中空纖維三相液相微萃取-薄層色譜分離同步熒光法測定醬油中的色胺含量

木尼熱·阿布都艾尼，吐爾洪·買買提，博塔·拜合提汗，陳 露

(新疆大學 化學化工學院 石油天然氣重點實驗室， 新疆 烏魯木齊 830046)

中空纖維三相液相微萃取-薄層色譜分離同步熒光法測定醬油中的色胺含量

木尼熱·阿布都艾尼，吐爾洪·買買提*，博塔·拜合提汗，陳 露

(新疆大學 化學化工學院 石油天然氣重點實驗室， 新疆 烏魯木齊 830046)

以三相中空纖維液相微萃取(HF-LPME)作為樣品前處理方法，結(jié)合薄層色譜分離，同步熒光光譜法測定醬油中色胺的含量。通過單因素實驗確立的萃取最優(yōu)條件為：樣品溶液pH值為12.0，正辛醇為萃取溶劑，0.1 mol/L的HCl為接受相，攪拌速度為590 r/min，萃取時間為60 min；取20 μL接受相進行TLC分析，樣品點用異丙醇溶解后離心分離；采用同步熒光在λem=350.4 nm處進行定量分析。在最佳萃取條件下，方法的線性范圍為0.32～50 mg/L(r>0.978 0)，檢出限(S/N=3)為0.32 mg/L。醬油樣品的加標回收率為87.5%～107.7%，相對標準偏差(RSD)不大于6.6%。該方法操作簡單、綠色高效、靈敏度高，可用于醬油中色胺的快速準確測定。

中空纖維三相液相微萃??；薄層色譜；色胺；醬油；熒光光度法

色胺(吲哚-3-乙胺)是一種吡咯環(huán)C3有親電取代基的低分子量(160.2 g·mol-10)吲哚衍生物[1]。它是氨基酸在氨基酸脫羧酶的作用下，脫去羧基而生成[2]的生物胺[3-5]。微量存在于哺乳動物大腦皮層，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道起神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)制的作用。醬油是傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，是我國以及亞洲人民飲食中重要的調(diào)味品，其安全性與人類健康密切相關。醬油在長期發(fā)酵過程中很容易產(chǎn)生生物胺，導致醬油潛在的不安全性。GB/T 5009.208-2008標準[6]中指出了醬油等調(diào)味品中色胺的限量范圍(3 μg/kg)，因人體攝入含量超標時會引起皮疹、偏頭痛、高血壓和低血壓等癥狀引起了全世界的關注。因此，建立醬油中色胺含量的簡單、快速、高靈敏的分析方法具有重要意義。

色胺常用的分析方法有高效液相色譜法[4-6]、HPLC-MS/MS[7]、膠束液相色譜法[8]和HPLC-DAD[9]等。中空纖維液相微萃取(HF-LPME)[10-11]是一種新型樣品前處理技術，集萃取、富集、濃縮于一體，具有富集倍數(shù)高、樣品凈化能力強、有機溶劑消耗少、快速、靈敏等優(yōu)點，且一次性使用聚丙烯中空纖維還可避免萃取中的交叉污染，已被廣泛應用于食品[12-13]、環(huán)境[14]和醫(yī)學等領域。中空纖維液相微萃取主要有兩相液液微萃取和三相液液微萃取兩種模式[15]，其中三相模式經(jīng)歷了兩次萃取與富集，給體相中的目標分析物首先被萃取到中空纖維壁孔中的有機相，再被反萃取到中空纖維空腔內(nèi)的接收相。

薄層色譜(TLC)是一種傳統(tǒng)的分離能力強、斑點集中、顯色方便、時間短、易普及的分離分析方法。熒光分光光度法是靈敏度高、選擇性強、使用簡單、應用廣泛的分析方法。液相微萃取可產(chǎn)生微升級萃取液，且TLC也需同等級別體積的樣品，將兩者聯(lián)用無需濃縮或稀釋步驟，無需專業(yè)人員操作，且方法快速、廉價、試樣量小、綠色安全。本文通過將中空纖維三相液相微萃取和薄層色譜法聯(lián)用[16-17]，建立了一種測定醬油中色胺含量的熒光分光光度方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

970CRT熒光分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);Accurel Q 3/2聚丙烯中空纖維(Membrana GmbH，Wuppertal，德國；壁厚200 μm，孔徑0.2 μm，內(nèi)徑600 μm)。KQ5200B 超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);UV-1800紫外可見分光光度計(日本島津公司);1810-B 型石英自動雙重純水蒸餾器(上海市中晨數(shù)字技術設備有限公司);pH 211型酸度計(HANNA instruments)，HC-2062型高速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司);磁力攪拌器(法國，IKA color squid)。

