三重?zé)晒舛縋CR檢測水產(chǎn)動物源細(xì)菌磺胺類耐藥基因

黃國秋，童桂香，韋信賢，陳靜，吳明媛，黎小正

(廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530021)

三重?zé)晒舛縋CR檢測水產(chǎn)動物源細(xì)菌磺胺類耐藥基因

黃國秋，童桂香，韋信賢，陳靜，吳明媛，黎小正*

(廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530021)

根據(jù)GenBank中細(xì)菌磺胺類耐藥基因Sul1、Sul2和Sul3的保守序列設(shè)計3對特異性引物及相應(yīng)TaqMan探針，以重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立一種可同時檢測上述3種耐藥基因的三重?zé)晒舛縋CR方法，并對該方法進(jìn)行敏感性、特異性、重復(fù)性及臨床菌株檢測試驗。結(jié)果表明：該方法定量范圍為1×101～1×108拷貝/反應(yīng)時，其標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系；該方法靈敏度高(3個基因的最低質(zhì)粒檢測限均可達(dá)到10拷貝/反應(yīng))、特異性強(qiáng)(與其他病原菌及病毒無交叉反應(yīng))、重復(fù)性好(變異系數(shù)均小于2%)；對臨床菌株的檢測結(jié)果與藥敏試驗結(jié)果的符合率達(dá)94.2%，且整個檢測過程可在2 h內(nèi)完成。所建立的可同時檢測Sul1、Sul2和Sul3基因的三重?zé)晒舛縋CR方法可用于臨床檢測細(xì)菌的磺胺類耐藥基因。

水產(chǎn)動物源細(xì)菌；磺胺類耐藥基因；三重?zé)晒舛縋CR

細(xì)菌性疾病是中國水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的主要病害，其造成水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的損失占全部病害損失的50%以上[1–2]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，使用各種抗菌素類藥物抑制或者殺滅致病菌是防治水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細(xì)菌性疾病最有效的手段。磺胺類藥物作為主要的漁用抗菌藥具有抗菌譜廣、藥效顯著、價格低、易儲存等優(yōu)點，是目前各水產(chǎn)養(yǎng)殖場的必備藥物。國內(nèi)大量研究結(jié)果表明，水產(chǎn)動物源細(xì)菌對磺胺類藥物已經(jīng)產(chǎn)生了廣泛的耐藥性[3–5]。臨床上細(xì)菌對磺胺類藥物的抗性主要是由質(zhì)粒上對磺胺類藥物親和力更低的新二氫葉酸合成酶(即具有抗性的DHPS)所介導(dǎo)，且耐藥質(zhì)?？赏ㄟ^轉(zhuǎn)化、易位、接合等方式在細(xì)菌之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，使 R–細(xì)菌從 R+細(xì)菌中獲得這種抗性[6]。對磺胺類藥物具有抗性的DHPS共有3種，其對應(yīng)的編碼基因分別被命名為Sul1、Sul2和Sul3[7]。對這3個基因的檢測能反映細(xì)菌對磺胺類藥物的耐藥情況。熒光定量PCR具有靈敏度高、簡便快速、可定量等優(yōu)點，用于對耐藥基因進(jìn)行檢測，能定量監(jiān)測到細(xì)菌耐藥性的強(qiáng)弱(已有對臨床菌株耐藥基因進(jìn)行檢測的研究[8])。目前，有關(guān)磺胺類藥物耐藥基因熒光定量 PCR檢測方法的報道尚少。筆者結(jié)合多重PCR技術(shù)，針對磺胺類藥物3個耐藥基因Sul1、Sul2和Sul3分別設(shè)計引物及相應(yīng)TaqMan探針，建立快速、簡便、準(zhǔn)確的三重?zé)晒舛縋CR檢測方法，旨在為磺胺類藥物耐藥性的快速檢測和耐藥基因的調(diào)查提供一種全新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

待檢菌株共72株，2013—2015年從廣西水產(chǎn)動物或水產(chǎn)品中分離得到，其中沙門氏菌 13株，志賀氏菌7株，嗜水氣單胞菌36株，溫和氣單胞菌6株，愛德華氏菌8株，肺炎克雷伯菌2株。

