二甲雙胍聯(lián)合化療藥物對人胃癌AGS細胞的作用*

吳詩文,張自森,劉 謙,王世超,司遠方,趙勝男，夏興洲#

1)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052

二甲雙胍聯(lián)合化療藥物對人胃癌AGS細胞的作用*

吳詩文1),張自森2),劉 謙1),王世超1),司遠方1),趙勝男1)，夏興洲1)#

1)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052

#通信作者，男，1964年9月生，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：胃癌的臨床基礎(chǔ)研究，E-mail:Zhougxia@163.com

二甲雙胍；胃癌；順鉑；阿霉素；紫杉醇

目的：探討二甲雙胍(Met)聯(lián)合化療藥物對人胃癌AGS細胞的影響。方法：應(yīng)用Met及其分別聯(lián)合順鉑(DDP)、阿霉素(ADM)、紫杉醇(PTX)處理人胃癌AGS細胞，應(yīng)用CCK-8、Transwell模型、流式細胞術(shù)檢測細胞增殖、遷移能力、侵襲能力及細胞凋亡。結(jié)果：Met可呈時間-劑量依賴性抑制AGS細胞增殖(P均<0.001)，IC50為10 mmol/L。10 mmol/L Met、2 mg/L的DDP、0.02 mg/L的ADM、0.02 mg/L的PTX單用均可降低AGS細胞的遷移、侵襲能力，促其凋亡(P均<0.05)，Met可協(xié)同3種化療藥物促進AGS細胞凋亡(P<0.05)。結(jié)論：Met有望用于胃癌的輔助化療。

近年來研究[1-4]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍(metformin,Met)能夠抑制多種腫瘤細胞的生長，其抗腫瘤作用得到了廣泛關(guān)注。胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率及病死率均較高，目前氟尿嘧啶類、鉑類聯(lián)合蒽環(huán)類或紫杉醇類仍是胃癌化療的基礎(chǔ)用藥。該研究觀察了Met聯(lián)合化療藥物順鉑(cisplatin,DDP)、阿霉素(doxorubicin,ADM)、紫杉醇(paclitaxel,PTX)對人胃癌AGS細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響，初步探討Met聯(lián)合化療藥物對人胃癌的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌AGS細胞購自上海細胞庫。Met購自Sigma公司，ADM購自輝瑞制藥公司,DDP購自山東齊魯制藥公司，PTX購自FH科鼎有限公司，F(xiàn)-12K培養(yǎng)基購自吉諾生物醫(yī)藥公司，Met、DDP、ADM、PTX用F-12K培養(yǎng)基配成1 g/L的儲存液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。胎牛血?FBS)購自杭州四季青生物公司，胰酶購自碧云天公司，牛血清白蛋白(BSA)購自Solarbio公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)購自Hyclone公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁公司，Transwell小室購自Coming Costor公司，Matrigel基質(zhì)膜購自Corning公司,Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒、PI細胞周期檢測試劑盒、流式細胞儀為BD公司產(chǎn)品。

1.2 實驗分組 AGS細胞用含體積分數(shù)10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的F-12K培養(yǎng)基于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Met單用組：選用不同濃度Met處理細胞；化療藥物單用組：分別應(yīng)用DDP(2 mg/L)、ADM(0.02 mg/L)、PTX(0.02 mg/L)單獨處理細胞；聯(lián)合用藥組：DDP、ADM、PTX分別與Met聯(lián)合處理細胞。DDP、ADM、PTX對AGS細胞的IC50分別為2、0.02和0.02 mg/L。所有實驗均重復(fù)3次。

1.3 觀測指標

1.3.1 細胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期的AGS細胞，調(diào)整細胞密度為1×104mL-1，200 μL/孔接種于96孔板，待細胞貼壁，按1.2 Met單用組處理細胞，Met濃度分別為0.0(空白對照)、5.0、10.0、12.5、15.0、17.5和20.0 mmol/L,每個濃度設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μL CCK-8，37 ℃孵育2 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀測450 nm處的吸光度(A)。增殖抑制率=(對照A-實驗A)/對照A×100%。

1.3.2 細胞遷移能力 AGS細胞饑餓培養(yǎng)24 h后，用含1 g/L BSA的無血清培養(yǎng)基重懸計數(shù)，將200 μL濃度為1×105mL-1細胞懸液種植于Transwell小室(24孔板)，分組處理細胞，下室加500 μL體積分數(shù)10%FBS的培養(yǎng)液。待細胞遷移20 h后，擦去上層細胞，體積分數(shù)40%甲醛固定20 min，1 g/L結(jié)晶紫染色15～20 min。倒置顯微鏡(×200)下隨機取6～8個視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)，計算平均值。

