基于CRISPR/Cas9技術(shù)的弓形蟲rop16I/III缺陷蟲株的構(gòu)建及毒力鑒定

王 聰，程維晟,2，劉 芳，張 焰,2，F(xiàn)austina Pappoe，羅慶禮，聞慧琴，鄧 芳，徐元宏,2，沈繼龍

基于CRISPR/Cas9技術(shù)的弓形蟲rop16I/III缺陷蟲株的構(gòu)建及毒力鑒定

王 聰1，程維晟1,2，劉 芳1，張 焰1,2，F(xiàn)austina Pappoe1，羅慶禮1，聞慧琴1，鄧 芳3，徐元宏1,2，沈繼龍1

目的 構(gòu)建并鑒定弓形蟲RH株rop16I/III缺陷蟲株。方法 利用CRISPR-Cas9技術(shù)進行構(gòu)建基因缺陷蟲株。運用E-CRISPR數(shù)據(jù)庫設(shè)計gRNA，并使用定點突變試劑盒突變pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT質(zhì)粒上的gRNA，構(gòu)建pSAG1::Cas9-U6::sgrop16質(zhì)粒。此外將rop16上游序列、乙胺嘧啶抗性基因、rop16下游序列3個片段連接成donorDNA，克隆于pUC19質(zhì)粒上,PCR擴增donor DNA片段。pSAG1::Cas9-U6::sgrop16質(zhì)粒和donor DNA片段電穿孔轉(zhuǎn)染弓形蟲，電轉(zhuǎn)后懸液接種于HFF-1細胞中，3 μmol/L乙胺嘧啶篩選電轉(zhuǎn)后的蟲株。PCR和Western blotting鑒定克隆化篩選蟲株。吉姆薩染色分別比較RH株和RHΔrop16株對HFF-1細胞的增殖與入侵。并比較RH株和RHΔrop16株分別感染昆明小鼠后小鼠的生存和死亡率。結(jié)果 經(jīng)測序比對，成功構(gòu)建了pSAG1::Cas9-U6::sgrop16質(zhì)粒和pUC19-donorDNA質(zhì)粒。PCR鑒定結(jié)果顯示，DHFR編碼(編碼乙胺嘧啶抗性基因)序列成功插入至靶點位置，Western blotting分析結(jié)果未見RHΔrop16株有Rop16I/III蛋白表達。吉姆薩染色后計數(shù)結(jié)果表明，RH株感染的細胞內(nèi)每個納蟲泡內(nèi)速殖子的平均數(shù)顯著高于RHΔrop16蟲株。毒力試驗結(jié)果顯示，RH株感染的小鼠在第7 d即出現(xiàn)死亡，而rop16I/III缺陷株在第9 d出現(xiàn)死亡，但兩種弓形蟲株感染動物在第10 d均全部死亡，兩組間無統(tǒng)計學差異。結(jié)論 利用CRISPR-Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了rop16I/III缺陷的弓形蟲RH蟲株，rop16I/III基因敲除對弓形蟲RH株毒力無明顯影響。

