一株引起雞白痢雞傷寒平板凝集實驗陽性的奇異變形桿菌的分離鑒定

周云鋒+褚歐成+邊海霞+郭磊++王學(xué)強(qiáng)+王潔+王翔

摘要：從寧夏某養(yǎng)殖場雞白痢雞傷寒多價平板凝集抗原陽性雞只的腸道中分離到一株革蘭氏陰性桿菌，經(jīng) 16S rRNA 測序鑒定為奇異變形桿菌；通過對該菌株進(jìn)行人工感染健康雞只，成功復(fù)制出與自然感染相同的病例。

關(guān)鍵詞：雞白??；雞傷寒；變形桿菌的分離

中圖分類號： S858 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.01.016

雞沙門氏菌病 OIE 規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法：病原鑒定。采取檢測樣本，通過選擇性培養(yǎng)基分離、培養(yǎng)細(xì)菌，還有沙門氏菌復(fù)蘇試驗，都可以從病原學(xué)上鑒定、驗證雞沙門氏菌?。谎鍖W(xué)試驗。利用沙門氏菌抗原，通過快速全血凝集試驗、快速血清凝集試驗、試管凝集試驗、微量凝集試驗等檢測樣本中的抗體，達(dá)到診斷的目的。但我國國標(biāo)對雞白痢傷寒檢測采用平板凝集實驗，實驗方法隨著細(xì)菌的變異準(zhǔn)確性越來越低，經(jīng)實踐證明有多種細(xì)菌感染均會引起平板凝集陽性，其中包括奇異變形桿菌。

奇異變形桿菌（proteusmirabilis，PM）屬于腸桿菌科變形桿菌屬，是革蘭氏陰性運動細(xì)菌，有鞭毛，是人和動物的寄生菌和病原菌；廣泛分布于人和動物的體表、黏膜及消化道，其產(chǎn)生的毒素可引起中毒，是一種常見的條件性致病菌[1]，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時容易引起發(fā)病。雞奇異變形桿菌病是近年來新發(fā)生的一種雞群的細(xì)菌性傳染病，各種日齡的雞均可感染，但以 7 周齡以下的雛雞最易感，病死率可高達(dá) 50%以上；育成雞及成年產(chǎn)蛋雞均易感但發(fā)病率與病死率一般很低。該病作為一種不常暴發(fā)的新的細(xì)菌性傳染病，可造成較高的死亡，而愈后的雛雞生長速度變慢，導(dǎo)致雛雞的大批死亡，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，因此應(yīng)引起養(yǎng)雞業(yè)的高度重視[2]。

近年來，有少量文獻(xiàn)報道[3]奇異變形桿菌與沙門氏菌屬具有共同抗原，能夠與沙門氏菌屬的多價血清和因子血清發(fā)生交叉凝集，引起菌種鑒定上的困難。但能引起雞白痢雞傷寒多價平板凝集抗原陽性反應(yīng)的未見報道，本實驗室在分離沙門氏菌時偶然發(fā)現(xiàn)其能引起雞白痢雞傷寒多價平板凝集抗原陽性反應(yīng)，且在反應(yīng)時間和形成的凝結(jié)塊上根本無法進(jìn)行區(qū)分，經(jīng)病例復(fù)制實驗證實，該菌正是造成雞只雞白痢雞傷寒多價平板凝集抗原假陽性反應(yīng)的病原菌。

1 材料與方法

1.1 被檢材料

寧夏某雞場 110 日齡育成雞，經(jīng)雞白痢雞傷寒沙門氏菌多價抗原平板凝集實驗檢測的陽性雞只，無臨床癥狀。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

緩沖蛋白胨水、SC 增菌液、氯化鎂孔雀綠肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、SS 瓊脂平板、LB 肉湯、XLT4 培養(yǎng)基等均購自北京路橋技術(shù)有限公司；細(xì)菌生化微量鑒定管購自青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、Taq 聚合酶及配套 dNTP 等試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 實驗動物

健康雞只：55 日齡海蘭褐母雞購于寧夏曉鳴農(nóng)牧股份有限公司。

1.4 細(xì)菌分離和鑒定

無菌剖檢雞只，采集腸道后段、肝臟、膽囊、肺臟、腎臟、輸卵管各部分，分別接種于緩沖蛋白胨水中，37℃培養(yǎng)20時，預(yù)增菌；將預(yù)增菌的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)分別接到 SC 增菌液和氯化鎂孔雀綠肉湯中 37℃增菌24時，增菌后分別劃線于 SS 瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基、SS 瓊脂平板、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，分別挑取優(yōu)勢菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，得到的純培養(yǎng)物命名為 NX-1，將得到的純培養(yǎng)物涂片后進(jìn)行革蘭氏染色和硝酸銀染色，顯微鏡（40×100）觀察。

1.5 生化鑒定

將 NX-1 分別接種到沙門氏菌微量生化鑒定管，37℃培養(yǎng) 24小時，觀察記錄結(jié)果。

1.6 16S rRNA 的擴(kuò)增及序列測定

挑取 NX-1 少許，移入 LB 肉湯液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng) 10h，取新鮮菌液 1毫升，離心收集菌體，用 DNA 提取試劑盒抽提 NX-1 細(xì)菌的基因組 DNA。采用細(xì)菌通用引物序列 27F/1492R（由上海生工合成）。

