幾種典型掃描電鏡生物樣本制備

胡春輝+徐青+孫璇+于浩+袁玉清

摘要：總結(jié)了幾種典型掃描電鏡生物樣本的制備方法。結(jié)果表明，分別采用牙簽直接涂抹、在合適的溶劑中超聲分散后用銅片和銅網(wǎng)撈取的方法，得到較好的粉末樣品掃描電鏡圖像；微生物在液體或固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，經(jīng)戊二醛固定，乙醇脫水和冷凍干燥等處理過程；植物樣品根據(jù)含水量的不同，選擇合適的固定液和干燥方法對(duì)樣品進(jìn)行處理；動(dòng)物樣品采用雙固定和臨界點(diǎn)干燥的方法進(jìn)行處理；均獲得較為理想的掃描電鏡圖片。

關(guān)鍵詞：生物樣品；掃描電鏡；樣品制備；干燥方法；場(chǎng)發(fā)射

中圖分類號(hào)：TB383 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）20-5389-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.056

Abstract： This paper explores and summarizes the Scanning Electron Microscope（SEM） preparation methods of several typical samples. The results showed that using toothpick direct smear method，copper and copper net gain by ultrasonic dispersion in suitable solvent to obtain excellent SEM images；Microorganisms in liquid or solid culture were fixed in glutaraldehyde using ethanol dehydration and freeze drying process to prepare the samples；Plant samples under different water content，select the applicable stationary liquid and proper drying methods for the processing of samples；Animal samples were prepared by using the method of double fixed and critical point drying processing； Above all samples are obtain ideal scanning electron microscope images.

Key words： biological sample； scanning electron microscope； sample preparation； drying method； field-emission

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，掃描電子顯微鏡技術(shù)已成為檢測(cè)物質(zhì)性能和表征微觀結(jié)構(gòu)的重要手段，被廣泛應(yīng)用于食品學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、高分子材料等領(lǐng)域[1]。掃描電子顯微鏡在科學(xué)研究中有廣泛應(yīng)用，如觀察不同淀粉顆粒的超微形貌[2]、蛋白復(fù)合膜的微觀結(jié)構(gòu)[3]、淀粉納米顆粒的研究[4]及不同儲(chǔ)藏過程中肉食類微結(jié)構(gòu)的變化[5]等。相較于傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡和透射電鏡，掃描電鏡具有以下特點(diǎn)：直接多角度觀察樣品的表面結(jié)構(gòu)；不需要將樣品切成薄片；景深大、圖像立體感強(qiáng)；放大倍數(shù)從幾十倍到幾十萬倍連續(xù)可調(diào)；電子束能量較低，對(duì)樣品的損傷??；在觀察形貌的同時(shí)可以對(duì)微區(qū)的成分進(jìn)行定量和定性分析。

掃描電鏡同樣對(duì)于樣品有一定的要求，需要滿足以下條件：①導(dǎo)電性能好，樣品在電子束的作用下表面電位不會(huì)升高，不會(huì)產(chǎn)生荷電效應(yīng)[6]；②樣品要盡可能干燥，電子束在真空狀態(tài)下運(yùn)行，若樣品中含有水分，水分揮發(fā)會(huì)造成圖像漂移，損傷光闌和燈絲等[7]；③熱穩(wěn)定性好，避免在電子束作用下樣品分解，釋放出氣體或其他物質(zhì)，污染鏡筒；④樣品不能有磁性。粉末樣品尤其是超微粒子，吉普斯自由能較大[8]，在樣品制備過程中需克服團(tuán)聚現(xiàn)象，且使樣品有一定的密度[9]。生物樣品具有含水量高、導(dǎo)電性差等特點(diǎn)。生物樣品的含水量一般為70%～80%，只有少數(shù)的樣品，如花粉、毛發(fā)等可以直接放入掃描電鏡中觀察，大部分生物樣品需要經(jīng)過脫水干燥處理后才能進(jìn)行觀察[10]。因此生物樣品制備的關(guān)鍵步驟是干燥，應(yīng)盡量減少因水分蒸發(fā)導(dǎo)致的形變。因此掃描電鏡的樣品制備方法對(duì)于電鏡的觀察非常重要[11]，能否獲得真實(shí)、清晰、理想的掃描電鏡圖片，樣品制備方法非常關(guān)鍵。