剛地弓形蟲；rop16I/III；CRISPR/Cas9；RH株；基因缺陷

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種機會致病性的專性有核細胞內(nèi)寄生的原蟲。貓科動物為其終宿主，而中間宿主具有廣泛的宿主群，包括人類。弓形蟲感染幾乎累及全球30%的人口，歐美部分國家的感染率可高達40%以上[1]。弓形蟲病(toxoplasmosis)是嚴重危害人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)的人獸共患病。人體弓形蟲感染大多無明顯臨床癥狀和體征，或僅呈一過性輕度的臨床表現(xiàn)，急性感染之后進入隱性感染狀態(tài)。但是當慢性感染者出現(xiàn)免疫功能損傷(或免疫抑制)后，潛伏的隱性弓形蟲感染活化，患者可出現(xiàn)嚴重的播散性弓形蟲病，甚至死亡[2]。弓形蟲具有多種分泌性的細胞器，速殖子在侵入宿主細胞過程，多個細胞器均分泌蛋白進入宿主細胞內(nèi)。ROP16蛋白，為ROP2蛋白家族成員，由棒狀體(rhoptry)分泌，并具有絲氨酸-蘇氨酸激酶活性。研究表明，I型蟲株(如RH)ROP16可磷酸化Stat3/6，感染早期直接驅(qū)動巨噬細胞向M2極化，可使蟲體在宿主細胞內(nèi)大量繁殖，易導致蟲體在全身播散甚至致宿主死亡[3]。因此rop16基因在蟲株的繁殖和擴散中具有潛在的重要作用。本研究希望通過構(gòu)建rop16缺陷的RH株，為深入研究rop16的功能及闡明弓形蟲的致病機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、載體和弓形蟲株 人包皮成纖維細胞(HFF-1)購自美國菌種保藏中心(ATCC)，培養(yǎng)于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT質(zhì)粒購自美國Addgene(Plasmid #54467)，pDHFR-TS質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所賈洪林研究員惠贈。剛地弓形蟲RH株，由本室液氮保種，HFF-1細胞中傳代培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自合肥志宏生物科技有限公司，基因組DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司，質(zhì)粒提取試劑盒和DNA電泳膠回收試劑盒購自蘇州康寧生物科技有限公司，多片段一步克隆試劑盒購自南京諾維贊生物科技有限公司，Q5○R定點突變試劑盒購自NEB公司，乙胺嘧啶購自美國Sigma-Aldrich公司，NC膜購自美國Millipore公司，PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶、連接酶、ECL發(fā)光試劑盒購自美國Thermo公司，吉姆薩染色試劑盒購自南京建成科技有限公司，GenepulserXcell電穿孔儀和電擊杯為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 Cas9質(zhì)粒構(gòu)建 針對rop16基因利用德國癌癥研究中心的E-CRISP數(shù)據(jù)庫設(shè)計靶點，根據(jù)靶點設(shè)計結(jié)果，利用NEBaseChangerv1.2.2工具，設(shè)計突變pSAG1:Cas9-U6:sgUPRT質(zhì)粒上gRNA序列所需的引物，分別是mut-F 5′-GTGGCAGCGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3′、mut-R 5′-CGGTGCGTCCAACTTGACATCCCCATTTAC-3′，并根據(jù)Q5○R定點突變試劑盒的操作流程實現(xiàn)gRNA序列的替換，獲得pSAG1:Cas9-U6:sgrop16。

1.2.2 donor DNA質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)rop16的序列及多片段一步克隆試劑盒的使用說明設(shè)計特異的引物見圖1。

擴增出所設(shè)計靶點上游1 178 bp、下游1 136 bp及乙胺嘧啶抗性基因的編碼序列，通過多片段一步克隆試劑盒將3個片段連接于pUC19質(zhì)粒上，并以構(gòu)建好的質(zhì)粒作為模板，以UpRop16-F和DnRop16-R為引物，PCR擴增donor DNA，電泳后回收donor DNA片段。

1.2.3 電穿孔轉(zhuǎn)染弓形蟲速殖子及缺陷株弓形蟲的篩選 收集新裂解的弓形蟲速殖子，進行分離純化后，取1.0×107個速殖子重懸于800 μL電轉(zhuǎn)緩沖液中，將所構(gòu)建的pSAG1:Cas9-U6:sgrop16質(zhì)粒和donorDNA片段加入至弓形蟲懸液中混勻，加入至4 mm間距的電擊杯中，使用Gene pulserXcell電穿孔儀進行電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)參數(shù)為：電壓2 000 V，電容25 μF，電阻50 Ω。電轉(zhuǎn)完成后，將混合懸液置于室溫放置10 min后轉(zhuǎn)移至已匯合的HFF-1細胞中，更換培養(yǎng)液為含3%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后加入乙胺嘧啶溶液(溶解于二甲基亞砜中)至終濃度為3 μmol/L，篩選7～8 d以獲得具有穩(wěn)定抗性的蟲株。隨后進行單克隆化篩選，并對陽性克隆進行PCR和Western blotting鑒定。

1.2.4 PCR鑒定 PCR鑒定引物如下：

提取陽性克隆基因組DNA作為模板PCR擴增PCR1、PCR2片段，PCR1長度1.9 kb，PCR2長度1.1 kb，RH株作為陰性對照。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡實驗(Western blotting) 收集各陽性克隆蟲株的速殖子，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解20 min，4℃ 15 000 g 離心30 min，取上清，加入5×蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min。SDS-PAGE電泳，使用ROP16兔多克隆抗體作為一抗，弓形蟲RH株作為陽性對照。

