多形性先天性白內(nèi)障一家系致病突變篩查*

馬成霞，鄭廣瑛，郝莉莉

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科 鄭州 450052

多形性先天性白內(nèi)障一家系致病突變篩查*

馬成霞，鄭廣瑛，郝莉莉

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科 鄭州 450052

#通信作者，女，1959年4月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：白內(nèi)障，E-mail：zzzgy@zzu.edu.cn

先天性白內(nèi)障；多形性白內(nèi)障；基因突變

先天性白內(nèi)障是兒童常見的致盲性眼病，近1/3有遺傳性，臨床表現(xiàn)為單純眼部異?；蜃鳛橄嚓P(guān)綜合征的表型之一[1]。先天性白內(nèi)障患者給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。確定先天性白內(nèi)障的遺傳方式及致病基因，通過產(chǎn)前診斷實(shí)現(xiàn)徹底預(yù)防，具有重要的意義。作者收集了一個臨床表型為多形性白內(nèi)障的常染色體顯性遺傳家系，應(yīng)用外顯子組結(jié)合目標(biāo)區(qū)域捕獲測序芯片對先證者致病基因進(jìn)行了檢測，對候選致病突變位點(diǎn)進(jìn)行了Sanger測序驗證，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取就診于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科的一個先天性白內(nèi)障家系，通過詳細(xì)詢問病史及眼部和全身體格檢查，繪制家系圖譜，確定遺傳方式。行詳細(xì)的眼部檢查，排除其他眼部疾患，并對患者進(jìn)行眼部數(shù)碼圖像采集。該研究嚴(yán)格遵循赫爾辛基宣言，經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 測序驗證及分析 構(gòu)建目標(biāo)區(qū)域文庫，定制目標(biāo)區(qū)域捕獲芯片。目標(biāo)區(qū)域文庫包括以下候選基因(48個)：CRYAA、CRYAB、CRYβB1、CRYβB2、CRYβB3、CRYβA1、CRYβA4、CRYβA2、CRYGD、CRYGC、CRYGB、CRYGS、GJA3、GJA8、EPHA2、MIP、BFSP2、PITX3、PAX6、MAF、HSF4、FIT、NHS、BFSP1、FOXE3、FYCO1、LIM2、VIM、CHMP4B、UNC45B、TDRD7、AGK、EYA1、ERZ、FTL、GALK1、TMEM114、WFS1、WRN、SLC33A1、KCNJ13、HMX1、ABHD12、JAM3、VSX2、MIR184、TDRD7、GCNT2。文庫中候選基因外顯子覆蓋率98.39%，啟動子區(qū)域覆蓋率92.76%。

采集12名受試者(包括患者8人，非患者4人)外周靜脈血5 mL，EDTA抗凝，提取外周血全基因組DNA。在DNA末端標(biāo)記A，并與Illumina PE接頭-寡核苷酸混合物相連接，連接產(chǎn)物經(jīng)PCR擴(kuò)增、純化，獲得DNA文庫，并對文庫進(jìn)行質(zhì)量檢測。將基因組DNA打斷為250～300 bp的片段，探針雜交,磁珠法富集獲得目標(biāo)基因片段。在Illumina HiSeqTM2000平臺上對目標(biāo)序列進(jìn)行高通量測序，應(yīng)用Illumina Basecalling Software 1.7分析軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。對受試者候選基因外顯子及其鄰近±10 bp內(nèi)含子區(qū)變異進(jìn)行分析，包括點(diǎn)突變、20 bp以內(nèi)的缺失插入突變及外顯子水平拷貝數(shù)異常。篩選出的突變位點(diǎn)經(jīng)Sanger測序驗證以排除假陽性。采用Gene-Tool Lite 1.0軟件，將相關(guān)基因與NCBI網(wǎng)站的人類基因標(biāo)準(zhǔn)序列比對，發(fā)現(xiàn)可疑的突變位點(diǎn)后，用Chromas 1.62軟件讀取測序結(jié)果的峰圖文件，進(jìn)行確認(rèn)或排除。