本試驗(yàn)研究了12種典型樣品（包括普通粉末材料、納米材料、微生物、植物和動(dòng)物）的掃描電鏡制備方法，對(duì)掃描電鏡樣品制備方法進(jìn)行全面闡述，同時(shí)對(duì)其他方法進(jìn)行了改進(jìn)，為同類樣品的掃描電鏡樣品制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 粉末樣品 淀粉顆粒，淀粉納米顆粒。

1.1.2 生物樣品 金黃色葡萄球菌（球菌）、大腸桿菌（桿菌）、放線菌（真菌）、青島老鸛草（陸生植物）的花粉、睡蓮（水生植物）的花粉、絞股藍(lán)的葉片、玉米莖稈、青島百合的花芽、雞血和雞氣管等。

1.1.3 主要儀器 JFC-1600型離子濺射儀、JFD-320型冷凍干燥機(jī)、Emitech K850型二氧化碳臨界點(diǎn)干燥儀、JSM-7500F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡。

1.1.4 所用試劑 磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）、2.5%戊二醛溶液、1%四氧化鋨溶液、FAA固定液、乙醇、丙酮、醋酸異戊酯、叔丁醇等。所有試劑均為分析純，試驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 方法

1.2.1 牙簽直接固定法 將雙面導(dǎo)電膠帶粘到樣品臺(tái)上，用牙簽蘸取待測(cè)樣品，輕輕用手指將牙簽上多余的樣品彈掉。然后將牙簽輕輕在雙面膠上滾動(dòng)，使樣品顆粒均勻地涂布到導(dǎo)電膠上。用洗耳球輕吹試樣，除去未附著的或者沒有固定牢固的顆粒。

1.2.2 銅片固定法 取少量樣品置于離心管中，加入適量的乙醇，將剪成0.5 cm×0.5 cm大小清洗過的銅片放入離心管中，超聲15 min后，用鑷子將銅片取出，然后將附著有樣品的銅片放在濾紙上，自然干燥，用導(dǎo)電膠水將銅片固定在樣品臺(tái)上。

1.2.3 銅網(wǎng)碳載膜撈取法 取少量樣品置于離心管中，加入合適的分散劑（常用的分散劑有乙醇、丙酮、水或者0.1% SDS水溶液，分散劑的選擇標(biāo)準(zhǔn)：①樣品不能溶解在該試劑中；②易揮發(fā)，超聲15 min后，用鑷子取一片附有碳膜的銅網(wǎng)，輕輕撈取樣品，立即放在銅網(wǎng)盒中置于-20 ℃冰箱中預(yù)冷20 min，放入冷凍干燥機(jī)中干燥樣品3 h左右，樣品完全干燥后取出銅網(wǎng)，用導(dǎo)電膠水將銅網(wǎng)粘到樣品臺(tái)上。

以上3種方法制備完成后，導(dǎo)電類粉末可以直接進(jìn)行掃描電鏡觀察，不導(dǎo)電的粉末樣品需噴金導(dǎo)電處理后進(jìn)行觀察。

以上樣品的具體處理方法見表1。

1.2.4 球菌（金黃色葡萄球菌）和桿菌（大腸桿菌）的掃描電鏡樣品制備 取培養(yǎng)至穩(wěn)定期或?qū)?shù)生長(zhǎng)后期的菌液2～3 mL，8 000 r/min離心3～5 min，棄上清，加入40倍菌體體積的2.5%戊二醛固定液，置于4 ℃冰箱中固定2 h以上，用磷酸鹽緩沖液沖洗2～3遍，依次用50%、70%、90%和100%乙醇進(jìn)行梯度脫水，每次脫水時(shí)間為5～10 min。脫水結(jié)束后，用乙醇-叔丁醇溶液（1∶1，V/V，下同）置換20 min，最后用100%叔丁醇置換兩次，每次20 min。置換后將樣品進(jìn)行冷凍干燥處理，干燥后的樣品進(jìn)行離子濺射儀噴鍍后，掃描電子顯微鏡觀察、拍照。