1.2.6 空斑實驗(Plaque assays) 6孔細胞培養(yǎng)板中每孔接種2.5×105個HFF-1細胞，待細胞生長至匯合度為90%左右，分別感染RH株和RHΔrop16株速殖子各200個，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，結(jié)晶紫染液染色。

1.2.7 吉姆薩染色觀察弓形蟲的增殖 預先放置6塊無菌玻璃蓋片分別至6孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種2.5×105個 HFF細胞至生長匯合至90%，分別加入RH株和RHΔrop16株速殖子各2.5×105個，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄上清，4%多聚甲醛固定5～10 min，并加Ⅰ液覆蓋玻璃蓋片，30～40 s后，立即滴蓋等量或稍多Ⅱ液染色5～10 min，取出玻璃蓋片，自來水沖洗干凈，待干后鏡檢。從片上隨機選取100個細胞計數(shù)，分別比較RH株和RHΔrop16株在感染24 h的細胞中納蟲泡內(nèi)速殖子數(shù)量，實驗重復3次。

1.2.8 毒力試驗 3～4周雌性昆明小鼠20只，分為兩組，每組各10只，分別腹腔注射200個RH株速殖子、200個RHΔrop16株速殖子，每天觀察各組小鼠的存活率至小鼠全部死亡。實驗重復2次，共做3次。

1.3 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用兩獨立樣本的秩和檢驗(Two-Independent-Samples Test)。檢驗水平為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 靶點的設(shè)計與質(zhì)粒突變 根據(jù)Q5○R定點突變試劑盒的操作流程對pSAG1:Cas9-U6:sgUPRT質(zhì)粒上gRNA片段進行替換，經(jīng)測序比對，成功實現(xiàn)gRNA的替換，與預期結(jié)果一致(見圖2)。

圖2 rop16 gRNA替換后的測序比對Fig.2 Sequencing and alignment of replacement gRNA

2.2 donorDNA質(zhì)粒的構(gòu)建與donor DNA的擴增 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果顯示，在1 178 bp、3 038 bp及1 136 bp處分別得到靶點上游片段、DHFR-TS片段和靶點下游片段，使用多片段一步克隆試劑盒將3個片段連接于pUC19載體上，經(jīng)測序比對，與預期結(jié)果一致。Puc19-donor 質(zhì)粒上的donor DNA片段經(jīng)PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳上顯示在5 352 bp位置有所需的目的條帶(見圖3)。

M: DNA Marker, 1. 5′ fragment of target position, 2. DHFR cassette, 3. 3′ fragment of target position, 4. pRop16::DHFR plasmid, 5. PCR amplification of donor DNA圖3 rop16靶點上下游同源臂、DHFR基因及donor DNA的擴增Fig.3 Amplification of upstream and downstream fragment of target position, DHFR gene and donor DNA

2.3 RHΔrop16蟲株的PCR和Western blotting鑒定 使用特異性的片段插入鑒定引物PCR擴增相應(yīng)片段鑒定DHFR-TS片段的插入情況，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果顯示RH株兩對鑒定引物擴增均為陰性，而RHΔrop16株在1 799 bp和902 bp處，均可見單一條帶，說明DHFR-TS片段已插入至靶點處(見圖4)。Western blotting鑒定結(jié)果顯示RH株速殖子能表達76 kDa的ROP16蛋白，而RHΔrop16則未見表達(見圖5)。

M: DNA Marker, 1 and 3 Wild type RH strain, 2 and 4 RHΔRop16strain圖4 rop16基因缺陷弓形蟲蟲株的PCR鑒定Fig.4 PCR identification of Rop16 deficient Toxoplasma gondii strain

1. Wild type RH strain, 2. Monoclonal RHΔrop16 strain圖5 RHΔrop16蟲株的ROP16蛋白的表達 Fig.5 Expression of Rop16 in Rop16 deficient T. gondii strain

