揮發(fā)性有機化合物在腫瘤早期篩查中的研究進展

董國璋綜述，許 林審校

0 引 言

癌癥是世界上第二大死亡原因，到2030年，估計死亡人數將增加1310萬[1]，其特征在于細胞不受控制的增殖，并且可在身體任何部位發(fā)育。我國目前已經成為腫瘤發(fā)病率和病死率第一的國家[2]，并且腫瘤的發(fā)病率和病死率仍在逐漸增長。盡管目前腫瘤的治療方法在手術治療、靶向治療、免疫治療等領域取得了諸多進展，但是腫瘤的生存率改善仍然有限，5年生存率依舊不高。因為大部分的腫瘤患者在確診時已經處于中晚期或已經發(fā)生了遠處轉移。因此，如果能較早發(fā)現腫瘤并進行治療干預，將會提高患者的5年生存率。

揮發(fā)性有機物(volatile organic compounds，VOCs)是指常溫下以蒸汽形式存在于空氣中的一類有機物，美國環(huán)境保護委員會將蒸氣壓小于0.1 mmHg設定為VOCs的判定標準。人體內VOCs可根據來源分為內源性和外源性的VOCs[3]。內源性的VOCs主要由細胞的基礎功能如維持細胞膜完整性、能量代謝、氧化應激等過程產生[4]。外源性的VOCs主要存在于呼氣中，這些VOCs從外界吸入并且同內源性的VOCs一起呼出。揮發(fā)性有機化合物是細胞代謝的最終產物，可能是由于癌細胞的基因或蛋白質改變導致細胞膜氧化應激或過氧化而產生的。揮發(fā)性有機碳可反映任何因炎癥、壞死、癌癥退化、微生物區(qū)系改變而引起的代謝變化，也可與環(huán)境污染、藥物和飲食[5]等外部因素有關。這些代謝物被釋放到血液中，在體內的任何地方產生，均會到達肺泡、腎小管和消化道中。在過去的二十年里，VOCs檢測已經應用于各種臨床場景。本文將對各種揮發(fā)性有機物分析在腫瘤中的研究現狀作一綜述。

1 揮發(fā)性有機物檢測方法

1.1 GC-MSGC-MS是目前應用最為廣泛的揮發(fā)性有機物檢測方法。1971年，Pauling等[6]率先對代謝物的揮發(fā)性部分進行了分析，使用氣相色譜-質譜儀(Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)描述了人類呼氣和尿液中約250種揮發(fā)性有機化合物的存在。1985年Gordon等[7]首次使用GC-MS測定了肺癌患者呼氣中VOCs。自此，VOCs分析在癌癥檢測的臨床潛力引起了人們的興趣，最近30年來發(fā)表的論文數量迅速增加也有力證明了這一點。同時，不僅是肺癌，在很多其他癌種中GC-MS測定VOCs都表現出了不錯的效果。GC-MS可對樣品中的揮發(fā)性分子進行物理分離，并隨后對其性質和數量進行鑒定，以確定被分析樣品的確切組成。通過提供有關樣本成分的定性和定量信息，這種分析技術可識別與健康對照組相比的腫瘤患者的代謝特征。目前，關于GC-MS測定VOCs的臨床研究已經在陸續(xù)開展，這些研究大多采用病例對照的方法。選擇腫瘤患者為病例組，非臨床診斷為腫瘤的健康患者為對照組，比較2組患者收集的VOC譜。如果一種已鑒定的揮發(fā)性有機化合物的濃度在這2組之間有統(tǒng)計學上的不同，該化合物就被認為是一個生物標志物。這些研究確定的腫瘤生物標志物在很大程度上是不一致的，且在各個癌種中的生物標志物也是各不相同。

盡管GC-MS具有效率高的優(yōu)點，但其成本高、可管理性差等，限制了其在大規(guī)模篩查中的常規(guī)應用。此外其在分析過程中尚未形成標準化的檢測方法，導致VOCs檢測受氣體收集方法、設備、方法的敏感性及檢測環(huán)境等多個方面影響，其重復性和穩(wěn)定性有待進一步驗證。

1.2 選擇離子流動管質譜法(selected Ion flow tube mass spectrometry, SIFT-MS)SIFT-MS是一種定量質譜儀技術，可實時測量潮濕空氣樣品中微量氣體分子的濃度。1999年Spanel等[8]首次利用該方法對膀胱癌和前列腺癌患者尿液中的甲醛進行測定。之后也有很多文獻報道使用該方法對于胃食管癌[9]、結直腸癌[10]、肺癌[11]等樣品的VOCs進行檢測，其結果同樣具有統(tǒng)計學意義。SIFT-MS在高通量和實時分析氣體樣本中的VOCs顯示出了巨大的潛力，不過由于其工作原理及零件構成使得其成本較高，儀器體積較大，且在呼氣樣本以外的應用較罕見。

