復(fù)合生物營養(yǎng)劑對水體環(huán)境的影響

曾東，吳海燕，倪學(xué)勤*，謝永斌，歐星平，崔蘭

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物微生態(tài)研究中心，四川 雅安 625014；2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 雅安 625014)

復(fù)合生物營養(yǎng)劑對水體環(huán)境的影響

曾東1,2，吳海燕1#，倪學(xué)勤1,2*，謝永斌1，歐星平1，崔蘭1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物微生態(tài)研究中心，四川 雅安 625014；2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 雅安 625014)

采用水族箱試驗，研究不同營養(yǎng)物質(zhì)組合的復(fù)合生物營養(yǎng)劑對水體環(huán)境的影響。試驗分為4個組，CK組為空白對照組，A、B、C組為施用復(fù)合生物營養(yǎng)劑組，其有機營養(yǎng)物質(zhì)、無機鹽和微量營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量比的比例分別為16∶78∶6、32∶62∶6和48∶46∶6。結(jié)果表明：C組的溶解氧(DO)含量顯著低于其余各組；A組的有害物質(zhì)含量最高，其氨氮(NH3–N)含量顯著高于CK組和B組，但與C組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其亞硝酸氮(NO2–N)含量顯著高于其余各組；A組和B組的營養(yǎng)效果較好，其水體總氮(TN)、總磷(TP)含量均高于其余各組；各營養(yǎng)劑處理組水體中芽孢桿菌(Bacillus)的數(shù)量顯著高于CK組，而氣單胞菌(Aeromonas)的數(shù)量則顯著低于CK組；相對于CK組，各營養(yǎng)劑處理組浮游生物的豐度和多樣性都有不同程度的提高，其中以B組最明顯；TN含量和TP含量是影響原核生物群落變化的主要因子，而DO含量和NH3–N含量是影響真核生物群落變化的主要因子。綜合分析結(jié)果表明，有機營養(yǎng)物質(zhì)、無機鹽、微量營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量比為32∶62∶6的復(fù)合生物營養(yǎng)劑具有較好的改善水體環(huán)境的作用。

復(fù)合生物營養(yǎng)劑；水質(zhì)；微生物；浮游生物

Keywords: compound bio-nutrient; water quality; microorganisms; plankton

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中普遍通過使用營養(yǎng)劑來增加水體營養(yǎng)，促進(jìn)餌料生物大量繁殖，進(jìn)而獲得較高的生產(chǎn)效益[1–2]。傳統(tǒng)水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要使用的營養(yǎng)劑有無機營養(yǎng)劑、有機營養(yǎng)劑及無機–有機復(fù)合營養(yǎng)劑三大類。這三類營養(yǎng)劑雖然都能以較低的投入獲得較高的產(chǎn)量，但都存在一系列導(dǎo)致水體污染和水產(chǎn)病害的問題[3]。隨著近年來人們環(huán)境保護(hù)意識的提高，水質(zhì)管理和環(huán)境污染治理日益受到重視[4]。由于復(fù)合生物營養(yǎng)劑具有調(diào)控水質(zhì)和改善環(huán)境的功能，營養(yǎng)也更全面，所以，在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的應(yīng)用前景廣泛[5]。筆者研究不同營養(yǎng)物質(zhì)組合的復(fù)合生物營養(yǎng)劑(compound bio-nutrient，CB)對養(yǎng)殖水體環(huán)境的作用效果，以期為復(fù)合生物營養(yǎng)劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

復(fù)合生物營養(yǎng)劑(compound bio-nutrient，CB)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物微生態(tài)研究中心研制，主要由有機營養(yǎng)物質(zhì)、無機鹽和微量營養(yǎng)物質(zhì)組成。

有機營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)酵雞糞由四川什邡市福綠農(nóng)資有限公司提供。發(fā)酵雞糞較其他有機營養(yǎng)物質(zhì)具有更優(yōu)的營養(yǎng)物質(zhì)組成，氮、磷、鉀含量高，有害微生物數(shù)量低，對浮游生物的促生長效果更顯著。