色胺(百靈威科技有限公司);HCl，NaOH(分析純，杭州蕭山化學試劑廠);正辛醇(分析純，F(xiàn)isher公司);氯化鈉、乙醇、異丙醇、正丁醇、甲醇、丙酮、二氯甲烷(分析純，國藥集團化學試劑有限公司);薄層色譜板；二次蒸餾水(自制)。

圖1 中空纖維液相微萃取裝置示意圖Fig.1 The equipment used in hollow fiber liquid phase microextraction

圖2 色胺的同步熒光光譜圖Fig.2 Synchronous fluorescence spectra of tryptamine with different concentration tryptamine(a-f):0.5,1.0,2.0,4.0,10.0,20.0 mg/L; λem=350 nm,Δλ=55 nm

圖3 樣品溶液的pH值對色胺接收相熒光強度的影響Fig.3 Effect of pH value of sample solution on fluorescence intensity of tryptamine

1.2 中空纖維液相微萃取

準確量取6 mL醬油樣品置于圖1所示的樣品瓶中，加入3.4 mL 1 mol/L的NaOH溶液，調(diào)至pH 12.0。將中空纖維切成8.0 cm長的小段，放在丙酮中超聲10 min以去除表面雜質(zhì)，取出，用N2吹干。在正辛醇中浸泡5 min，使纖維孔壁充滿正辛醇，取出，向中空纖維管內(nèi)定量注入一定濃度的HCl溶液作為接受相，再將中空纖維迅速浸入樣品溶液中，兩端密封，開啟磁力攪拌器攪拌60 min。萃取結(jié)束后，取20 μL中空纖維管內(nèi)的接受相進行TLC分離，同體積的色胺標準溶液對比點樣，以二氯甲烷-甲醇-氨水(90∶9∶1)進行色譜分離，將色胺點從薄層板上刮下，用一定有機溶劑溶解、超聲、離心，上清液用熒光分光光度計在200～555 nm范圍內(nèi)以Δλ=55 nm進行同步掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 TLC分離及熒光檢測條件的確定

2.1.1 同步熒光檢測同步熒光分析法和常規(guī)熒光分析法相比，具有簡化譜圖，減少光譜重疊，提高選擇性和靈敏度，以及減少光散射干擾等優(yōu)點。本文采用恒波長同步熒光法，設Δλ分別為35，45，55，65 nm，在λex=200～500 nm范圍進行色胺的熒光發(fā)射光譜掃描，結(jié)果顯示Δλ=55 nm時靈敏度最高，峰形尖銳(圖2)，因此選擇Δλ=55 nm。而且在0.5～20 mg/L以350.4 nm的熒光強度梯度增大，因此，本實驗選擇最佳檢測波長為350.4 nm。2.1.2 TLC分離條件的確定考察了正辛醇、乙醇、異丙醇、正丁醇和甲醇5種有機溶劑對洗脫薄層色譜板上的色胺及測定熒光的影響。用30 mg/L色胺NaOH溶液進行萃取后，取出20 μL接受相用HCl溶液點樣進行TLC色譜分離，將斑點收集用有機溶劑洗脫測定熒光強度，用空白斑點進行對比。測得正辛醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、甲醇色胺斑點和空白斑點的熒光強度差值分別為28.083，115.081，143.438，125.591，96.678。因此實驗選擇異丙醇為最優(yōu)溶劑。

2.2 HF-LPME條件的優(yōu)化

2.2.1 分配系數(shù)的測定分配系數(shù)(Ka/d)是反映化合物在水相和有機相之間轉(zhuǎn)移能力的重要參數(shù)。本文考察了色胺在兩相間的分配，首先用等體積的正辛醇萃取30 mg/L的色胺NaOH溶液(pH 12.0)，萃取后，取有機層和NaOH供體相，在λmax=280.0 nm處測定吸光度。然后在有機層中加入等體積的HCl(0.1 mol/L)反萃取，有機層和HCl接受相在λmax=280.0 nm處測定吸光度。根據(jù)分配系數(shù)的定義Ka/d=Korg/d×Ka/org，式中Ka/d為分配系數(shù)，Korg/d指萃取達平衡時分析物在有機相的濃度與分析物在樣品中濃度的比值，Ka/org指萃取達平衡時分析物在接受相中的濃度與分析物在有機相中濃度的比值。由計算可知，Korg/d=19.12，Ka/org=376.86，分配系數(shù)為7 205.56，Korg/d較小說明色胺在有機相中的溶解度較小，但Ka/org相當大，說明色胺在接受相中的溶解度很大，其在接受相具有很好的分配，理論推測該體系能夠用于色胺的萃取富集。