1.3 電子鼻技術及其他檢測方法電子鼻技術是一系列化學傳感器以及特定的識別方法組合而成的儀器，該傳感器能夠在化學類別的VOC存在的情況下產生電響應，給出定性的響應，而非特定響應。因此電子鼻不能識別單一揮發(fā)性有機化合物，但就像人類嗅覺一樣，其可檢測不同化學類別的組合，如烷烴、酒精和芳香化合物[12]。電子鼻技術比GC-MS更快、更易操作，可通過模式識別來識別特定的狀態(tài)。該方法簡便，易攜，在早期腫瘤的篩查中具有很大潛力。其他檢測方法如質子轉移反應質譜法[13]、離子遷移質譜法[14]等報道較少，其靈敏度及特異性需要進一步進行臨床研究驗證。

2 不同樣本中的揮發(fā)性有機物

2.1 呼出氣呼出氣樣本由于其收集方便，易于存儲等優(yōu)勢，成為了最早應用于VOCs檢測的樣本。其在肺癌、胃食管癌、結直腸癌、乳腺癌等中均有應用。

呼出氣VOCs用于肺癌診斷及篩查的研究進行的最多也最早。有研究分析了12例肺癌患者及健康對照者之間不同的質譜峰值分析圖，從而提出呼出氣體中的28種有機化合物可作為候選的肺癌標志性氣體成分[7，15]，這一發(fā)現提示了VOCs在肺癌篩查中的巨大潛力。此后在肺癌患者的呼吸中也發(fā)現了鄰甲苯胺，苯胺和脂質過氧化活性的改變[16-17]。Michael Phillips是呼吸研究領域的先驅之一，利用GC-MS進行了三項獨立的肺癌生物標記物發(fā)現研究[18-20]，鑒于這些研究得出的生物標志物各不相同，但主要的生物標志物主要是烷烴衍生物，這在其所有三項研究中都是一致的。與健康對照組相比，肺癌參與者中大多數VOCs的相對豐度降低；這種差異可能歸因于肺癌中CYP450基因激活導致脂質過氧化產物分解增加[21]。然而，還有許多其他研究表明烷烴與肺癌無關[21-23]。這些研究均未評估檢測到的VOCs的來源。事實上，大多數揮發(fā)性有機物在呼氣中的作用機制仍不清楚。Hakim等[24]總結了肺癌相關揮發(fā)性有機化合物可能的生化途徑。目前尚無一致且有效的肺癌VOCs生物標志物的報道。造成這些不一致的原因是多方面的，不同的研究在呼吸采樣程序、研究設計(對照組的選擇、患者的選擇等)和數據分析方法方面有很大的差異。

近些年，其他腫瘤患者的呼出氣研究也相繼出現。Peng等[5]發(fā)表了首次使用定制的納米傳感器陣列對腫瘤患者進行代謝性呼氣分析，該陣列基于有機功能化的金納米顆粒(gold nanoparticles，GNPs)和SPME-GC-MS分析，以確定合適的代表性VOCs來區(qū)分這些類型的癌癥。呼吸樣本來自26例結腸癌患者、30例肺癌患者、22例乳腺癌患者、18例前列腺癌患者和22例健康對照。GNP陣列在區(qū)分結腸癌患者和健康對照方面顯示出很高的鑒別能力。2013年，Altomare等[25]利用TD-GC-MS分析了37例結腸癌患者和41例健康對照的呼吸樣本，識別出15種VOC模式，其靈敏度為86%，特異度為83%，準確率為85%，ROC曲線下面積(AUC)為0.85%。呼出的VOC模式的辨別能力隨后在另一系列25名受試者的盲目階段進行了驗證，準確率為76%[26]。2015年Kumar等[27]分析了81例食管(n=48)或胃腺癌(n=33)和129例包括Barrett上皮化生(n=16)，良性上消化道疾病(n=62)或正常的患者的呼氣樣本(n=51)。篩選出了十二種VOCs(戊酸，己酸，苯酚，甲基苯酚，乙基苯酚，丁醛，戊醛，己醛，庚醛，辛酸，壬醛和癸醛)的濃度顯著高于癌旁組(P<0.05)。Chen等[28]更進一步發(fā)現了可通過呼出氣VOCs檢測來不僅能將胃癌病人與正常人區(qū)分開來，同時也可區(qū)分出早期胃癌和晚期胃癌，使VOCs檢測腫瘤更為精確，為臨床病情評估提供了更為精確的依據。