Sul1、Sul2和Sul3基因陽性菌株為肺炎克雷伯菌GX120222分離株，經(jīng)PCR鑒定攜帶Sul1、Sul2和Sul3基因。

草魚呼腸孤病毒(GCRV)、白斑綜合征病毒(WSSV)、傳染性皮下與造血組織壞死病毒(IHHNV)均由廣西漁業(yè)病害防治環(huán)境監(jiān)測和質(zhì)量檢驗中心鑒定與保存。

磺胺嘧啶(Sulfadiazine，SD)和磺胺甲基異惡唑(Sulfamethoxazole，SMZ) 購于中國獸藥生物制品監(jiān)察所，含量均達(dá)99.5%以上；營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購自杭州濱和微生物試劑有限責(zé)任公司；2×Taq PCR MasterMix(含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；DL1 000 DNA Marker、pMD18– T、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、Premix Ex Taq(Probe qPCR)均購自寶生物工程(大連)有限公司；氨芐青霉素購自 Promega公司；瓊脂糖購自英韋創(chuàng)津生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)、分析純。

1.2 方法

1.2.1 水產(chǎn)動物源臨床菌株對磺胺類藥物的敏感性測定

采用瓊脂平板紙片擴(kuò)散法(K–B法)分別測定72株水產(chǎn)動物源臨床菌株對SD和SMZ的抑菌圈直徑。藥敏紙片的制備參見文獻(xiàn)[9]，藥敏結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)見文獻(xiàn)[10]。

1.2.2 引物及探針設(shè)計

用 DNAStar軟件對多種屬細(xì)菌的 Sul1、Sul2和Sul3基因進(jìn)行比較，采用Primer Express 3.0和Oligo 6.0軟件，在保守序列區(qū)域按照多重?zé)晒舛縋CR引物設(shè)計原則，共設(shè)計合成3套引物及探針，其中探針5′端依次標(biāo)記熒光報告基團(tuán)FAM、HEX和CY5，3′端均標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán) BHQ1，引物和探針均由上?；瞪锟萍加邢薰竞铣?。各引物及探針序列見表1。

表1 引物及探針信息Table 1 Information about the primers and probes

1.2.3 細(xì)菌DNA的提取及重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將試驗菌株的單菌落分別接種于營養(yǎng)肉湯中，36 ℃培養(yǎng)18 h；取2 mL菌懸液，采用煮沸法[11]提取細(xì)菌總DNA，于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以菌株GX120222的DNA為模板，用Sul1、Sul2和Sul3基因引物擴(kuò)增各自特異性目的片段，用DNA回收試劑盒按說明書分別純化回收相應(yīng)目的片段，然后將回收的目的片段與 pMD18–T載體連接。連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化 E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過菌落PCR篩選陽性克隆，并測序鑒定。取測序結(jié)果正確的陽性克隆菌液5 mL，按照質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒，并將提取的質(zhì)粒分別命名為pMD18–T– Sul1、pMD18–T–Sul2和pMD18–T–Sul3。用GeneQuant核酸蛋白分析儀分別測定重組質(zhì)粒的濃度。根據(jù)阿弗加德羅常數(shù)將濃度轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)。稀釋質(zhì)粒DNA為1.0×101～1.0×108拷貝/μL。以該8個梯度質(zhì)粒DNA為標(biāo)準(zhǔn)品，－20 ℃保存，備用。

1.2.4 三重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件的優(yōu)化

用1.0×106拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品DNA作為模板，將引物終濃度0.1～0.8 μmol/L和探針終濃度0.1～0.5 μmol/L的不同組合(采用矩陣法進(jìn)行組合)進(jìn)行熒光定量 PCR，獲得最低臨界循環(huán)數(shù)(Ct)和較高相對熒光強(qiáng)度增加值(ΔRn)時的引物和探針濃度，作為優(yōu)化單個靶基因的檢測體系。在此基礎(chǔ)上，以1.0×106拷貝/μL的3種標(biāo)準(zhǔn)品等比例混合液為模板進(jìn)行三重?zé)晒舛?PCR，逐步改變各引物(單個靶基因最佳引物濃度±0.2 μmol/L)與探針(單個靶基因最佳探針濃度±0.2 μmol/L)的濃度以達(dá)到最佳的擴(kuò)增效果。