2.2.2 萃取溶劑的選擇在HF-LPME中，萃取溶劑應滿足以下條件：①難溶于水；②使待測物在樣品溶液和受體溶液兩相的分配系數(shù)K值較大；③與萃取纖維有良好的親和性，從而使萃取溶劑充滿纖維孔。本實驗考察了甲苯、正丁醇、二氯甲烷和正辛醇對色胺的萃取效率。實驗結(jié)果顯示，甲苯和二氯甲烷對色胺的溶解性不好，正辛醇對色胺的萃取效率高于正丁醇，故本實驗選擇正辛醇為萃取溶劑。

2.2.3 樣品pH值的影響考察了樣品pH值在9.0～13.0范圍內(nèi)對醬油中色胺萃取效率的影響(圖3)。結(jié)果表明，隨著pH值的增加，熒光強度逐漸增大，這是由于色胺的pKa值為7.6，溶液pH值的增大可使色胺在樣品中以分子形式存在，降低了其在水中的溶解度，增加了兩相中的分配系數(shù)，從而提高了有機相正辛醇對樣品中色胺的萃取效率[18]。實驗結(jié)果顯示，pH值為12時熒光強度達到最大值，萃取效果最好。繼續(xù)增大pH值，萃取效率反而降低，因此實驗選擇最佳pH值為12。

2.2.4 接受相pH值的影響在萃取樣品中色胺濃度為30 mg/L，樣品pH值為12，正辛醇作為有機相，萃取時間為60 min條件下，考察了接受相HCl溶液濃度為0.01，0.05，0.1，0.5 mol/L(對應pH值分別為2.0，1.3，1.0，0.3)時對醬油中色胺萃取效率的影響。結(jié)果表明，當接受相HCl溶液濃度為0.1 mol/L時，色胺的萃取效率最高。因此，實驗選擇接受相HCl溶液的最佳濃度為0.1 mol/L。

2.2.5 攪拌速率的影響在HF-LPME中，攪拌樣品溶液使纖維外側(cè)的樣品溶液不斷更新，可縮短至萃取平衡所需的時間，從而提高萃取效率。本實驗考察了不同攪拌速率(200，400，430，460，490，590 r/min)對萃取效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適當提高攪拌速率可以明顯提高萃取效率。但攪拌速率過快時，溶液中會產(chǎn)生氣泡附著在中空纖維膜上阻礙傳質(zhì)過程，還可能會加快有機相的擴散損失。故選擇最佳磁力攪拌速率為590 r/min[19]。

2.2.6 萃取時間的影響考察了萃取時間(20，40，60，80，100 min)對萃取效率的影響。結(jié)果表明，萃取時間在0～60 min之間時，色胺的萃取效率隨萃取時間的延長而增大；60 min后繼續(xù)延長萃取時間將導致有機膜的不穩(wěn)定性，從而導致萃取溶液的損失及萃取效率的降低，故選擇萃取時間為60 min。

2.2.7 鹽加入量的影響考察了樣品溶液中添加不同質(zhì)量NaCl對色胺萃取效果的影響。結(jié)果顯示，在NaCl加入量分別為0，0.5，1.0，2.0 g時，色胺的熒光強度分別為331.48，327.329，254.403，207.525。表明在醬油生產(chǎn)過程時已加入了食用鹽，此時樣品本身的粘度較大，繼續(xù)外加NaCl反而導致萃取效率下降。這是由于NaCl的加入導致樣品溶液的黏度增大，使得色胺與鹽離子之間的靜電作用力增強，從而導致其傳質(zhì)能力降低，并最終導致萃取效率降低，因此本實驗不加入NaCl。

2.3 線性范圍、檢出限與富集倍數(shù)

2.3.1 方法的線性范圍與檢出限準確吸取色胺標準儲備液用超純水稀釋成濃度范圍為0.32～50 mg/L的系列標準溶液，在最優(yōu)條件下對醬油樣品進行梯度加標三相微萃取，并聯(lián)用薄層色譜法，扣除背景噪音后繪制標準曲線。結(jié)果顯示，色胺在0.32～50 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性(圖2插圖)，其線性方程為y=7.053x- 8.677，相關系數(shù)為0.978 0；檢出限(S/N=3)為0.32 mg/L。