2.2 尿液尿液中含有高濃度的揮發(fā)性代謝物，且收集和存儲較為方便，使其成為揮發(fā)性有機化合物分析的另一個極具吸引力的目標。Silva等[29]用動態(tài)固相微萃取(DHS-SPME)結合GC-MS評價了腫瘤患者和健康對照組中尿VOCs譜的差異。腫瘤組包括14例白血病患者、12例結直腸癌患者和7例淋巴瘤患者，并與21例健康對照組進行比較。在對照組和腫瘤學組中共鑒定出82種不同化學類別的揮發(fā)性代謝物。其中苯類衍生物，萜類化合物和苯酚在腫瘤患者組中最常見，而酮和硫化合物在健康受試者尿液中含量更多。結果表明在尿液中，腫瘤患者和健康志愿者之間的VOCs濃度有著顯著差異。

另外，在英國考文垂和沃里克郡的大學醫(yī)院進行過兩項研究。第一項研究使用FAIMS儀器和Combi-PAL ITEX自動預濃縮系統(tǒng)，結合從83例結腸癌患者和50例健康對照獲得的GC-MS來評估尿樣[30]。該研究結腸癌組于健康對照組兩組之間的敏感性為88%，特異性為60%。在第二項研究中，作者開發(fā)了一種專用電子鼻系統(tǒng)，該系統(tǒng)由13個傳感器組成，測試了該系統(tǒng)對92份尿樣(包括39例結腸癌患者、35例腸易激綜合征患者和18例健康對照)尿液中的VOCs。與其他兩組相比，該研究檢測結直腸癌的靈敏度為78%，特異度為79%[31]。近些年來，尿液也被應用于胰腺癌和前列腺癌的無創(chuàng)診斷[32-33]。各種研究均證實了腫瘤患者尿樣中可識別的代謝紊亂的存在，以及尿液作為一種潛在的易于獲得的生物樣本進行篩查的有效性。

2.3 其他對于VOCs的研究不僅只局限于呼出氣和尿液。很多學者在其他樣本，如糞便、膽汁等中同樣做出了嘗試。2014年De等[34]首次報道了糞便樣本分析經驗，監(jiān)測了40例結腸癌患者、60例晚期結腸腺瘤患者和57例健康對照。對35例結腸癌、46例晚期腺瘤和52例對照組的糞便標本進行檢測。在結直腸癌患者和對照組的比較中顯示出85%和87%的靈敏度和特異度。將晚期腺瘤患者與對照組進行比較，其敏感度為62%，特異度為86%。對結直腸癌和晚期腺瘤患者進行比較，敏感性為75%，特異性為73%。Batty等[10]通過 SIFT-MS分析篩選出了糞便中3種可能的結腸癌生物標志物硫化氫、二甲基硫化物和二甲基二硫化物。有研究首次使用膽汁作為樣本,分別篩選出了胰腺癌和膽管癌可能的生物標志物(乙醇，丙烯腈，乙腈，乙醛，苯，二硫化碳，二甲基硫，2-普萘洛爾)，并且采用機器學習等方法建立篩選模型，使檢測結果敏感性和特異性顯著增高(敏感性為93.5%，特異性為100%)[35-37]。

3 結語與展望

VOCs檢測用于癌癥的早期篩查和診斷是一個迅速發(fā)展的領域。各項證據表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展中存在代謝組學的紊亂，并且可通過呼氣、尿液、糞便等多種方法檢測出來。VOCs作為腫瘤的“氣味印記”，表現出了相當不錯的潛力。這種“氣味印記”可通過不同分析平臺和基質來進行評估，并且可以無創(chuàng)而有效的實現腫瘤的早期篩查和早期診斷。但是由于缺乏標準化的實驗流程，至今無統(tǒng)一評估標準。盡管已經基本確定最常見的代謝化學物為烷烴和芳香族化合物，但各個研究之間差異仍然較大，較難形成統(tǒng)一的結果。

為了使VOCs能夠進一步轉化為臨床廣泛使用的生物標志物，需要再以下三個關鍵領域取得進展：①開發(fā)標準化和靈活的氣體樣本采集方案；②經過仔細的研究設計和外部驗證的縱向多中心臨床試驗；③對于腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中所涉及的生化途徑進一步探究，直接證明VOCs的生化來源。我們相信，這些發(fā)現最終將有助于VOCs檢測成為一種腫瘤早期篩查和早期診斷技術的發(fā)展，使VOCs檢測能夠實現其發(fā)展?jié)摿?，并成為個性化醫(yī)學診療中的關鍵工具。