退火溫度的優(yōu)化：參考各引物的Tm值，在58～62 ℃以梯度1 ℃進(jìn)行多重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增，根據(jù)Ct值及擴(kuò)增曲線形狀確定最佳退火溫度。

Premix Ex Taq Mix的優(yōu)化：在反應(yīng)體系中使Premix Ex Taq Mix添加量為0.8×、0.9×、1×、1.1×、1.2×、1.3×、1.4×、1.5×，根據(jù)Ct值及擴(kuò)增曲線形狀確定最佳Premix Ex Taq Mix反應(yīng)濃度。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及敏感性、特異性、重復(fù)性試驗

以10倍梯度稀釋的Sul1、Sul2和Sul3基因標(biāo)準(zhǔn)品等比例混合 DNA(1.0×101～1.0×108拷貝/μL)為模板，運用優(yōu)化后的多重?zé)晒舛縋CR方法進(jìn)行擴(kuò)增，建立關(guān)于模板起始拷貝數(shù)對數(shù)和Ct值的標(biāo)準(zhǔn)方程，并根據(jù)Ct值來判斷該方法的敏感性。

以陽性菌株及部分磺胺類藥物敏感菌、GCRV、WSSV和IHHNV的核酸樣品為模板，用優(yōu)化后的三重?zé)晒舛縋CR方法進(jìn)行檢測，觀察結(jié)果。

取108、107、106拷貝/μL 3個梯度的各標(biāo)準(zhǔn)品DNA進(jìn)行三重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)，每個濃度3次重復(fù)，計算Ct值的變異系數(shù)。

1.3 三重?zé)晒舛縋CR方法的臨床應(yīng)用

用三重?zé)晒舛縋CR方法檢測72株臨床菌株的Sul1、Sul2和Sul3基因，將出現(xiàn)擴(kuò)增曲線的基因判為陽性，并將擴(kuò)增結(jié)果與藥敏試驗結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果表明，72株水產(chǎn)動物源臨床菌株對 SD和 SMZ的耐藥率分別為 68.1%(49/72)和62.5% (45/72)，對2種磺胺類藥物的交叉耐藥率為80.8%(42/72)。72株細(xì)菌中有16株對SD或SMZ中敏，僅4株對SD或SMZ敏感，這表明水產(chǎn)動物源細(xì)菌對磺胺類藥物的耐藥現(xiàn)象非常普遍。

2.2 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備結(jié)果

Sul1、Sul2和Sul3基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(圖1)，擴(kuò)增出的條帶大小分別為67、76、83 bp，均與預(yù)期大小一致。目的片段回收純化后克隆入pMD18–T載體，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR測序鑒定，所得序列與GenBank公布的同種細(xì)菌磺胺類藥物耐藥基因Sul1、Sul2和Sul3的同源性均為100%。取陽性克隆菌液提取質(zhì)粒，測定其濃度并轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)，可得pMD18–T–Sul1、pMD18–T–Sul2和pMD18–T–Sul3的濃度分別為3.72×109、4.56×109、6.32×109拷貝/μL，均能滿足標(biāo)準(zhǔn)品的要求。

圖1 Sul1和Sul2及Sul3基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplifcation of gene Sul1, Sul2 and Sul3 from sulfonamides–resistance bacteria

2.3 三重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

對三重?zé)晒舛縋CR各條件進(jìn)行優(yōu)化后，最終確定反應(yīng)體系為：Premix Ex Taq (2×) 18 μL，ROX Reference Dye 0.5Ⅱ μL，Sul1上、下游引物(20 μmol/L)均為0.9 μL，Sul1探針用量(10 μmol/L)為0.9 μL，Sul2和Sul3的上、下游引物(20 μmol/L)均為0.6 μL，Sul2和Sul3探針用量(10 μmol/L)均為0.6 μL，模板3 μL，用滅菌ddH2O補(bǔ)足至30 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火并延伸45 s，擴(kuò)增40個循環(huán)；在每個循環(huán)60 ℃結(jié)束時收集熒光信號。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以10倍梯度稀釋的各標(biāo)準(zhǔn)品等比例混合DNA (1×101～1×108拷貝/μL)為模板，使用優(yōu)化后的三重?zé)晒舛縋CR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線均呈明顯的“S”型，而陰性對照和空白對照均沒有出現(xiàn)任何擴(kuò)增(圖2)。利用儀器自帶的數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析，橫坐標(biāo)(X) 代表起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)(Y) 代表Ct值，得到3條標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。