1.3.4 細胞凋亡 細胞分組處理48 h后，用含20 g/L BSA的胰酶消化，2 000 r/min離心5 min，PBS洗滌細胞2次，用1×Binding Buffer液制成1×106mL-1的懸液，取500 μL，加入5 μL AnnexinV-FITC室溫避光孵育15 min，加入5 μL PI室溫避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測，結(jié)果用Novo Express軟件分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。Met對AGS細胞增殖抑制率的影響、Met單用及與化療藥物聯(lián)用對AGS細胞遷移能力、侵襲能力、凋亡影響的比較采用析因設(shè)計的方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Met對AGS細胞增殖的影響 Met對AGS細胞的增殖有抑制作用，且呈時間和劑量依賴性(表1)。Met作用72 h對AGS細胞增殖抑制的IC50為10 mmol/L，故后續(xù)實驗均在此濃度進行。

表1 Met對AGS細胞的增殖抑制率測定結(jié)果(n=3) %

F劑量=517.930，F(xiàn)時間=488.541，F(xiàn)交互=15.930，P均<0.001。

2.2 Met單獨和聯(lián)合化療藥物對AGS細胞遷移能力的影響 Transwell遷移實驗結(jié)果見圖1、表2。由表2可以看出，Met、DDP、ADM、PTX單獨應(yīng)用均可降低AGS細胞的遷移能力，但Met與化療藥物聯(lián)用對AGS細胞遷移能力的影響并無協(xié)同作用。

2.3 Met單獨及聯(lián)合化療藥物對AGS細胞侵襲能力的影響 Transwell侵襲實驗結(jié)果見圖2、表3。從表3可以看出，Met、DDP、ADM、PTX單獨應(yīng)用均可降低AGS細胞的侵襲能力，但Met與化療藥物聯(lián)用對AGS細胞侵襲能力的影響并無協(xié)同作用。

2.4 Met單獨及聯(lián)合化療藥物對AGS細胞凋亡的影響 凋亡結(jié)果見圖3、表4。從表4可以看出，Met、DDP、ADM、PTX單獨應(yīng)用均可增加AGS細胞的總凋亡細胞比例，且Met與DDP、ADM、PTX聯(lián)用時均存在協(xié)同效應(yīng)。

A:空白對照組；B、C、D、E：分別為DDP、ADM、PTX、Met單用組；F、G、H：分別為Met與DDP、ADM、PTX聯(lián)合用藥組。圖1 Met單獨及聯(lián)合化療藥物對AGS細胞遷移能力的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

c(Met)/(mmol·L-1)細胞數(shù)/(個·視野-1)不聯(lián)合化療藥物聯(lián)合DDP聯(lián)合ADM聯(lián)合PTX0148．3±30．4100．3±14．679．3±13．173．3±14．31091．7±17．060．7±7．251．3±8．543．7±8．3

DDP：FMet=18.845,P=0.002，F(xiàn)DDP=12.674，P=0.007，F(xiàn)交互=0.587,P=0.466；ADM：FMet=14.797，P=0.005，F(xiàn)ADM=24.675，P=0.001，F(xiàn)交互=1.696，P=0.229；PTX：FMet=15.064，P=0.005，F(xiàn)PTX=30.577，P=0.001，F(xiàn)交互=1.473，P=0.259。

A:空白對照組；B、C、D、E：分別為DDP、ADM、PTX、Met單用組；F、G、H：分別為Met與DDP、ADM、PTX聯(lián)合用藥組。圖2 Met單獨及聯(lián)合化療藥物對AGS細胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

c(Met)/(mmol·L-1)細胞數(shù)/(個·視野-1)不聯(lián)合化療藥物聯(lián)合DDP聯(lián)合ADM聯(lián)合PTX0105．7±11．070．0±7．067．0±9．556．0±8．91062．0±6．642．7±4．040．7±6．732．3±5．0

DDP：FMet=65.848、FDDP=39.514，P均<0.001，F(xiàn)交互=3.485,P=0.099；ADM：FMet=49.055、FADM=36.040，P均<0.001，F(xiàn)交互=3.008，P=0.121；PTX：FMet=50.625、FPTX=70.278，P均<0.001，F(xiàn)交互=4.467，P=0.068。