反應(yīng)體系為 50uL 反應(yīng)體系：10 X Buffer 5uL， dNTP（10 mmol/L） 4uL，Taq DNA 聚合酶 0.5uL，上、下游引物各 2uL，模板 DNA2uL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5分鐘；94℃ 45秒，57℃ 45秒，72℃ 2分鐘，30個循環(huán)；72℃延伸10分鐘。

取 5uL PCR 產(chǎn)物用 0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，用 DNA Marker 作為參照。選取目的條帶送上海生工進(jìn)行序列測定。

1.7 病例復(fù)制

將 50 只 55 日齡海蘭褐母雞隨機(jī)分為2大組，第 1 組內(nèi)分成注射組、飼喂組和對照組；第2組分為注射組和對照組，每小組10只健康雞只，用雞白痢雞傷寒多價抗原平板凝集實驗剔除陽性雞只，單獨飼養(yǎng)10天后再次剔除陽性雞只。

第1組內(nèi)每小組間隔3米，不做隔離；第 2 組注射組和對照組嚴(yán)格隔離。注射組每只接種 NX-1 濃縮液1mL（菌液濃度均調(diào)整到9×1010 cfu/mL的生理鹽水）；對照組每只接種 1mL 生理鹽水；飼喂組飼喂含NX-1的飼料2天（菌液濃度均調(diào)整到9×1010cfu/g）；接種后每天觀察記錄。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及染色觀察

僅從雞只的腸道中分離到該菌，其他組織均無此菌生長，37℃培養(yǎng) 16小時，普通瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈擴(kuò)散狀生長布滿整個平皿。在麥康凱平板上，長出均勻一致的圓形、透明、無色菌落。在 SS 培養(yǎng)基上形成中間黑色周圍無色透明的菌落。 XLT4 上面形成黑色中心的透明菌落。

鏡檢結(jié)果顯示：革蘭氏陰性、桿菌，多為單個存在（有短鏈狀，2～4 個菌體鏈），短桿狀；硝酸銀染色可見周身鞭毛。

2.2 細(xì)菌生化鑒定

在三糖鐵斜面培養(yǎng)基上，底部產(chǎn)酸，斜面產(chǎn)堿，硫化氫強(qiáng)陽性；氧化酶陰性、分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、不分解乳糖、苯丙氨酸脫氨酶陽性、氰化鉀抑制試驗陽性，鳥氨酸脫竣酶陽性；靛基質(zhì)、賴氨酸脫竣酶、甘露醇、山梨醇 ONPG 均為陰性，與說明書對比判斷該菌非沙門氏菌。

2.3 16Sr RNA 鑒定

該菌 16S rRNA 基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示，均擴(kuò)增出約 1400bp 的片段，與預(yù)期片段大小一致。測序結(jié)果顯示，該 NX-1 分離菌的16S rRNA擴(kuò)增片段為1368bp，經(jīng) Blast 分析比對，發(fā)現(xiàn)與其匹配度最高的幾種全序列均是奇異變形桿菌各株系的 16S rRNA 序列，其匹配度高達(dá) 99%，進(jìn)一步證實該分離菌為奇異變形桿菌。

2.4 病例復(fù)制實驗

實驗過程中未見雞只死亡，在接種12時，雞只出現(xiàn)輕度腹瀉，20小時后逐漸好轉(zhuǎn)；實驗第11天剖檢第2組雞只出現(xiàn)陽性轉(zhuǎn)為陰性，因此剖檢注射組5只（3只轉(zhuǎn)陰性雞只、2 只陽性雞只）、對照組4只進(jìn)行對比，未發(fā)現(xiàn)明顯剖檢變化。雞白痢雞傷寒多價平板凝集實驗結(jié)果，見表1。

3 結(jié)語

雞奇異變形桿菌病是近年來國內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的一種急性細(xì)菌性傳染病，主要引起禽類腹瀉、菌血癥、泌尿系統(tǒng)感染等疾病。本研究從雞白痢雞傷寒假陽性健康雞只中分離到 1 株奇異變形桿菌，雞群無明顯腹瀉等癥狀；人工感染實驗成功復(fù)制出與自然感染相同的病例，在人工感染后 12小時出現(xiàn)輕度腹瀉，但很快就會好轉(zhuǎn)（8小時），無其他癥狀，剖檢未發(fā)現(xiàn)與對照組有明顯差異，水平傳播能力強(qiáng)。該菌株在 SS 培養(yǎng)基上傳代 10 次以后毒力減弱，接種健康雞只后僅見 20%弱陽性雞只。

參考文獻(xiàn)

[1]連瓊蘭.一起雛雞奇異變形桿菌病的診治[J].福建畜牧獸醫(yī)，2015（04）：61-62.

[2]衣菲，于申業(yè)，田秋豐，等.禽源奇異變形桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015（01）：121-122，126，216.

[3]王錦彤，鐘廣輝，熊定凱，等.珠江水中檢出與沙門氏菌具有共同抗原的奇異變形桿菌[J].口岸衛(wèi)生控制，2008（02）：23-24.

作者簡介：周云鋒，碩士，主任助理，研究方向：疾病診斷和家禽養(yǎng)殖。