圖2 Sul1和Sul2及Sul3基因的三重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification plot of the triple real–time qPCR from Sul1, Sul2 and Sul3

圖3 三重?zé)晒舛縋CR檢測Sul1和Sul2及Sul3基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curves of the triple real–time qPCR from Sul1, Sul2 and Sul3

Sul1的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y= –3.572lg X+42.12，擴(kuò)增效率(Eff.)和相關(guān)系數(shù)方值 (RSq)分別為 90.5%和0.996；Sul2的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y= –3.551lg X+ 41.49，Eff.和RSq分別為91.3%和0.993；Sul3的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y = –3.712 lg X+3.46，Eff.和RSq分別為86.0%和0.994。由以上標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可見，起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)與 Ct值均呈良好的線性關(guān)系，能夠準(zhǔn)確地反映目的產(chǎn)物的擴(kuò)增。

2.5 三重?zé)晒舛縋CR的敏感性和特異性及重復(fù)性

2.5.1 敏感性

經(jīng)檢測，重組質(zhì)粒 pMD18–T–Sul1模板為 10拷貝/反應(yīng)時仍可檢測到熒光信號值，3個重復(fù)的Ct值分別為 37.66、37.80、38.22；重組質(zhì)粒pMD18–T–Sul2模板為10拷貝數(shù)/反應(yīng)時也可檢測到熒光信號值，3個重復(fù)的 Ct值分別為 37.34、37.54、38.06；重組質(zhì)粒pMD18–T–Sul3模板為10拷貝數(shù)/反應(yīng)時也可檢測到熒光信號值，3個重復(fù)的Ct值分別為36.32、36.33和36.38。以上結(jié)果表明，本研究中建立的三重?zé)晒舛縋CR檢測Sul1、Sul2和Sul3基因的靈敏度均可達(dá)到10拷貝/反應(yīng)，與常規(guī)PCR檢測靈敏度104拷貝/反應(yīng)相比[12]，敏感性顯著提高(圖4～6)。

圖4 Sul1基因敏感性的三重?zé)晒舛縋CR檢測結(jié)果Fig.4 Sensitivity of the triple real–time qPCR in Sul1detection

圖5 Sul2基因敏感性的三重?zé)晒舛縋CR檢測結(jié)果Fig.5 Sensitivity of the triple real–time qPCR in Sul2 detection

圖6 Sul3基因敏感性的三重?zé)晒舛縋CR檢測結(jié)果Fig.6 Sensitivity of the triple real–time qPCR in Sul3 detection

圖7 三重?zé)晒舛縋CR的特異性檢測結(jié)果Fig.7 Specificity evaluation for the triple real–time qPCR

2.5.2 特異性

用建立的三重?zé)晒舛?PCR對陽性菌株及磺胺類藥物敏感菌、GCRV、WSSV和IHHNV的核酸進(jìn)行檢測的結(jié)果(圖7)表明，只有陽性菌株出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其他菌株及病毒均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，均為陰性，表明本研究中建立的三重?zé)晒舛?PCR對Sul1、Sul2和Sul3基因的檢測具有很好的特異性。

2.5.3 重復(fù)性

108、107、106拷貝/μL各標(biāo)準(zhǔn)品DNA三重?zé)晒舛縋CR重復(fù)性試驗Ct值的變異系數(shù)(CV)見表2。結(jié)果表明，Ct值的變異系數(shù)為0.30%～1.01%，說明建立的三重?zé)晒舛縋CR具有良好的重復(fù)性。

表2 三重?zé)晒舛縋CR重復(fù)試驗結(jié)果Table 2 Results of repeatability test for triple real–time qPCR

2.6 三重?zé)晒舛縋CR對臨床菌株的檢測結(jié)果

用所建立的三重?zé)晒舛縋CR方法對72株臨床菌株進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，耐SD或SMZ的52株菌株中有49株檢測出了Sul1或Sul2或Sul3基因，與藥敏試驗相比，耐藥基因的符合率為94.2%，其中，有43株含有Sul1基因，有26株含Sul2基因，有4株含有Sul3基因，有23株含有2種或2種以上的基因。16株中度敏感菌中有13株檢出耐藥基因，其中，有11株含有Sul1基因，有7株含Sul2基因，有1株含有Sul3基因，有6株含有2種或2種以上的基因。在4株敏感菌中沒有檢測出任何耐藥基因，與藥敏試驗相比符合率為 100%。檢出耐藥基因的菌株，其菌液耐藥基因濃度為 109～106拷貝/mL。