2.4 Plaque assays結(jié)晶紫染色后結(jié)果 結(jié)果表明，RH株空斑明顯較RHΔrop16株空斑大(見圖6)。

A：RH株野生型蟲株感染HFF細胞24 h后，速殖子增殖速度較快，空斑較大；B:RHΔrop16株感染HFF細胞24 h后，速殖子增殖速度較慢，空斑較小A: HFF cells infected with transgenic T. gondii RH strain for 24h with a higher tachyzoite proliferation rate and a larger plaque; B: HFF cells infected with transgenic T.gondii Rop16 deficient strain for 24h with a lower tachyzoite proliferation rate and a smaller plaque.圖6 弓形蟲蟲株的感染細胞的空斑情況(結(jié)晶紫染色)Fig.6 T. gondii strains intracellular plaque (crystal violet staining)

圖7 弓形蟲蟲株對細胞的侵襲情況Fig.7 Infection of T. gondii strain intracellular

A: 野生型RH株感染HFF細胞24 h后，速殖子增殖速度較快，數(shù)量較多； B: rop16基因缺陷株感染HFF細胞24 h后，速殖子增殖速度較慢，數(shù)量較少。A: HFF cells infected with transgenic T. gondii RH strain for 24h with a higher tachyzoite proliferation rate; B: HFF cells infected with transgenic T. gondii rop16 deficient strain for 24h with a lower tachyzoite proliferation rate.圖8 rop16基因缺陷弓形蟲株細胞內(nèi)增殖情況(吉姆薩染色，×400)Fig.8 Intracellular proliferation of rop16 deficient T. gondii strain(Giemsa staining，×400)

2.5 吉姆薩染色觀察rop16基因缺陷弓形蟲的增殖 吉姆薩染色結(jié)果表明，RH株在感染的細胞中納蟲泡內(nèi)速殖子的平均數(shù)量高于RHΔrop16株。單個細胞內(nèi)的速殖子數(shù)均顯著低于RH株(見圖7、8)。2.6 毒力試驗 弓形蟲毒力試驗結(jié)果顯示，野生型RH株感染的小鼠在第7 d即出現(xiàn)死亡，而RHΔrop16株在第9 d出現(xiàn)死亡，但兩種蟲株感染的昆明小鼠均在第10 d全部死亡(見圖9)，二者間死亡率無統(tǒng)計學差異。

圖9 感染野生型RH株和rop16缺陷蟲株小鼠的存活率Fig.9 Survival rate of mice infected with RH strain and RHΔrop16 T.gondii strain

3 討 論

在生物分類學中，弓形蟲屬下僅有T.gondii一個種。然而近年從世界各地人獸體內(nèi)分離的蟲株進行基因分型結(jié)果顯示，世界各地弓形蟲株具有豐富的遺傳多樣性[4]。其中Ι型為強毒株(如RH株)，感染小鼠多在急性期死亡。不同基因型攜帶的效應(yīng)分子多態(tài)性與弓形蟲毒力密切相關(guān)。Rops家族的蛋白成員ROP16具有絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶活性，同時具有基因型相關(guān)的多態(tài)性，I型蟲株的ROP16I/III決定著宿主在感染早期的固有免疫中，巨噬細胞向M2方向極化，對感染轉(zhuǎn)歸和結(jié)局具有十分重要的影響。本研究通過CRISPR/Cas9介導的基因組編輯技術(shù)構(gòu)建rop16I/III缺陷的RH株，發(fā)現(xiàn)rop16I/III缺陷株在細胞內(nèi)的增殖較野生型RH株減弱，但對小鼠毒力與野生型RH株比較無統(tǒng)計學差異。以上結(jié)果提示，I型蟲株的ROP16I/III雖然參與負向調(diào)控宿主巨噬細胞并促進蟲體在細胞內(nèi)增殖，但是并非是重要的毒力因子。本研究為進一步揭示ROP16I/III與宿主細胞蛋白相互作用機制及弓形蟲的致病機理提供了重要參考。