無機鹽組分：磷酸二氫銨42%，尿素32%，氯化銨26%，均采用分析純。

微量營養(yǎng)物質(zhì)組分：FeSO4·7H2O 10‰，ZnSO4·7H2O 10‰，MnSO4·H2O 2‰，CuSO4·5H2O 5‰，CoCl2·6H2O 0.05‰，CaCO369.95‰，Lys 23‰，Met 23‰，水產(chǎn)復(fù)合維生素23‰，腐殖酸鈉667‰，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)JS01167‰(由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)微生態(tài)研究中心提供，其有效活菌數(shù)為4.76×1010CFU/g)。

1.2 試驗設(shè)計

試驗分為CK、A、B、C共4個組，CK組不施用營養(yǎng)劑，作為空白對照，A、B、C組為施用復(fù)合生物營養(yǎng)劑組，其有機營養(yǎng)物質(zhì)、無機鹽和微量營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量比分別為 16∶78∶6、32∶62∶6和48∶46∶6，每個處理 3個重復(fù)。試驗在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)教學(xué)實驗基地水族箱中進(jìn)行。水族箱規(guī)格為70 cm×40 cm×40 cm。水源為曝氣自來水。試驗期間溫度為24.6~28.8 ℃，自然光照。試驗期為35 d。試驗期間每隔14 d施用1次營養(yǎng)劑，于添加營養(yǎng)劑后第7天檢測水體的理化指標(biāo)和微生物數(shù)量，于試驗結(jié)束時對不同處理組水體的浮游生物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳測定。

1.3 樣品采集與處理

采集水族箱中心處的水樣。所測定的水質(zhì)指標(biāo)包括溶解氧(DO)、氨氮(NH3–N)、亞硝酸氮(NO2–N)、總氮(TN)、總磷(TP)共5種物質(zhì)的含量。水質(zhì)分析參照文獻(xiàn)[6]中的方法進(jìn)行。

于每個水族箱中采集水樣40 mL，用無菌生理鹽水進(jìn)行 10倍系列稀釋后測定微生物數(shù)量。將異養(yǎng)菌(heterotrophic bacteria)和氣單胞菌(Aeromonas)分別接種于R2A培養(yǎng)基和RS培養(yǎng)基；將芽孢桿菌(Bacillus)和弧菌(Vibrio) 分別涂布于 NA培養(yǎng)基和TCBS培養(yǎng)基[7]。每個稀釋度重復(fù)3次，于28 ℃培養(yǎng)24~48 h后計數(shù)，結(jié)果以每1 mL水體微生物群落數(shù)量的對數(shù)值表示。

于每個水族箱采集水樣500 mL，8 000 r/ min離心20 min后，將沉淀樣品分裝于2 mL EP管，–20℃凍存，備用。浮游生物樣品DNA的抽提參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。原核生物16S rDNA基因采用通用引物F357GC(5'–CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGC CCGCCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGC AG–3')和 R518(5'–ATTACCGCGGCTGCTGG–3')[9]進(jìn)行PCR擴增，真核生物18S rDNA基因采用通用引物F1427GC(5'–CGCCCGCCGCGCCCCGCGCC CGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCTGTGATGCCC TTAGATGTTCTGGG–3')和R1616(5'–GCGGTGTG TACAA AGGGCAGGG–3')[8]進(jìn)行PCR擴增。PCR產(chǎn)物采用10%的聚丙烯酰胺通過DcodeTM電泳檢測系統(tǒng)(Bio–Rad)進(jìn)行DGGE分析[10]。原核的變性劑梯度為35%~65%，真核的變性劑梯度為30%～55%。用1×TAE緩沖液于200 V、60 ℃電泳5 min，于100 V、60 ℃電泳16 h后用硝酸銀染色，通過凝膠成像系統(tǒng)掃描成像[11]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

水質(zhì)和微生物指標(biāo)數(shù)據(jù)采用 SPSS 19.0進(jìn)行One–Way ANOVY分析，用Duncan’s 進(jìn)行多重比較；DGGE電泳圖譜采用BIO–RAD Quantity One進(jìn)行分析[12]；將各 DGGE帶譜視為獨立的分類單元(OTU)，采用非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，并計算Shannon–Wieave多樣性指數(shù)[13]和Pielou均勻度指數(shù)[14]；用Canoco 5對環(huán)境因子和浮游生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系進(jìn)行冗余分析(RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合生物營養(yǎng)劑對水質(zhì)的影響