2.3.2 富集倍數(shù)富集倍數(shù)(EF)為萃取后接受相中分析物的濃度與萃取前樣品中分析物的起始濃度之比。選擇3 mg/L色胺溶液(pH 12.0)進行EF的考察。在最優(yōu)條件下平行測定3次，得到EF為87.56，表明在本實驗的優(yōu)化條件下，中空纖維三相微萃取對于醬油中的色胺具有良好的富集能力。

2.4 醬油樣品含量及加標回收率的測定

為驗證方法的可靠性，選取2種市售袋裝醬油(七一醬園和笑廚)，使用三相微萃取-聯(lián)用薄層色譜法進行含量測定，每1樣品平行測定3次，測得2種樣品中色胺的平均濃度分別4.45 mg/L和4.62 mg/L。

采用笑廚瓶裝醬油進行加標回收實驗以驗證方法的準確度。加標濃度分別為10，30，50 mg/L，每個濃度在最優(yōu)的萃取條件下平行測定3次，測得回收率分別為87.5%,107.7%和94.8%，相對標準偏差(RSD)分別為2.1%，5.5%和0.57% 。表明該法具有較高的準確度和精確度。

2.5 重復性實驗

配制加標30 mg/L的色胺醬油樣品，用最優(yōu)的萃取條件進行三相中空纖維微萃取，以同樣的條件，進行重復性實驗(n=6)，測定值的RSD為4.6%，表明本方法具有良好的重現(xiàn)性。

2.6 測定方法對比

將本方法測定醬油中色胺含量的結(jié)果與MLC[3]，UPLC-MS/MS[7],HPLC[20]等高端儀器測得的結(jié)果對比(表1)，結(jié)果表明，雖然本方法的回收率、檢出限和RSD不如UPLC-MS/MS好，但與HPLC相當。說明本方法獲得數(shù)據(jù)不僅可與HPLC等高端儀器測得的數(shù)據(jù)相媲美，而且具有操作簡單，無需昂貴儀器，可在普通實驗室[21]實現(xiàn)測試、易于推廣等優(yōu)點。

表1 HF-LPME與其它方法的對比

3 結(jié) 論

本文基于中空纖維三相萃取(HP-LPME)聯(lián)用薄層色譜及同步熒光光譜檢測技術，建立了醬油中色胺含量的分析方法。在最佳萃取條件下，方法的線性范圍為0.32～50 mg/L；檢出限為0.32 mg/L；加標回收率不小于87.5%。本方法操作簡便，有機溶劑用量少，環(huán)境友好，具有突出的樣品凈化能力，且成本低，無需昂貴的儀器，可在普通實驗室進行測定，易于推廣[22]。

致謝:感謝國家自然科學自然基金的資助，感謝再帕爾·阿不力孜教授對本文的修改當中的熱心幫助。

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Synchronous Fluorescence Determination of Tryptamine in Soy Sauce Using Three-phase Hollow Fiber Liquid Phase Microextraction Coupled with Thin-layer Chromatography

Munira·ABUDUANI,Turghun·MUHAMMAD*,Bota·BAHITHAN,CHEN Lu

(College of Chemistry & Chemical Engineering,Key Laboratory of Oil and Gas Fine Chemical,Educational Ministry of China,Xinjiang University,Urumqi 830046,China)

A novel method of hollow fiber liquid phase microextraction(HF-LPME) coupled with thin-layer chromatography was developed for the synchronous spectrofluorimetric determination of tryptamine in soy sauce.The optimum extraction was achieved by adjusting pH value of sample solution to 12.0,using 1-octanol as organic extraction solvent,and 0.1 mol/L HCl as the acceptor phase,and stirring the solution at 590 r/min for 60 min.After extraction,20 μL portion of accepter phase was applied for TLC separation,and the analyte spot was washed off with isopropanol.The quantification analysis of tryptamine was performed with synchronous fluorescence spectra at 350.4 nm.Under the optimum conditions,the calibration curve showed a good linearity in the range of 0.32-50 mg/L(r>0.978 0).The detection limit was 0.32 mg/L.The spiked recoveries from soy sauce samples were in the range of 87.5%- 107.7% with RSDs not more than 6.6%.The proposed method was simple,sensitive,green and accurate,and was suitable for the determination of tryptamine in soy sauce.

hollow fiber three-phase liquid phase microextraction;thin-layer chromatography;tryptamine;soy sauce;fluorophotometry

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.014

2016-07-21；

2016-08-10

國家自然科學基金資助項目(21365020,21565025)

*通訊作者：吐爾洪·買買提，博士，教授，研究方向:分析化學，Tel:0991-8582654,E-mail:turghunm@sina.com

O657.7;O623.732

A

1004-4957(2017)01-0086-05