基于psbAtrnH序列DNA條形碼技術的綿馬貫眾鑒定研究

蔡振嬌吳亞男　許亮　趙容　王冰　康廷國

[摘要] 利用psbAtrnH序列對綿馬貫眾藥材、基原植物進行真?zhèn)舞b定。對實驗樣本的psbAtrnH序列進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增及產物測序，為擴大研究范圍，從GenBank中下載了3屬8種植物的psbAtrnH序列。利用DNAMAN 8.0軟件進行峰圖的查看、拼接及比對，使用MEGA 6.0軟件計算K2P遺傳距離并建立系統聚類樹對其進行分析。結果顯示psbAtrnH序列可對綿馬貫眾、其基原植物粗莖鱗毛蕨，以及同科屬植物進行鑒別，其中綿馬貫眾與其基原植物粗莖鱗毛蕨的psbAtrnH序列完全一致，并可與其他易混藥材及植物明顯區(qū)分。表明psbAtrnH序列對綿馬貫眾藥材、基原植物及其混偽品的鑒別具有可行性，為后續(xù)蕨類藥材的鑒定研究提供一定的科學基礎。

[關鍵詞] psbAtrnH序列； 綿馬貫眾； 粗莖鱗毛蕨

Identification of Dryopteridis Crassirhizomatis Rhizoma

based on psbAtrnH barcode

CAI Zhenjiao1， WU Yanan2， XU Liang1*， ZHAO Rong1， WANG Bing1， KANG Tingguo1

（1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China；

2.Central Hospital of Changtu County， Changtu 112500， China）

[Abstract] To identify origin of the medicinal materials Dryopteridis Crassirhizomatis Rhizoma by using the psbAtrnH sequence， the polymerase chain reaction （PCR） amplification and product sequencing of the experimental samples were performed. In order to expand the scope of the study， the psbAtrnH sequences of 8 genera and 3 species were downloaded from GenBank for analysis. DNAMAN 8.0 software was used to show splicing and comparison results of the peak diagrams with analysis of them， and MEGA 6.0 software was to calculate K2P genetic distances and establish clustering tree adjacent genus. The results showed that by using the psbAtrnH sequence， Dryopteridis Crassirhizomatis Rhizoma， its original plant and other easyconfused medicinal materials and plants can be distinguished with each other obviously， with the psbAtrnH sequence of Dryopteridis Crassirhizomatis Rhizoma completely consistent with that of its original plant. Consequently， it is revealed that it′s feasible to identify Dryopteridis Crassirhizomatis Rhizoma and its original plant， and separate from its adulterants by means of the psbAtrnH sequence， which can provide more scientific bases for the further study of the identification of the ferny medicinal herbs.

[Key words] psbAtrnH sequences； Dryopteridis Crassirhizomatis Rhizoma； Dryopteris crassirhizoma

doi：10.4268/cjcmm20162216

綿馬貫眾為鱗毛蕨科植物粗莖鱗毛蕨Dryopteris crassirhizoma Nakai的干燥根莖和葉柄殘基。有清熱解毒，驅蟲的功效，用于蟲積腹痛，瘡瘍。主要分布于東北三省及周邊地區(qū)[14]。市場上流通大量的混偽品[56]，應用傳統鑒別方法存在一定的難度，化學成分鑒別亦有學者進行了研究[711]；考慮DNA分子鑒別技術的準確性、客觀性，故本研究采用DNA分子鑒別技術對其進行研究，結果表明其具有很好的鑒別可行性。

DNA條形碼分子鑒定是根據基因組中一段公認的、相對較短的DNA序列對物種進行鑒定，與傳統的鑒定方法相比，DNA分子標記技術具有特異性強、便捷、準確等特點，已被《中國藥典》2015年版收載，并指出植物類藥材DNA條形碼鑒定以ITS2為主，psbAtrnH 為輔[1213]。劉鋒等[14]應用psbAtrnH序列對鱗毛蕨屬貫眾藥材基原植物進行了研究，其研究內容為鱗毛蕨屬植物，本文在此基礎上擴大研究范圍，對東北分布的鱗毛蕨屬、耳蕨屬及復葉耳蕨屬植物進行了研究，并首次對同一植株的綿馬貫眾藥材、葉片進行了DNA條形碼分子鑒定。本研究應用psbAtrnH序列對綿馬貫眾藥材、基原植物及其混偽品進行鑒定，為準確、便捷的鑒定綿馬貫眾藥材提供重要的分子依據，同時為后續(xù)蕨類藥材的分子鑒定研究提供一定的科學基礎。