2 結(jié)果

2.1 家系圖譜與臨床表型 家系4代成員共計39人，其中患者15人(男11人，女4人)。現(xiàn)存家系成員31人，患者11人(男9人，女2人)。家族中無近親結(jié)婚史。該家系具有以下遺傳特點(diǎn)：連續(xù)傳代，每代都有患者；男女患病機(jī)會均等，疾病的遺傳與性別無關(guān)；患者雙親中必有一人發(fā)病，雙親無病時后代無患者。因此該家系的遺傳方式為常染色體顯性遺傳，家系圖譜見圖1，以“*”標(biāo)記采樣受試者。

圖1 家系圖譜

先證者Ⅳ6為20歲男性，右眼視力0.6，左眼視力0.8，均不矯正；裂隙燈檢查見晶狀體核呈白色粉塵狀混濁，周邊皮質(zhì)透明(圖2)，眼部B超、眼壓及散瞳眼底檢查均無明顯異常。家系中患者Ⅳ8自幼視力較差，并呈進(jìn)行性發(fā)展，右眼視力0.1，左眼視力0.2，均不矯正；晶狀體后極部可見花萼樣混濁，皮質(zhì)可見藍(lán)點(diǎn)狀混濁，周邊皮質(zhì)可見楔形混濁(圖3)。家系中Ⅲ5、Ⅳ8為患病成員且表現(xiàn)一致。Ⅲ1、Ⅲ7、Ⅲ13已在外院行白內(nèi)障手術(shù)，Ⅲ1、Ⅲ7原始病歷記錄為晶狀體后囊下混濁，Ⅲ13原始病歷記錄為晶狀體均勻乳白色混濁。因此該家系為多形性白內(nèi)障家系。

2.2 致病基因篩查結(jié)果 測序結(jié)果顯示，先證者Ⅳ6檢測出一個CRYβB2基因無義突變c.463C>T(p.Q155X)，導(dǎo)致終止密碼子提前，蛋白質(zhì)編碼停止。此突變位點(diǎn)經(jīng)Sanger測序驗證排除假陽性。該家系中的患病成員均存在相同位點(diǎn)的突變，而家系中4個非患者未檢測到該突變(圖4)。同時發(fā)現(xiàn)，家系中所有患者該基因的第6外顯子第471個核苷酸存在C/T的單核苷酸多態(tài)性。

圖2 Ⅳ6裂隙燈檢查表現(xiàn)

圖3 Ⅳ8晶狀體檢查

上圖：患者，紅色箭頭示致病突變c.463C>T(p.Q155X)；黑色箭頭示該基因的第6外顯子第471個核苷酸存在C/T的單核苷酸多態(tài)性。下圖：非患者。圖4 家系中CRYβB2基因測序結(jié)果

3 討論

先天性白內(nèi)障表型復(fù)雜多變，且多有交叉重疊，同時又具有顯著的遺傳異質(zhì)性，這為揭示該病的分子遺傳學(xué)機(jī)制增加了障礙。目前已報道的候選基因約有37個，突變位點(diǎn)百余個[2]，包括晶狀體蛋白、膜蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、轉(zhuǎn)錄因子基因等。已報道的與先天性白內(nèi)障相關(guān)的全部基因是用于候選基因篩查的良好資源庫。因此該研究通過檢索人類孟德爾遺傳在線(OMIM)、NCBI、PUBMED等數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建候選基因文庫，應(yīng)用外顯子組結(jié)合目標(biāo)區(qū)域捕獲測序芯片聯(lián)合Sanger測序驗證，篩選先天性白內(nèi)障致病突變。

早期研究單基因遺傳病的方法如連鎖分析有諸多限制因素，如家系患者樣本少、外顯率低和遺傳位點(diǎn)異質(zhì)性等[3],一般適用于有多代遺傳的大家系。近年出現(xiàn)的全基因組外顯子組測序可以避免傳統(tǒng)研究策略對家系的限制，且具有效率高、成本低、耗時短的優(yōu)點(diǎn)，已成為一個較為高效的基因分析策略[4]，能夠精確篩選出致病基因且不受家系大小的限制[5]。