3 結(jié)論與討論

72株水產(chǎn)動物源臨床菌株對磺胺類藥敏感性的測定結(jié)果表明，72株菌株對SD和SMZ的耐藥率分別為68.1%和62.5%，對2種磺胺類藥物的交叉耐藥率為80.8%，僅有16株細(xì)菌對SD或SMZ中敏，有4株對SD或SMZ敏感，其耐藥率比廣西羅非魚源致病菌對磺胺類的耐藥率(53.3%)[13]高，說明廣西水產(chǎn)動物源菌株對磺胺類藥物的耐藥現(xiàn)象非常嚴(yán)重，且有不斷加重的趨勢。本試驗中的耐藥率與其他畜禽動物源菌株對磺胺類的耐藥率[14]相近，說明磺胺類藥物在使用過程中極易產(chǎn)生耐藥性，這與用藥頻率和用藥強(qiáng)度有關(guān)，還與細(xì)菌對磺胺類藥產(chǎn)生耐藥性的分子機(jī)制密切相關(guān)，因為細(xì)菌對磺胺類藥的耐藥基因大部分位于質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上，可以容易地在同種屬或不同種屬的細(xì)菌間從一個質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到另一個質(zhì)?；蛉旧w上[15–16]。病原菌對磺胺類藥物容易產(chǎn)生交叉耐藥性[17]。本試驗結(jié)果印證了這一結(jié)論。

中國目前臨床上對細(xì)菌磺胺類藥物耐藥性的檢測主要采用傳統(tǒng)的藥敏試驗方法。這些方法耗時長，準(zhǔn)確性差，靈敏度低，穩(wěn)定性不強(qiáng)，已不能滿足臨床上快速、準(zhǔn)確篩選敏感藥物的需要。鑒于此，國內(nèi)已有學(xué)者將 PCR技術(shù)應(yīng)用于磺胺類藥耐藥性的快速檢測和耐藥基因的分子流行病學(xué)調(diào)查[7,12]。實時熒光定量PCR不僅有常規(guī)PCR技術(shù)擴(kuò)增效率高的特點，還具有探針的高度特異性、光譜技術(shù)的高敏感性和精確性等特點[18]，且能定量，不易受到污染，被廣泛運用于醫(yī)療、藥物研究及病原菌–檢測[19–22]。多重PCR技術(shù)能夠在一個PCR體系中同時檢測多個目標(biāo)基因，其快速、高效及低成本等特點具有十分廣泛的應(yīng)用前景。本研究中根據(jù)GenBank中Sul1、Sul2和Sul3基因的保守序列設(shè)計特異性引物及相應(yīng)TaqMan探針，并對引物探針濃度配比、反應(yīng)體系及反應(yīng)條件等進(jìn)行優(yōu)化，建立了可同時檢測上述3種耐藥基因的三重?zé)晒舛縋CR方法。敏感性、特異性和重復(fù)性測試試驗結(jié)果表明，該方法定量范圍寬，檢測模板范圍為1×101～1×108拷貝/反應(yīng)時，其標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系；該方法靈敏度高，Sul1、Sul2和Sul3的最低質(zhì)粒檢測限均可達(dá)到10拷貝/反應(yīng)；該方法特異性強(qiáng)，與其他病原菌及病毒無交叉反應(yīng)；該方法重復(fù)性好，變異系數(shù)均小于2%；整個檢測過程可在2 h內(nèi)完成，符合臨床上對菌株進(jìn)行磺胺類藥物耐藥性快速檢測的需求，具有較高的應(yīng)用價值。