1 材料

H/T16MM臺式高速離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）、HHZK 型數顯恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）、MG96G 型PCR 儀（杭州朗基科學儀器有限公司）、EPS600型電泳儀（上海天能科技有限公司）、Tanon4100凝膠圖像處理系統（上海天能科技有限公司）、ABI 3730XL型測序儀（美國Applied Biosystems 公司）。

離心柱型植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）、Taq Master Mix（北京康為世紀）、引物（北京華大基因公司）、Trans5k DNA Marker（北京全式金生物技術有限公司）、瓊脂糖、EB （上海生物工程股份有限公司），其余試劑均為分析純。

樣本來源見表1，包括實驗樣本和下載于GenBank 的序列，共3屬8個物種44個樣本及一外類群樣本，其中鱗毛蕨屬植物4種，耳蕨屬植物3種及復葉耳蕨屬植物1種，對綿馬貫眾的實驗研究包含來源于同一植株的葉片及藥材。實驗樣本保存于遼寧中醫(yī)藥大學藥用植物教研室；下載于GenBank 的序列經相似性搜索法BLAST鑒定與實驗樣本為同一物種或為其近緣種。

2 方法

2.1 DNA 提取、PCR擴增及產物測序 選取硅膠干燥的植物葉片、干燥的藥材粉末約30 mg，使用植物基因組DNA 提取試劑盒進行總DNA的提取，具體步驟按照試劑盒操作說明進行。psbAtrnH 序列擴增正向引物：5′GTTATGCATGAACGTAATGCTC3′，反向引物：5′CGCGCATGGTGGATTCACAATCC3′。PCR 擴增體系為50 μL，含有正反引物各2.0 μL（2.5 μmol·L-1），Taq MasterMix 25 μL，總DNA 4.0 μL（約40 ng），加去RNA 酶水補足至50 μL[15]。擴增程序為94 ℃ 預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min（35個循環(huán)）；72 ℃延伸7 min。PCR擴增產物經純化后進行雙向測序。

2.2 數據處理 測序后所得的序列峰圖可利用DNAMAN 8.0 軟件進行查看、拼接校對，去除低質量的序列及引物區(qū)，以堿基質量不低于20為標準。使用MEGA 6.0（molecular evolutionary genetics analysis）軟件進行分析比對，計算遺傳距離（K2P）并對其他數據進行分析和處理。利用鄰接法（neighborjoining，NJ）構建系統進化樹和相似性搜索法BLAST 進行序列的比對，鑒定分析各樣本[1518]。

3 結果與分析

3.1 psbAtrnH序列物種鑒定分析 3屬8物種36個樣本及一個外類群樣本psbAtrnH序列的瓊脂凝膠電泳檢測的PCR擴增結果見圖1。本研究中，總DNA提取的成功率為100%；psbAtrnH序列對包含外類群在內的37個實驗樣本的PCR擴增成功率為100%；測序成功率及序列獲得率均為100%。對所得峰圖的分析可知，各序列的堿基質量值均>20。

3.2 種內和種間變異 3屬8個物種44個樣本的psbAtrnH序列長度為429～542 bp。應用MEGA 6.0軟件進行多序列的比對，不同物種間的信息位點有41個，堿基變異位點有43個。其中來源于同一植物的粗莖鱗毛蕨干燥葉片與綿馬貫眾藥材的psbAtrnH序列完全一致，且與GenBank下載這一植物的序列相同，其他各植物獲得序列亦與GenBank下載的植物序列相一致；psbAtrnH序列種間遺傳變異（0.002 3～0.066 4）大于綿馬貫眾的種內遺傳變異（0.000 0），見圖2，表2。