基因組編輯(Genome editing)技術(shù)是現(xiàn)代生物學研究人們了解特定基因功能的基礎(chǔ)[5]。近年來主要有人工核酸酶介導的鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFNs)[6]，類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator like effector nucleases, TALENs)[7]和最新的Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9系統(tǒng)[8]。雖然 ZFN技術(shù)和TALEN技術(shù)在基因組編輯上做出了重要貢獻，但是二者構(gòu)建較困難，難以獲得有活性的ZFN和TALEN。而CRISPR/Cas9技術(shù)是基于細菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)改造而成，其制作簡便，效率高[9]，CRISPR/Cas9通過sgRNA對目標序列進行識別引導核酸內(nèi)切酶Cas9進行剪切從而造成靶位點DNA雙鏈斷裂(Double strand breaks, DSBs)，再通過非同源末端連接(Non-homologous ending-joining, NHEJ)或同源重組(Homologous recombination, HR)對損傷的DNA進行修復。CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)在小鼠，斑馬魚[10]，人多能干細胞中得到很好的利用?；蚪M定點編輯修飾技術(shù)的發(fā)展加速了弓形蟲本身功能基因組學的研究[11]。

本次實驗利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功的構(gòu)建了rop16I/III缺陷的RH株，為弓形蟲的致病機制的研究奠定了基礎(chǔ)。

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CRISPR/Cas9-based construction ofrop16I/IIIdeficient strain ofToxoplasmagondiiand its virulence identification

WANG Cong1,CHENG Wei-sheng1,2,LIU Fang1,ZHANG Yan2,Faustina PAPPOE1,LUO Qing-li1, WEN Hui-qin2,DENG Fang3,XU Yuan-hong1,2,SHEN Ji-long1,2

(1.DepartmentofMicrobiologyandParasitology,AnhuiProvincialLaboratoryofPathogenBiologyandAnhuiKeyLaboratoryofZoonoses,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China; 2.DepartmentsofClinicalLaboratoryandBloodTrasfusion,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China;3.DepartmentofLaboratoryMedicine,ProvincialWestHospitalofAnhuiMedicalUniversityHefei23001,China)

Toxoplasmagondii RHrop16I/IIIdeficient strain was constructed based on CRSPR/Cas9 technology. E-CRISP database was used to design gRNA; mutation of gRNA in pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT plasmid was performed by using site-directed mutagenesis to construct pSAG1::Cas9-U6::sgrop16 plasmid. The pUC19-donorDNA plasmid was constructed and fragments were amplified by PCR. The plasmid pSAG1:Cas9-U6:sgrop16I/IIIand donor DNA fragments were electroporated intoT.gondiiRH strain. Follow electroporation, suspension was inoculated into human foreskin fibroblast cells (HFF-1).The3 μmol/L pyrimethamine was used to screen the electroporated parasite and monoclone was detected by PCR and Western blotting. The proliferation and invasion of RHΔrop16strain were observed in HFF-1 cells by Giemsa staining. Twenty KM mice were infected with 200 tachyzoite of wild type or RHΔrop16parasite, respectively. The animal survival was recorded. The results showed that pSAG1:Cas9-U6:sgrop16 plasmid and pUC19-donor DNA plasmid were successfully constructed and confirmed by DNA sequencing. PCR identification proved that DHFR coding sequence was successfully inserted to the target position. Western blotting analysis revealed deficient expression of ROP16 in the RHΔrop16strain. Giemsa staining indicated that the number of parasites per parasite phorous vacuole of wild typeToxoplasma-infected cells was more than that of the RHΔrop16infected cells. Virulence examination indicated that, the wild type strain infected mice began to die on day 7 post-infection where asΔrop16I/IIIstrain, on day 9. However, all animals infected with both strains died on day 10 post-infection. TheΔrop16I/IIIstrain ofT.gondiiwas successfully constructed by the CRISPR-Cas9 technology and no difference was noted between wild type and RHΔrop16 strain in their virulence to mice.

Toxoplasmagondii;rop16I/III; CRISPR/Cas9; RH strain; gene knockout

Shen Ji-long, Email:shenjilong53@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.01.004

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(No.2010CB530001)；國家自然科學基金(No.81471983)

沈繼龍，Email：shenjilong53@126.com

1.安徽病原生物學省級實驗室和人獸共患病安徽省重點實驗室，合肥 230032； 2.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，合肥 230022； 3.安徽醫(yī)科大學附屬省立腫瘤醫(yī)院檢驗科，合肥 230001

R382.5

A

1002-2694(2017)01-0022-05

2016-08-16 編輯：王曉歡

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81471983) and the National Basic Science Research Program of China (No. 2010CB530001)