該研究結(jié)果顯示，CRYβB2基因p.Q155X無義突變?yōu)樵摱嘈涡韵忍煨园變?nèi)障家系的致病突變。該突變導(dǎo)致終止密碼子提前出現(xiàn)從而使基因拷貝數(shù)發(fā)生異常[6]，βB2晶狀體蛋白質(zhì)C-端缺失了原有的51個氨基酸而折疊異常，造成晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)異常，引起晶狀體透明性下降，從而導(dǎo)致先天性白內(nèi)障。該突變曾被國內(nèi)外一些學(xué)者[6-9]報道，其可導(dǎo)致8種不同表型的先天性白內(nèi)障，在國人中該突變可導(dǎo)致粉塵狀核性白內(nèi)障及藍(lán)色點(diǎn)狀白內(nèi)障，外國人中可表現(xiàn)為藍(lán)色花冠狀白內(nèi)障、后囊下性白內(nèi)障、板層白內(nèi)障、珊瑚狀白內(nèi)障、束狀白內(nèi)障、粉塵狀白內(nèi)障及全白內(nèi)障。這充分說明CRYβB2基因p.Q155X突變引起的臨床表型具有顯著的臨床異質(zhì)性。

βB2晶狀體蛋白質(zhì)約占晶狀體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的40%，對晶狀體的透明性和屈光度的維持有重要的作用。該蛋白質(zhì)由205個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為23 000，在二級結(jié)構(gòu)上具有4個“Greek-Key”基序，是非常穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)且高度保守，這種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)對維持晶狀體的透明性至關(guān)重要。目前發(fā)現(xiàn)的CRYβB2基因突變包括[2，10-12]p.Q155X、p.A2V、p.D128V、p.W59C、p.W151C、p.S143F、p.R188H、p.V146M、p.I12N、p.G54A、p.V187M，除了p.A2V位于氮末端，影響突變蛋白四級構(gòu)象改變、熱穩(wěn)定性降低，其余突變均位于“Greek-Key”基序，導(dǎo)致蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而影響CRYβB2蛋白的溶解度和穩(wěn)定性。

該研究還發(fā)現(xiàn)了CRYβB2基因第6外顯子第471個核苷酸C/T的單核苷酸多態(tài)性，該單核苷酸多態(tài)性目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道，其在正常人群及先天性白內(nèi)障患者中的分布還需進(jìn)一步探討。

[1]REDDY MA,FRANCIS PJ,BERRY V,et al.Molecular genetic basis of inherited cataract and associated phenotypes[J].Surv Ophthalmol,2004,49(3):300

[2]SANTANA A,WAISWO M.The genetic and molecular basis of congenital cataract[J].Arq Bras Oftalmol,2011,74(2):136

[3]NG SB,BUCKINGHAM KJ,LEE C,et al.Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder[J].Nat Genet,2010,42(1):30

[4]MARDIS ER.A decade's perspective on DNA sequencing technology[J].Nature,2011,470(7333):198

[5]薛康，吳繼紅，任慧，等.視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤低外顯率一家系基因研究[J].中華眼底病雜志，2015，31(6)：553

[6]LEE C,IAFRATE AJ,BROTHMAN AR.Copy number variations and clinical cytogenetic diagnosis of constitutional disorders[J].Nat Genet,2007,39(7 suppl):S48

[7]鞠宏，趙堪興.晶狀體蛋白與先天性白內(nèi)障[J].中華實(shí)驗眼科雜志，2009，27(12):1154

[8]齊艷華，馬蘭茗.晶狀體蛋白βB2基因突變導(dǎo)致常染色體顯性遺傳先天性白內(nèi)障[J].眼科新進(jìn)展，2008,28(9):676

[9]WANG L,LIN H,GU J,et al.Autosomal-dominant cerulean cataract in a Chinese family associated with gene conversion mutation in beta-B2-crystallin[J].Ophthalmic Res,2009,41(3):148

[10]YAO K,LI J,JIN C,et al.Characterization of a novel mutation in the CRYBB2 gene associated with autosomal dominant congenital posterior subcapsular cataract in a Chinese family[J].Mol Vis,2011,17:144

[11]SANTHIYA T,MANISASTRY SM,RAWLLEY D,et al.Mutation analysis of congenital cataracts in Indian families: identification of SNPs and a new causative allele in CRYBB2 gene[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2004,45(10):3599

[12]王冬冬,楊海軍,易敬林，等.先天性白內(nèi)障相關(guān)晶狀體蛋白質(zhì)基因的研究進(jìn)展[J].中華眼科雜志,2016,52(2):141

(2016-05-10收稿 責(zé)任編輯王 曼)

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.025

*河南省高新技術(shù)應(yīng)用項目 201202010