1.2.5 放線菌的掃描電鏡樣品制備 在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)放線菌，用鑷子將滅菌處理的蓋玻片以45°夾角插入培養(yǎng)基中，讓細(xì)菌爬片生長(zhǎng)。將蓋玻片輕輕拔出，用磷酸緩沖液將蓋玻片上多余的培養(yǎng)基洗掉。將蓋玻片放到預(yù)裝有2.5%戊二醛溶液中（有菌絲的一面朝上），室溫或者4 ℃固定12 h以上。依次用50%、60%、70%、80%、90%、95%和100%乙醇脫水，每次脫水時(shí)間為5～10 min。乙醇-叔丁醇溶液置換10 min，再用100%叔丁醇溶液置換2次，每次10 min。置換完畢后將樣品放置-20 ℃冰箱中預(yù)冷。冷凍干燥處理，離子濺射儀噴鍍后，掃描電子顯微鏡觀察、拍照。

1.2.6 花粉的掃描電鏡樣品制備 將一種陸生植物的花粉（青島老鸛草）和一種水生植物的花粉（睡蓮），分別用自然干燥法和冷凍干燥處理法處理，觀察花粉顆粒的形貌。

花粉顆粒自然干燥法：取含苞待放的花朵，放置于干凈的培養(yǎng)皿中，待其自然散落花粉。自然干燥后，直接用雙面導(dǎo)電膠帶將花粉顆粒粘到樣品臺(tái)上。離子濺射儀噴鍍后，掃描電子顯微鏡觀察。

花粉顆粒的冷凍干燥處理方法：取未完全開放的花朵置于干凈的培養(yǎng)皿中，將其花粉抖落。將花粉顆粒收集到含有2.5%戊二醛的離心管中，固定2 h以上，乙醇梯度脫水，叔丁醇置換后冷凍干燥處理，離子濺射儀噴鍍后，掃描電子顯微鏡觀察。

1.2.7 植物葉片的掃描電鏡樣品制備 取材要準(zhǔn)確，體積不宜過大，樣品大小為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm。用2.5%的戊二醛/緩沖液在室溫或4 ℃固定。對(duì)于表面凹凸不平、黏有許多雜質(zhì)的樣品，在固定前后都需徹底的清洗，以免影響成像質(zhì)量。采用緩沖液清洗法：用緩沖液在常溫下徹底清洗樣品3次，每次15 min。用梯度濃度乙醇或丙酮逐級(jí)脫水，30%、50%、70%、80%、95%、100%，每次時(shí)間15～20 min。如果進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥：用醋酸異戊酯置換100%乙醇，在室溫下置換20 min以上，重復(fù)置換兩次。如果進(jìn)行冷凍干燥：用叔丁醇置換100%乙醇，在室溫下先用乙醇-叔丁醇溶液置換20 min，再用100%叔丁醇置換30 min，100%叔丁醇重復(fù)置換一次。冷凍干燥處理，離子濺射儀噴鍍后，進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察。

1.2.8 玉米莖稈的掃描電鏡樣品制備 取成熟期的玉米莖稈，置于固定液（通常用FAA固定液）中固定24 h以上，然后將材料切割成10 mm×10 mm×20 mm的小塊，繼續(xù)固定24 h。然后依次置于70%、50%和30%的乙醇溶液中，各放置30 min，逐級(jí)復(fù)水，最后將材料置于純水中，放置30 min。然后依次進(jìn)行脫硅、軟化、包埋、切片、撈片、脫脂等處理，將附有樣品的銅網(wǎng)用雙面導(dǎo)電膠帶粘到樣品臺(tái)上，離子濺射儀噴鍍后，掃描電子顯微鏡觀察、拍照。

1.2.9 花芽的掃描電鏡樣品制備 取新鮮的花芽立即放到FAA固定液中固定12 h以上，取材盡量小。依次用70%、90%和100%乙醇脫水處理，每次時(shí)間20 min。然后用100%醋酸異戊酯置換兩次，每次時(shí)間20 min。置于二氧化碳臨界點(diǎn)干燥儀中干燥，樣品完全干燥后取出在解剖鏡下仔細(xì)剖出要觀察的部位。將觀察面朝上用雙面導(dǎo)電膠帶粘到樣品臺(tái)上，離子濺射儀噴鍍后，掃描電子顯微鏡觀察、拍照。