由表1可見，C組的DO含量顯著低于其余各組(P＜0.05)，而CK、A組、B組DO含量間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各營養(yǎng)劑處理組的NH3–N含量顯著高于對照組(P＜0.05)，其中以A組的最高，C組的次之；水體的NO2–N含量以A組的最高，且A組與其余各組的差異顯著(P＜0.05)，而B組和C組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各營養(yǎng)劑處理組的 TN含量和TP含量水平較CK均有明顯提高，以A組的TN含量最高，A、B組與CK組的差異顯著(P＜0.05)，而CK組與C組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；TP含量水平以A組和B組的較高，顯著高于CK組和C組的(P＜0.05)，而CK組與C組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各處理水體的理化指標(biāo)Table 1 Physiochemical parameters of water in different treatments

2.2 復(fù)合生物營養(yǎng)劑對微生物群落數(shù)量的影響

由圖1可知，C組(其有機營養(yǎng)物質(zhì)含量最高)水體中異養(yǎng)菌和芽孢桿菌的數(shù)量顯著高于其余各組(P＜0.05)；A組和B組芽孢桿菌的數(shù)量與CK組具有顯著差異(P＜0.05)，但這二組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各營養(yǎng)劑處理組氣單胞菌的數(shù)量顯著低于CK組(P＜0.05)，C組則顯著高于A組和B組(P＜0.05)，而A組和B組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。弧菌的數(shù)量各組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 各處理水體的微生物數(shù)量Fig.1 Aquatic microorganisms amount in different treatments

2.3 復(fù)合生物營養(yǎng)劑對浮游生物群落結(jié)構(gòu)的影響

在原核生物DGGE圖譜(圖2)中，B組的平均條帶數(shù)最多，檢測到23條，A、C組的次之，CK組的最少，僅13條。B組的多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)最大，分別為3.12和0.86，CK組的最小，分別為2.56和0.71。

圖2 各處理水體原核生物16S rDNA片段的DGGE電泳圖譜Fig.2 DGGE profiles of prokaryote 16S rDNA fragments in different treatments

真核生物DGGE圖譜(圖3)與原核生物的檢測結(jié)果基本一致，以B組的條帶數(shù)最多，檢測到16條，A、C組的次之，CK組的最少，僅7條。多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)均以B組的最大，分別為2.70和0.74，對照組的最小，分別為1.95和0.54(表2)。原核生物和真核生物的UPGMA聚類分析結(jié)果(圖4，圖5)顯示，CK組均能聚為一族，而各營養(yǎng)劑處理組較為分散，說明CK組的相似性較高，而各營養(yǎng)劑處理組間的差異較大。

圖3 各處理水體原核生物16S rDNA片段的系統(tǒng)聚類樹Fig.3 Cluster analysis on prokaryote 16S rDNA fragments in different treatments

圖4 各處理水體真核生物18S rDNA片段的DGGE電泳圖譜Fig.4 DGGE profiles of eukaryote 18S rDNA fragments in different treatments

圖5 各處理水體真核生物18S rDNA片段的系統(tǒng)聚類樹Fig.5 Cluster analysis of eukaryote 18S rDNA fragment in different treatments

表 2 各處理水體浮游生物的條帶數(shù)和多樣性指數(shù)及均勻度指數(shù)Table 2 Number of DGGE bands, Shannon-wiener diversity index and Pielou evenness index of plankton communities in different treatments