3.3 NJ 樹聚類分析 基于psbAtrnH序列構建的NJ系統聚類樹見圖3，結果顯示實驗樣本被聚為兩大支。鱗毛蕨科3屬8個物種44個樣本被聚為一大支，與外類群分開。其中復葉耳蕨屬植物聚為一支，鱗毛蕨屬和耳蕨屬聚為一大支，且兩屬植物分別聚為一小支。鱗毛蕨屬植物中，綿馬貫眾藥材與其基原植物粗莖鱗毛蕨聚為一支，表明該序列對藥材及其基原植物均可進行有效鑒別；同時二者與同屬植物山地鱗毛蕨D. Monticola、東北亞鱗毛蕨D. coreanomontana和歐洲鱗毛蕨D. filixmas較好區(qū)分；東北亞鱗毛蕨D. coreanomontana與歐洲鱗毛蕨D. filixmas聚在一起，表明二者具有較近的親緣關系。同屬不同物種均單聚為一小支，表明psbAtrnH序列對其具有較佳的鑒別能力。

4 討論

參考《中國藥典》[1]2015年版對DNA條形碼分子鑒別的記載，及陳士林[19]《中藥DNA條形碼分子鑒定》一書，本文亦對實驗樣本進行了ITS2序列的研究，選取ITS2序列擴增正向引物ITS2F：5′ATGCGATACTTGGTGTGAAT3′，反向引物ITS3R：5′GACGCTTCTCCAGACTACAAT3′進行研究，在此基礎上對PCR擴增體系和退火溫度等條件進行了篩選，成功進行了PCR擴增反應，表明此對引物并不適用于綿馬貫眾藥材及其基原植物的鑒定研究，進一步證明應用psbAtrnH序列對綿馬貫眾進行鑒別研究具有實際意義。同時，為后續(xù)蕨類植物的DNA條形碼鑒別研究提供一定的科學基礎。

目前市場流通的綿馬貫眾商品來源復雜，藥典收載和非藥典收載種混亂，因此建立有效的中藥綿馬貫眾物種的鑒定方法十分必要，本研究結果分析了DNA 條形碼技術應用于中藥材鑒定中被廣泛關注的問題，證明了psbAtrnH序列作為DNA 條形碼能穩(wěn)定、準確鑒別綿馬貫眾藥材，為保障臨床安全用藥提供了新的技術手段。

[參考文獻]

[1] 中國藥典. 一部[S].2015.

[2] 彭成.中華道地藥材[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2011：2673.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典臨床用藥須知.2010版·中藥飲片卷[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2011：241.

[4] 田敏利，崔旭盛，田清存.中藥綿馬貫眾資源及加工調查與分析[J].中藥與臨床，2015，6（5）：5.

[5] 叢培軍，張宇，宋韶錦，等.綿馬貫眾及其非正品的鑒別[J].時珍國醫(yī)國藥，2004，15（9）：567.

[6] 張秀麗，羅晶.綿馬貫眾的真?zhèn)舞b別[J].時珍國醫(yī)國藥，2005，16（1）：40.

[7] 高增平.綿馬貫眾有效成分的研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2003.

[8] 周小菲.綿馬貫眾的質量控制方法研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2012.

[9] 鄧國彤.綿馬貫眾化學成分研究[D].廣州：廣東藥學院，2015.

[10] 劉釗，安熙強，斯建勇，等.綿馬貫眾的活性成分研究[J].西部醫(yī)學，2011，23（12）：2300.

[11] 崔月曦，劉合剛.貫眾的研究進展[J].中國現代中藥，2014，16（12）：1043.

[12] 陳士林，姚輝，韓建萍，等.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則[J].中國中藥雜志，2013， 38（2）：141.

[13] 陳士林.中國藥典中藥材DNA條形碼標準序列[M].北京：科學出版版社，2015：3.

[14] 劉鋒，蔣研風羊，詹若挺，等.基于psbAtrnH序列的鱗毛蕨屬貫眾藥材基原植物的鑒定研究[J].世界科學技術——中醫(yī)藥現代化，2014，16（7）：1482.

[15] Meyer C P，Paulay G.DNA barcoding：error rates based on comprehensive sampling[J].PLoS Biol，2005，3（12）：e422.

[16] Moritz C，Cieero C.DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots [J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（8）：2923.

[17] Tamura K，Nei M，Kumar S.Prospects for inferring very large phylogeenies by using the neighboorjoining methood [J].Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（30）：11030.

[18] Koichiro Tamura，Glen Stecher，Daniel Peterson，et al.MEGA6：Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0[J].Mol Biol Evol，2013，30（12）：2725.

[19] 陳士林.中藥DNA條形碼分子鑒定[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：14.

[責任編輯 呂冬梅]