1.2.10 雞血細(xì)胞掃描電鏡樣品制備 將取出的新鮮血液立即進(jìn)行抗凝處理：①先在注射器中吸取約1 mL抗凝劑，再將注射器扎入動(dòng)物血管中抽血；②預(yù)先在離心管中加入1 mL抗凝劑，注射器取血后將血液轉(zhuǎn)移至裝有抗凝劑的離心管中。將裝有抗凝劑和血液的離心管在2 500 r/min下離心5 min。將上清吸出，加入與上清等量的生理鹽水，2 500 r/min離心5 min，棄去上清液，吸取1 mL下層沉淀，用生理鹽水稀釋10倍制作血涂片。吸取一小滴血細(xì)胞稀釋液，滴至蓋玻片上，用另一片蓋玻片將血滴輕輕推開即可。將血涂片置于2.5%戊二醛固定液中固定2 h以上。配制不同梯度的乙醇對(duì)材料進(jìn)行脫水處理，乙醇濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%，每個(gè)濃度浸泡10～15 min。置于二氧化碳臨界點(diǎn)干燥儀中對(duì)樣品進(jìn)行干燥處理。干燥完畢后，將樣品用雙面導(dǎo)電膠帶粘到樣品臺(tái)上，離子濺射儀噴鍍后，掃描電子顯微鏡觀察、拍照。

1.2.11 雞氣管纖毛的掃描電鏡樣品的制備 將取出的雞的氣管，用生理鹽水或磷酸緩沖液清洗去除表面的雜質(zhì)。將氣管上的雜物（如雞毛和凝血等）剔除，避免影響后期的觀察，然后把氣管切成0.5 cm×0.5 cm的小塊。樣品太大固定不完全，容易發(fā)生形變。將新鮮的氣管立即放入2.5%的戊二醛固定液中，做好標(biāo)記。樣品應(yīng)完全浸沒在1%的鋨酸緩沖液中。分別用30%、50%、70%、80%、90%和100%的丙酮對(duì)氣管樣品進(jìn)行脫水處理，每次脫水時(shí)間為10～15 min。

以上生物樣品的制備方法如表2所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同大小粉末樣品的電鏡觀察

從圖1-a1、圖1-a2可以看出，十幾微米大小的淀粉顆粒直接用牙簽涂抹即可得到均勻的分散性好的電鏡圖片，該方法制樣簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)。淀粉顆粒較大且導(dǎo)電性差，因此觀察時(shí)設(shè)置電鏡參數(shù)WD為10 mm，增大景深，電壓為4 kV，觀察模式為L(zhǎng)EI、SEM，得到的電鏡圖片立體感較強(qiáng)，噴金時(shí)間短，沒有放電現(xiàn)象產(chǎn)生，淀粉顆粒表面的紋飾清晰。圖1-b1、圖1-b2、圖1-c1、圖1-c2均為淀粉納米顆粒，可以看出用乙醇作為分散劑進(jìn)行超聲分散效果不是很明顯，樣品團(tuán)聚現(xiàn)象嚴(yán)重，無法觀察到單個(gè)的納米顆粒（圖1-b1、圖1-b2）；而用0.1%SDS作為分散劑淀粉顆粒分散的效果更好，納米顆粒在碳膜上均勻地分布，可以準(zhǔn)確測(cè)量納米顆粒的粒徑在幾納米到三十納米之間（圖1-c1、圖1-c2）。

2.2 微生物樣品的掃描電鏡觀察

從圖2中可以看出，無論是真菌還是細(xì)菌用該處理方法均可得到較為滿意的電鏡圖片，菌體和孢子的分散比較均勻，圖像背景干凈，菌體結(jié)構(gòu)清晰，層次分明，立體感強(qiáng)，無雜質(zhì)干擾。根據(jù)菌體特點(diǎn)，球狀和桿狀的細(xì)菌用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)較為方便，且菌體的分散性較好，處理過程大部分在1.5 mL離心管中即可完成，操作簡(jiǎn)單，節(jié)省試劑，最后叔丁醇置換時(shí)將菌液滴到蓋玻片上，進(jìn)行冷凍干燥后即可上機(jī)觀察。圖2-a1、圖2-a2為球菌，球菌飽滿圓潤(rùn)，表面光滑，無皺縮和變形。圖2-b1、圖2-b2為大腸桿菌的電鏡照片，菌體呈桿狀，背景干凈無雜質(zhì)干擾，可以清晰地看到其生殖方式為二分裂；圖2-c1、圖2-c2為放線菌。放線菌等真菌，在固體培養(yǎng)基中，利用插片的方法獲得菌體進(jìn)行處理，能夠真實(shí)地展現(xiàn)菌絲自然生長(zhǎng)的形態(tài)，不會(huì)破壞菌絲和孢子的完整性。

