Toll樣受體在大鼠大腦皮層發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)*

靳 玫，劉曉利，唐超智，宿俊杰，崔俊偉，王文晟#

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 河南新鄉(xiāng) 453003 2)河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453007 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院結(jié)核病研究所 河南衛(wèi)輝 453100

Toll樣受體在大鼠大腦皮層發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)*

靳 玫1)，劉曉利2)，唐超智2)，宿俊杰2)，崔俊偉3)，王文晟3)#

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 河南新鄉(xiāng) 453003 2)河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453007 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院結(jié)核病研究所 河南衛(wèi)輝 453100

#通信作者，男，1968年2月生，博士，教授，研究方向：神經(jīng)性疾病，E-mail：2590212765@qq.com

TLR；大腦皮層；大鼠；大腦發(fā)育

目的：觀察Toll樣受體(TLR)在大鼠大腦分化和成熟過(guò)程中表達(dá)的變化。方法：取妊娠16、18 d的胎鼠和新生鼠(n=10)的大腦皮層，用抗體熒光染色檢測(cè)Ki-67 和NeuN陽(yáng)性細(xì)胞百分比，同時(shí)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot法檢測(cè)TLR的表達(dá)。結(jié)果：隨發(fā)育的進(jìn)展，大鼠大腦皮層中 NeuN和Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞百分比逐漸降低(P<0.05)，TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7和TLR9的表達(dá)逐漸升高(P<0.05)，而TLR5、TLR6和TLR8的表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)。結(jié)論：TLR可能參與了神經(jīng)前體細(xì)胞的分化和成熟。

Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)廣泛存在于各種免疫細(xì)胞中，在免疫過(guò)程中起著重要作用。研究[1-4]發(fā)現(xiàn)TLR的表達(dá)并不局限于免疫細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一些細(xì)胞如小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等中也有表達(dá)，參與了多種神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。最近發(fā)現(xiàn)[5-8]它還表達(dá)于神經(jīng)前體細(xì)胞(neural progenitor cell, NPC)中，并且影響NPC的增殖、分化和自我更新。TLR還參與了神經(jīng)回路的發(fā)展，抑制TLR8活性可導(dǎo)致軸突的延長(zhǎng)和減少神經(jīng)元死亡[9]。雖然腦和免疫細(xì)胞都有TLR表達(dá)，但參與的信號(hào)通路并不相同[10-11]。 作者觀察了各個(gè)發(fā)育階段大腦皮層中TLR表達(dá)的變化，探討各TLR在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中的作用，為神經(jīng)細(xì)胞的再生和退化病的治療提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

1.1.2 其他材料 大鼠TLR抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司。Western lightning PLUS-ECL (產(chǎn)品號(hào)203-12291)購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司。PE標(biāo)示的抗Ki-67抗體(產(chǎn)品號(hào)3033880)、Alexa flour 488標(biāo)示的抗NeuN抗體(產(chǎn)品號(hào)2003667)購(gòu)自BD Pharmingen公司?？俁NA提取試劑(產(chǎn)品號(hào)3220145)、Prime ScriptTMRT試劑盒(產(chǎn)品號(hào)BK4002)和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(產(chǎn)品號(hào)AK3801 )購(gòu)自日本TAKARA公司。引物由賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

表1 TLR引物

1.2 大腦皮層單細(xì)胞懸液的制備 取妊娠16、18 d的胎鼠和出生1 d內(nèi)的新生鼠各10只處死，取大腦皮質(zhì)，剖離后剪碎，加入預(yù)熱好的胰酶反復(fù)吹吸幾次，然后轉(zhuǎn)移到裝有胰酶的離心管中反復(fù)吹吸幾次，于37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化10 min，然后加1 mL 含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)液充分混勻以終止消化，室溫下1 500 r/min離心5 min，棄上清，加10 mL完全培養(yǎng)基(神經(jīng)元專用培養(yǎng)基Neurobasal+B27+葡萄糖+青霉素/鏈霉素)混勻，室溫下1 500 r/min離心5 min,將細(xì)胞懸液通過(guò)100目不銹鋼篩網(wǎng),過(guò)濾后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，室溫下1 500 r/min離心5 min，棄上清，用FACS溶液(1×PBS+體積分?jǐn)?shù)0.2%胎牛血清)調(diào)整細(xì)胞濃度為3×107mL-1備用。

