1)鼻嗅黏膜內(nèi)OSN凋亡導(dǎo)致神經(jīng)性嗅覺減退;(2)鼻嗅黏膜內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤,與OSN凋亡正性相關(guān)。

    鼻嗅黏膜是由位于上皮表層OSN、支持細(xì)胞及上皮基底層的嗅神經(jīng)干細(xì)胞——水平基細(xì)胞構(gòu)成。OSN軸突穿透基底膜后鼻嗅黏膜固有層內(nèi)匯集成束,穿越篩孔與嗅球形成突觸,向神經(jīng)中樞傳遞嗅覺信號[12]。區(qū)別于其他絕大多數(shù)外周神經(jīng),OSN暴露于外界環(huán)境,嗅覺功能可隨時間發(fā)生下降[13]。生理狀態(tài)下,OSN能夠啟動自身程序性凋亡,并由水平基細(xì)胞分化成為新的成熟OSN。二者之間保持動態(tài)平衡狀態(tài),維持嗅覺感知所必須OSN數(shù)量的過程稱為神經(jīng)自穩(wěn)[12]。而在本研究中,筆者發(fā)現(xiàn)正常小鼠鼻嗅黏膜內(nèi)即存在Caspase-3蛋白表達(dá),反映了生理狀態(tài)下OSN存在凋亡的現(xiàn)象。而AR模型小鼠鼻嗅黏膜內(nèi)Caspase-3蛋白較對照組小鼠顯著升高,而成熟OSN蛋白標(biāo)記物OMP顯著降低,表明AR可導(dǎo)致OSN發(fā)生凋亡,破壞了鼻嗅黏膜內(nèi)OSN神經(jīng)自穩(wěn)狀態(tài)。

    AR可導(dǎo)致小鼠鼻嗅黏膜內(nèi)OSN大量凋亡,但其機(jī)制仍不清楚。既往研究發(fā)現(xiàn)OSN可因直接接觸吸入鼻腔的真菌、病毒或化學(xué)物刺激發(fā)生凋亡,其目的可能是避免上述刺激物通過OSN軸突進(jìn)入神經(jīng)中樞[14,15]。研究者發(fā)現(xiàn)AR模型小鼠鼻嗅黏膜存在嗜酸性粒細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。Li等[7]通過甲苯胺藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)AR模型小鼠鼻嗅黏膜固有層中肥大細(xì)胞具有特征性的脫顆粒表現(xiàn)。肥大細(xì)胞顆粒中存在多種嗜酸性細(xì)胞趨化因子參與嗜酸性粒細(xì)胞向特定組織內(nèi)浸潤。本研究發(fā)現(xiàn),鼻嗅黏膜內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞與OSN凋亡Caspase-3 蛋白水平呈正相關(guān)。Lane等[16]通過觀察慢性鼻-鼻竇炎模型小鼠鼻嗅黏膜提出假說,當(dāng)鼻嗅黏膜內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤,特別是嗜酸性粒細(xì)胞緊密圍繞在OSN軸突束周圍,可對OSN軸突造成擠壓,使OSN軸突無法從嗅球運(yùn)輸營養(yǎng)成分至OSN胞體,導(dǎo)致OSN凋亡。嗜酸性粒細(xì)胞可通過釋放腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)結(jié)合OSN表面TNF受體,啟動OSN細(xì)胞內(nèi)凋亡前通路引發(fā)細(xì)胞內(nèi)Caspase級聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)OSN凋亡[17]。

    總之,AR狀態(tài)下,NRM炎性水腫及鼻嗅黏膜內(nèi)OSN凋亡分別構(gòu)成了嗅覺減退的傳導(dǎo)性及神經(jīng)性因素。在較為充分的前期研究和合理的理論依據(jù)基礎(chǔ)之上,如能在動物實(shí)驗(yàn)AR嗅覺的病理機(jī)制和作用規(guī)律進(jìn)行深入研究和探索,加深研究者對AR狀態(tài)下嗅覺減退機(jī)制的理解,未來可較為客觀的對臨床用藥在嗅覺安全性方面進(jìn)行評價,為向患有嗅覺減退的AR患者提出更具針對性和更安全的治療方案提供科學(xué)依據(jù)。

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    (2016-12-12 收稿 2016-12-29 修回)

    (本文編輯 付 輝)

    Effect of allergic rhinitis on olfactory sensory neuron in mice

    SONG Gongru1, AN Li'na2, and PENG Bibo1. 1. Institute of Disaster Medicine, 2. Department of Anesthesia Surgery, General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Beijing 100039, China

    PENG Bibo, E-mail: pengbibo0610@126.com

    Objective This study aimed to explore the effects of allergic rhinitis (AR) on olfactory sensory neurons (OSN) in mice. Methods An AR model of BALB/c mice was established by ovalbumin exposure (AR group, n=15), and wild-type BALB/c mice were set as the control group (n=15). The olfaction ability of the mice was detected by buried food pellet test (BFPT). The degree of OSN apoptosis in olfactory mucosa as well as its correlation with eosinophils were evaluated with the western blot analytical technique. Results (1) The mean time of BFPT in AR group was significantly longer than that the control group [(18.71±3.93)s vs (12.53±2.70) s, t=5.01,P<0.05]; (2) When compared with the control group, the olfactory marker protein (OMP) of mature OSN in the nasal olfactory mucosa of AR group was significantly decreased (t=15.55, P<0.05), whereas Caspase-3 in apoptosis pathway and eosinophil peroxidase (EPX) protein were significantly increased (t=10.98, P<0.05; t=33.52, P<0.05); (3) There was a positive correlation between Caspase-3 and EPX proteins in the nasal olfactory mucosa of mice in AR group (r=0.78,P<0.05). Conclusions In the setting of AR, eosinophils infiltrated into olfactory mucosa induced sensorineural olfactory loss by exerting a detrimental effect on OSNs.

    allergic rhinitis; olfactory loss; olfactory sensory neuron; eosinophil

    R765

    10.13919/j.issn.2095-6274.2017.02.007

    100039 北京,武警總醫(yī)院:1. 災(zāi)害救援醫(yī)學(xué)研究所,2. 麻醉手術(shù)科

    彭碧波,E-mail:pengbibo0610@126.com

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