2.4 浮游生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系

圖6反映了原核生物群落結(jié)構(gòu)與5種環(huán)境理化因子之間的關(guān)系。RDA排序圖的2個主要軸的特征值分別為0.321和0.153，這2軸所代表的環(huán)境因子能夠解釋 47.46%原核生物物種的變化信息。RDA分析結(jié)果顯示，TP、TN、NO2–N 含量構(gòu)成原核生物群落結(jié)構(gòu)的主要影響因子，均與第2軸具有較大的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.813 6、0.779 5、0.750 2。從排序圖中可看出，CK組和C組均分布在環(huán)境軸的反方向上，其原核生物群落結(jié)構(gòu)與各環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)，并與B組原核生物群落結(jié)構(gòu)DO含量呈正相關(guān)，并與TN含量和TP含量有一定的相關(guān)性。

圖6 各處理水體原核生物群落的RDA分析結(jié)果Fig.6 Ordination on data from prokaryotic plankton in different treatments using redundancy analysis (RDA)

圖7反映了真核生物群落結(jié)構(gòu)與5種環(huán)境理化因子之間的關(guān)系。RDA排序圖的2個主要軸的特征值分別為0.249和0.147。這2軸所代表的環(huán)境因子能夠解釋 39.53%真核生物物種的變化信息。NH3–N、DO含量為影響真核生物群落結(jié)構(gòu)的主要因子，分別與第1軸和第2軸呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.506 8、0.513 1。由排序圖可知，B組真核生物群落結(jié)構(gòu)與 DO含量呈正相關(guān)，但與 NH3–N含量呈負(fù)相關(guān)；C組真核生物群落結(jié)構(gòu)與 NH3–N含量呈顯著正相關(guān)。

圖7 各處理水體真核生物群落的RDA分析結(jié)果Fig.7 Ordination on the data from eukaryotic plankton in different treatments using redundancy analysis (RDA)

3 結(jié)論與討論

不同類型的營養(yǎng)劑對水體環(huán)境的作用效果不同。無機營養(yǎng)劑對水體的N、P水平具有顯著的提升作用，對浮游生物的促生長效果更佳[15–16]，但營養(yǎng)鹽濃度過高時易造成水質(zhì)不穩(wěn)定，有害物質(zhì)含量上升，并引發(fā)水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象[17]。發(fā)酵有機營養(yǎng)劑具有更復(fù)雜的微生物區(qū)系，能夠使水體中的微生物數(shù)量顯著提高[18]。有研究[19]表明，高劑量的有機營養(yǎng)劑易引發(fā)厭氧分解，導(dǎo)致大量有毒氣體如CO2、H2S和NH3等的產(chǎn)生，使浮游生物量及池塘產(chǎn)量降低。本研究中，A組具有較高的營養(yǎng)水平及最高的NH3–N含量和NO2–N含量，是無機鹽含量過高的表現(xiàn)。C組水體中微生物數(shù)量高、NH3–N含量顯著上升、DO含量降低與水體自身有機物含量過高有關(guān)。B組的水質(zhì)狀況好于A組和C組的，有害物質(zhì)含量和有害菌數(shù)量均較低，說明B組水質(zhì)的營養(yǎng)物質(zhì)組成豐富且合理，可促進(jìn)水體微生物多樣性和代謝活性提高[20]，進(jìn)一步促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的利用、循環(huán)與轉(zhuǎn)化，使得水體中有害物質(zhì)NH3–N和NO2–N的含量降低，不至引起有害菌的大量增殖。此外，益生菌對水體微生物群落有重要影響，能夠改善水體生物群落結(jié)構(gòu)，抑制有害菌的繁殖[21]。本研究結(jié)果表明，復(fù)合生物營養(yǎng)劑能顯著提高水體芽孢桿菌的數(shù)量，顯著降低氣單胞菌的數(shù)量，但對弧菌無明顯影響。