1.3 大腦皮層中神經(jīng)元數(shù)量和增殖能力的檢測(cè) 取100 μL(3×106個(gè)細(xì)胞)大腦皮層單細(xì)胞懸液到離心管，加Ki-67和NeuN抗體混合，室溫培養(yǎng)15 min，用3 mL FACS溶液洗1次，加500 μL含福爾馬林的FACS溶液懸浮，用BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，記錄Ki-67和NeuN陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.4 大腦皮層TLR mRNA的檢測(cè) 取妊娠16、18 d和出生1 d內(nèi)的新生鼠各10只處死，取大腦皮層-80 ℃凍存。取凍存樣品直接加入1 mL Trizol,勻漿后加入200 μL氯仿振搖15 s，室溫靜置3 min,4 ℃12 000 r/min離心15 min，取上清，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，室溫12 000 r/min離心2 min，吸出上清液，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗1次后風(fēng)干，加入DEPC水溶解后定量。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s, 4 ℃∞。實(shí)時(shí)熒光定量PCR具體操作方法按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書，在LightCycler R480 System擴(kuò)增儀中進(jìn)行，擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,45個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參。以2-ΔΔCt計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 大腦皮層TLR蛋白的檢測(cè) 取凍存的大腦皮層，加入裂解液裂解細(xì)胞后離心。取上清用Bradford法定量。取20 μg樣品加入Loading buffer煮沸后用SDS-PAGE進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)膜，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST (Tris-HCl 2 mmol/L, NaCl 150 mmol/L, pH 7.5, 0.1%Tween)進(jìn)行膜封閉，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜。第二天用TBST洗膜3次，加入二抗后室溫孵育1 h，洗滌3次，按照Western lightning PLUS-ECL試劑盒說(shuō)明顯色成像。 用Image J測(cè)量圖片中各目的條帶強(qiáng)度，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin條帶強(qiáng)度的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。3組大鼠大腦皮層中NeuN、Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞百分比、TLR mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大腦皮層發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)元數(shù)量和增殖能力的變化 NeuN和Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞百分比測(cè)定結(jié)果見表2。表2顯示，胎鼠大腦皮層中NeuN陽(yáng)性細(xì)胞百分比較高，出生后降低；Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞百分比則隨發(fā)育逐漸降低。

表2 3組大腦皮層中NeuN和Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞百分比的比較 %

2.2 大腦皮層發(fā)育過(guò)程中TLR的表達(dá) 見表3、表4。與妊娠16 d胎鼠相比， 新生鼠大腦皮層中的TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7和TLR9的表達(dá)明顯升高，TLR5、TLR6和TLR8的表達(dá)變化不顯著；TLR蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)相吻合。

表3 大腦皮層發(fā)育過(guò)程中TLR mRNA的表達(dá)

表4 大腦皮層發(fā)育過(guò)程中TLR蛋白的表達(dá)

3 討論

研究[12]已證實(shí)，TLR在大腦中參與了多種神經(jīng)細(xì)胞的功能，所有TLR在小膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中都有表達(dá)，但在其他神經(jīng)細(xì)胞中并非如此。研究各種TLR在大腦皮層中表達(dá)的變化對(duì)于理解其在大腦皮層的作用有重要意義。

在該研究中，作者發(fā)現(xiàn)，隨著胎鼠的發(fā)育，尤其是妊娠18 d，大腦皮層中NeuN陽(yáng)性細(xì)胞百分比較高，但出生后逐漸降低；Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞百分比亦逐漸降低，新生鼠中具有增殖能力的細(xì)胞只有妊娠16 d胎鼠的1/3；說(shuō)明胚胎后期神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生成增多，導(dǎo)致成熟神經(jīng)元在大腦皮質(zhì)中的比例降低。研究結(jié)果提示神經(jīng)元的分化和成熟主要發(fā)生在胚胎早期，早于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。作者觀察到，在大鼠大腦發(fā)育過(guò)程中，皮層中TLR5、TLR6和TLR8的表達(dá)沒有什么變化，說(shuō)明這3種TLR在神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化過(guò)程中作用有限。已有研究[5,13]證實(shí)，TLR2、TLR3和TLR4的活化可抑制NPC的增殖。該研究也觀察到，在大鼠大腦發(fā)育過(guò)程中，皮層中TLR2、TLR3和TLR4的表達(dá)逐漸增高，在新生鼠的表達(dá)明顯高于妊娠16 d的胎鼠，說(shuō)明這3種TLR很可能在成熟神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)揮作用。TLR9可以緩和神經(jīng)再生損傷，它的缺失可加重癲癇發(fā)作時(shí)認(rèn)知能力的下降[14]。雖然有報(bào)道TLR7在小膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)元中有表達(dá)，但在大腦中的作用被局限于病毒細(xì)菌感染和中風(fēng)等過(guò)程中的免疫反應(yīng)[12]。作者雖然觀察到在大鼠大腦發(fā)育過(guò)程中，皮層中TLR1、TLR7和TLR9的表達(dá)也逐漸升高，但其升高的意義還不明確。因此對(duì)于TLR7、TLR9在大腦皮層的功能還有待于進(jìn)一步研究。

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(2016-04-20收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Expressions of Toll-like receptors in development of rat cerebral cortex

JINMei1)，LIUXiaoli2)，TANGChaozhi2)，SUJunjie2)，CUIJunwei3)，WANGWensheng3)

1)DepartmentofNeurology,theThirdAffiliatedHospital,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453003 2)CollegeofLifeSciences,HenanNormalUniversity,Xinxiang,Henan453007 3)TuberculosisResearchInstitute,theFirstAffiliatedHospital,XinxiangMedicalUniversity,Weihui,Henan453100

Toll-like receptor;cerebral cortex;rat;cerebral development

Aim: To observe the changes of Toll-like receptor(TLR) expression in the differentiation and maturation of the rat brain.Methods: Cerebral cortex of fetal rats of 16 and 18 days and neonatal rats(n=10) were collected to detect Ki-67 and NeuN by fluorescent antibody, TLR expression by real-time PCR and Western blot method.Results: With the development of the progress, the percentages of NeuN positive cells and Ki-67 positive cells in the rat cerebral cortex decreased gradually(P<0.05), the expressions of TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR7 and TLR9 increased gradually(P<0.05), while the expressions of TLR5, TLR6 and TLR8 had no significant changes(P>0.05). Conclusion: TLR may be involved in the differentiation and maturation of neural progenitor cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.011

*國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 31170733

R741.02