上圖從左至右：空白對照組，DDP、ADM、PTX單用組；下圖從左至右：Met單用組，Met與DDP、ADM、PTX聯(lián)合用藥組。圖3 流式細胞術(shù)檢測Met單獨及聯(lián)合化療藥物對AGS細胞凋亡的影響

c(Met)/(mmol·L-1)總凋亡細胞比例/%不聯(lián)合聯(lián)合DDP聯(lián)合ADM聯(lián)合PTX04．4±1．336．3±3．023．1±2．232．7±2．61030．3±3．748．0±2．041．6±1．748．4±2．0

DDP：FMet=151.170、FDDP=261.409，P均<0.001，F(xiàn)交互=21.212，P=0.002；ADM：FMet=260.774、FADM=118.152，P均<0.001，F(xiàn)交互=7.017，P=0.029；PTX：FMet=202.444、FPTX=251.014，P均<0.001，F(xiàn)交互=12.119，P=0.008。

3 討論

Met作為一種2型糖尿病治療的一線和基礎(chǔ)用藥，具有穩(wěn)定的療效及良好的安全性[5-6]。Met是一種腺苷酸活化蛋白激酶激動劑，可調(diào)節(jié)AMPK信號通路[7]。大量研究[8-11]發(fā)現(xiàn)Met能降低癌癥發(fā)生的風(fēng)險，抑制腫瘤細胞的生長，但在不同類型的腫瘤細胞中分子機制可能不同。胃癌是我國常見的惡性腫瘤，化療仍是胃癌的重要治療手段。臨床上抗腫瘤治療中為了達到理想的效果，不得不加大化療藥物的用量，然而在加大藥量的同時必然會加重化療藥物的毒副作用。該研究發(fā)現(xiàn)Met可以有效抑制AGS細胞的增殖，抑制其遷移、侵襲能力，促進其凋亡；Met還可協(xié)同DDP、ADM、PTX促進AGS細胞的凋亡。Met僅在促凋亡作用中呈現(xiàn)出與化療藥物的協(xié)同效應(yīng)，可能是因為Met與DDP、ADM、PTX存在相同的促凋亡機制，同時也提示Met即使對同一類型胃癌細胞的作用機制也不盡相同，對AGS細胞遷移和侵襲的影響與促進凋亡的分子機制不同，而這些機制可能與Met復(fù)雜的作用特性有關(guān)[12-15]。

然而盡管在該實驗中Met顯示了良好的抗癌效力，甚至與3種化療藥物都存在一定程度的協(xié)同作用，但亦有研究[16]顯示在某些癌細胞中Met并不能提高化療藥物的抗癌效力。國內(nèi)研究[17-18]也發(fā)現(xiàn)Met聯(lián)合5-FU對AGS細胞的抑制作用呈協(xié)同效應(yīng)，但在MNK-45細胞系中卻無此作用，甚至有報道[19]顯示Met與DDP存在拮抗作用，Uehara等[20]還發(fā)現(xiàn)Met與DDP聯(lián)用時在缺氧與含氧量正常兩種情況下作用效果不同。這也進一步說明Met與化療藥物聯(lián)用的機制十分復(fù)雜，可能與化療藥物的種類、腫瘤細胞的類型都有關(guān)系，有待進一步研究。

綜上所述，Met聯(lián)合化療藥物可以協(xié)同發(fā)揮促AGS細胞凋亡的作用，但其作用機制尚不十分明確；Met有望成為一種新型的胃癌輔助化療藥物。

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(2016-06-04收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Effect of metformin combined with chemotherapeutic agents on gastric cancer cell line AGS

WUShiwen1),ZHANGZisen2),LIUQian1),WANGShichao1),SIYuanfang1),ZHAOShengnan1),XIAXingzhou1)

1)DepartmentofGastroenterology,theFifthAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofOncology,theFifthAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

metformin;gastric cancer;cisplatin;doxorubicin;paclitaxel

Aim: To investigate the effect of metformin(Met) combined with chemotherapeutic agents on human gastric cancer cell line AGS. Methods: AGS cells were treated with Met alone or in combination of cisplatin(DDP), doxorubicin(ADM) or paclitaxel(PTX).CCK-8, Transwell, and flow cytometry were used to detect cell proliferation, migration, invasion and apoptosis. Results: Met could inhibit cell proliferation in a dose- and time-dependent manner(P<0.001), andIC50was 10 mmol/L. 10 mmol/L Met,2 mg/L DDP,0.02 mg/L ADM,0.02 mg/L PTX separate application could decrease the migration, invasion capabilities and prompt apoptosis of AGS cells(P<0.05), and Met had synergistic effected when being used with DDP, ADM or PTX in cell apoptosis(P<0.05). Conclusion: Met might be used for adjuvant chemotherapy for gastric cancer.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.010

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃項目 201403126

R735.2