2.3 植物樣品的掃描電鏡觀察

植物樣品的處理過程差別較大，主要是根據(jù)樣品中含水量多少，有無細(xì)胞壁等選擇合適的處理方法。陸生植物（以老鸛草為例）的花粉含水量較少，采用自然干燥的方法進(jìn)行處理，得到的電鏡圖片如圖3-a1、圖3-a2所示，結(jié)構(gòu)完整清晰，無形變，無雜質(zhì)干擾，制樣過程快速簡(jiǎn)單。水生植物（如睡蓮）的花粉含水量高一些，若采用自然干燥法處理，會(huì)有輕微的變形皺縮，因此采用了FAA溶液固定，能得到較好的電鏡圖片（圖3-b1、圖3-b2）。

觀察葉片的表面形貌，需根據(jù)葉子的幼嫩程度（含水量和細(xì)胞壁的有無）選擇合適的處理方法，如圖4-a1、圖4-a2所示是用臨界點(diǎn)干燥法處理的絞股藍(lán)葉片，葉片表面干凈無雜質(zhì)，表皮細(xì)胞飽滿無皺縮，表皮毛清晰完整，基本能夠反映葉片的真實(shí)形貌。圖4-b1、圖4-b2為玉米莖稈的橫截面圖，玉米莖稈中含有大量的硅質(zhì)，質(zhì)地堅(jiān)硬，因此在制樣過程中首先對(duì)其進(jìn)行了脫硅處理。為了減少細(xì)胞形變，采用半薄切片的方法獲得截面，考慮到觀察的目的是統(tǒng)計(jì)維管束細(xì)胞數(shù)目，進(jìn)一步去除多余的雜質(zhì)，在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的同時(shí)，使圖片干凈無干擾，便于測(cè)量和計(jì)數(shù)分析。圖4-c1、圖4-c2是植物花芽的微觀結(jié)構(gòu)，植物的花芽是植物組織中最為幼嫩的部位，極易發(fā)生形變，處理過程需格外小心，利用上述處理過程得到的百合花芽圖片細(xì)胞飽滿，立體感強(qiáng)，獲得了較好的效果。

2.4 動(dòng)物樣品的掃描電鏡觀察

對(duì)于動(dòng)物樣品，根據(jù)細(xì)胞含脂類物質(zhì)的多少，選擇是否需要鋨酸后固定，干燥方法為臨界點(diǎn)干燥法。血細(xì)胞含脂類物質(zhì)較少可以不用鋨酸后固定處理，該處理方法得到的雞血細(xì)胞如圖5-a1、圖5-a2所示，背景簡(jiǎn)單無雜質(zhì)干擾，血細(xì)胞呈中間厚邊緣薄的圓餅狀，血細(xì)胞表面沒有明顯的褶皺，表明該處理過程沒有引起血細(xì)胞的形變，能夠基本反映其真實(shí)的形貌信息。而動(dòng)物組織中脂類物質(zhì)的含量較高，需用鋨酸進(jìn)行固定處理，本研究以雞氣管為例觀察雞氣管中的纖毛，如圖5-b1、圖5-b2所示，細(xì)胞排列整齊無明顯皺縮形變，纖毛排列整齊干凈無雜質(zhì)無斷裂，能夠反映其真實(shí)的形貌。

3 結(jié)論

隨著科技的不斷進(jìn)步，掃描電鏡的性能也在不斷提升，如環(huán)境掃描電鏡可以觀察新鮮植物材料，冷凍掃描電子顯微鏡可以直接觀察蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。但是掃描電鏡的樣品制備技術(shù)一直以來是獲得高質(zhì)量電鏡圖片的瓶頸，沒有統(tǒng)一的方法，主要依靠操作者的經(jīng)驗(yàn)和不斷的嘗試。本研究給出了不同顆粒大小的粉末材料（微米級(jí)淀粉顆粒和納米級(jí)淀粉顆粒）、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、放線菌、陸生植物花粉、水生植物花粉、植物葉片、玉米莖稈、花芽、雞血細(xì)胞、雞氣管等樣品的掃描電鏡制樣方法，樣品涉及材料，植物和動(dòng)物，總結(jié)了適用于不同樣品的掃描電鏡處理方法，均獲得較為滿意的掃描電鏡圖片，為其他樣品的制備提供了參考。

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