本試驗中的DGGE檢測結(jié)果顯示，使用營養(yǎng)劑后水體中浮游生物的物種更豐富，多樣性也更高，而各營養(yǎng)劑處理組中以 C組獲得的浮游生物條帶數(shù)較少，這可能與其無機鹽含量低且水質(zhì)較差、水體中浮游生物數(shù)量少有關(guān)[19]。B組獲得的條帶數(shù)最多，約為對照組的2倍，說明該組的營養(yǎng)組成更符合浮游生物的生長需要，水體微生物種群的結(jié)構(gòu)較優(yōu)化，浮游生物的繁殖量大[22]。微生物對復(fù)雜有機物具有礦化作用，能夠提高水體磷酸鹽水平，促進(jìn)浮游生物的豐度和初級生產(chǎn)力的提高[23–24]。本研究中的相關(guān)性分析結(jié)果顯示：浮游生物的多樣性與TN含量、TP含量和DO含量等密切相關(guān)，說明該試驗條件下浮游生物對營養(yǎng)鹽具有較好的響應(yīng)。RDA排序圖顯示，CK組分布較集中，C組的次之，A、B組較為分散。聚類分析結(jié)果與RDA排序結(jié)果一致，表明施用營養(yǎng)劑后水體中浮游生物的群落結(jié)構(gòu)都有較大改變，浮游生物群落相似性降低，尤其以無機鹽含量較高的A組和B組最明顯，表明高含量無機鹽使水質(zhì)波動較大，使浮游生物的繁殖和演替迅速，種類的穩(wěn)定性受到一定影響[16]。由于水族箱中的生態(tài)系統(tǒng)較簡單，水源中的浮游生物較少，因此，本試驗中獲得的浮游生物種類比前人研究中的少。在今后的研究中可適當(dāng)引入藻源生物(人工添加藻種或使用藻相較好的湖泊水)，以獲得更高的浮游生物多樣性，使研究結(jié)果更加符合水產(chǎn)養(yǎng)殖需求。

綜合分析結(jié)果表明，含有32%有機營養(yǎng)物質(zhì)、78%無機鹽和 6%微量營養(yǎng)物質(zhì)的復(fù)合生物營養(yǎng)劑對水體環(huán)境的改善效果更好，而復(fù)合生物營養(yǎng)劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中對養(yǎng)殖動物的增產(chǎn)效果有待研究。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

Effects of compound bio-nutrient on water environment

ZENG Dong1,2, WU Haiyan1#, NI Xueqin1,2*, XIE Yongbin1, OU Xingping1, CUI Lan1
(1.Research Center of Animal Micro-Ecological, College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Ya’an, Sichuan 625014, China; 2.Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province, Ya’an, Sichuan 625014, China)

Water tank experiments were conducted to evaluate the effects of compound bio-nutrient (CB) combination of various nutrient ratios on water environment.In this study, group CK was the blank control group, group A, B and C were CB combinations of organic nutrients, inorganic salts and micronutrients, with the proportion of 16∶78∶6, 32∶62∶6 and 48∶44∶6, respectively.Results showed that dissolved oxygen (DO) concentration in group C had a significant decline, harmful substances content was the highest in group A, in which ammonia nitrogen (NH3–N) level was significantly higher than that in group CK and group B, but there was no significantly difference between group C, and its nitrite (NO2–N) content was increased remarkably compared with other groups.CB gave a great increase to the content of total nitrogen (TN) and total phosphorus (TP), especially in group A and B.A sharp increase of Bacillus counts and a significant decline of Beromonas counts were recorded in all groups treated with CB.In addition, there were an obvious improvement in the abundance and diversity of plankton in all treatments, especially in group B.The results from RDA analysis revealed that TN and TP were the major environmental factor affecting prokaryotes communities, while DO and NH3–N taken effect to eukaryotes communities.In general, the 32∶62∶6 combination of CB in organic nutrients, inorganic salts and micronutrients had good effects on water environmental improvement.

S963.9

：A

：1007-1032(2017)01-0058-06

??志輝.魚池施肥的理論和實踐[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報，2000，15(1)：1–9.

10.3969/j.issn.1000–9957.2000.01.001.

2016–07–16

2016–10–31

四川省科學(xué)技術(shù)廳科技支撐項目(2013NZ0042)

曾東(1961—)，男，四川丹棱人，教授，主要從事動物微生態(tài)研究，zend@sicau.edu.cn；#并列第1作者，吳海燕(1991—)，女，廣東高州人，碩士研究生，主要從事動物微生態(tài)研究，petrel90@163.com；*通信作者，倪學(xué)勤，教授，主要從事動物微生態(tài)研究，xueqinni@foxmail.com