用本研究中建立的三重?zé)晒舛縋CR方法檢測72株水產(chǎn)動物源臨床菌株中的耐藥基因Sul1、Sul2和Sul3，結(jié)果表明，耐SD或SMZ的52株菌株中有49株檢測出了Sul1或Sul2或Sul3基因，與藥敏試驗結(jié)果的符合率為94.2%，具有較高的準(zhǔn)確性；在52株耐SD或SMZ的菌株中，有45株(占86.5%)檢測到了Sul1或(和)Sul2基因，僅有4株(占7.7%)檢測到了Sul3基因，說明水產(chǎn)動物源菌株以Sul1和Sul2基因為主(91.8%)，與畜禽動物源菌株(2/3的Sul1和Sul2基因、1/3的Sul3基因)相差較大[23]。本研究中檢出耐藥基因的菌株，其耐藥基因的拷貝數(shù)都比較高，菌液濃度均為109～106拷貝/mL(約108個細(xì)菌)，說明耐藥基因在單個細(xì)菌中可單拷貝/多拷貝存在，但耐藥基因拷貝數(shù)與耐藥程度并不一定呈正相關(guān)，這可能是因為該耐藥基因本身變異或缺失引起功能減弱或者功能喪失所致，也可能是該耐藥基因在菌株中受到抑制而沒有得到表達(dá)所致?？梢?，細(xì)菌耐藥基因表達(dá)與耐藥表型和耐藥程度的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。此外，本研究中建立的方法可檢出包括沙門氏菌、志賀氏菌、嗜水氣單胞菌、愛德華氏菌和肺炎克雷伯菌等多種屬細(xì)菌的磺胺類藥耐藥基因，說明該方法可廣泛應(yīng)用，同時說明Sul1、Sul2和Sul3基因在不同種屬的細(xì)菌中非常保守。

總之，本研究中建立的同時檢測Sul1、Sul2和Sul3基因的三重?zé)晒舛縋CR方法不僅具有快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確、定量、重復(fù)性好等優(yōu)點，還能區(qū)分不同的耐藥基因，可為臨床細(xì)菌磺胺類藥耐藥基因的快速檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供快速簡便、準(zhǔn)確高效的檢測手段。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

Detection sulfonamides–resistance genes of pathogenic bacteria derived from aquatic animals using triple real–time PCR

HUANG Guoqiu, TONG Guixiang, WEI Xinxian, CHEN Jing, WU Mingyuan, LI Xiaozheng*
(Guangxi Academy of Fishery Science, Nanning 530021, China)

Triple TaqMan real–time PCR method was developed to simultaneously detect sulfonamides–resistance genes Sul1, Sul2 and Sul3, the three pathogenic bacteria in aquatic animals in the study.Three pairs of specific primers and fluorogenic–labeled probes were designed and synthesized in accordance with the above target genes using software Primer Express 3.0.The reaction system and procedure were optimized, as well as the detection sensitivity, specificity, repeatability and clinical application of the method.Results showed that the method had a wide quantitative range from 1×101to 1×108copies per reaction, which presented a good linear relationship in its standard curve.The triple real–time PCR method had a high specificity in detecting mixed DNA of Sul1, Sul2 and Sul3, but not those DNA from other bacteria and viruses; it also had a high sensitivity to the detection limit low to 10 copies per reaction for the purifed recombinant plasmids of Sul1, Sul2 and Sul3.The variation coeffcients of the established method were less than 2%.Sulfonamides–resistance genes of 72 clinical isolates were analyzed using triple real–time PCR method and they were compared to drug sensitive test, the coincidence rate could reach to 94.2%.The entire detection could be completed within 2 h.In conclusion, the triple TaqMan real–time PCR method developed in the present study could be applied to the rapid detection and molecular epidemiology survey in sulfonamides–resistance genes Sul1, Sul2 and Sul3 of clinical pathogenic strains isolated from aquatic animals.

pathogenic bacteria from aquatic animals; sulfonamides resistant genes; triple TaqMan real–time PCR

S917.1

：A

：1007-1032(2017)01-0064-07

2016–04–22

2016–12–06

廣西水產(chǎn)畜牧科技項目(桂漁牧科201528044)；廣西科技攻關(guān)項目(桂科攻1355010–3)

黃國秋(1981—)，女，廣西南寧人，工程師，主要從事水產(chǎn)品微生物檢驗研究，33958119@qq.com；*通信作者，黎小正，研究員，主要從事水產(chǎn)品檢驗檢疫和漁業(yè)環(huán)境保護(hù)等方面的研究，lixz@tom.com