嬰兒雙歧桿菌對(duì)ConA誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的影響*

劉 超，郭 琦，鄭鵬遠(yuǎn)，劉 霞，于 泳，唐芙愛，趙治國

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲科 鄭州 450014 3)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052

嬰兒雙歧桿菌對(duì)ConA誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的影響*

劉 超1)，郭 琦2)，鄭鵬遠(yuǎn)3)#，劉 霞1)，于 泳3)，唐芙愛1)，趙治國1)

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲科 鄭州 450014 3)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052

#通信作者，男，1965年2月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：胃腸道感染與免疫，E-mail:medp7123@126.com

嬰兒雙歧桿菌;小鼠;肝纖維化;刀豆蛋白

目的：研究嬰兒雙歧桿菌對(duì)刀豆蛋白A(ConA)誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的作用及其機(jī)制。方法：36只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和嬰兒雙歧桿菌組，每組12只。正常組靜脈注射生理鹽水，模型組和嬰兒雙歧桿菌組靜脈注射12.5 mg/kg ConA溶液，每周1次。每日通過灌胃給予正常組和模型組蒸餾水，嬰兒雙歧桿菌組通過灌胃給予0.5 g/kg嬰兒雙歧桿菌溶液，持續(xù)7周。檢測(cè)小鼠肝臟質(zhì)量指數(shù)，小鼠血清肝功能生化指標(biāo)(ALT、AST、ALB)，透明質(zhì)酸(HA)，Ⅲ型前膠原肽(PC Ⅲ)的水平，以及小鼠肝組織Ⅰ型膠原(ColⅠ)、Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(TIMP)-1、基質(zhì)蛋白金屬酶(MMP)-1、MMP-2、MMP-9、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-10的含量。結(jié)果：嬰兒雙歧桿菌能顯著降低ConA誘導(dǎo)小鼠的肝臟質(zhì)量指數(shù)(P<0.05)，改善血清肝功能生化指標(biāo)(P<0.05)，降低血清HA、PC Ⅲ水平(P<0.05)，降低肝組織中ColⅠ、Col Ⅲ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TNF-α、IL-6含量(P<0.05)，升高小鼠肝組織中MMP-1、IL-10含量(P<0.05)。結(jié)論：嬰兒雙歧桿菌具有明確的抗小鼠肝纖維化作用。

肝纖維化是各種病因?qū)е碌母闻K內(nèi)結(jié)締組織的異常增生，肝纖維化的持續(xù)發(fā)展最終將導(dǎo)致肝硬化的發(fā)生。肝纖維化是一個(gè)可逆的過程，防止肝纖維化的發(fā)生發(fā)展是防治肝硬化的重要措施[1-2]。研究[3-6]表明，益生菌可通過免疫調(diào)節(jié)機(jī)制改善小鼠腸道狀況，也可治療實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝炎、肝硬化等，提示益生菌可能通過免疫調(diào)節(jié)機(jī)制抑制免疫反應(yīng)誘發(fā)的肝纖維化。嬰兒雙歧桿菌是一種重要的益生菌，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗腫瘤、抗感染等生物學(xué)活性，可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體特異性或非特異性免疫反應(yīng)發(fā)揮抗肝纖維化作用[7]。該研究建立刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)誘導(dǎo)的免疫性小鼠肝纖維化模型，研究嬰兒雙歧桿菌抗小鼠肝纖維化的作用，初步明確其作用機(jī)制，為應(yīng)用嬰兒雙歧桿菌治療肝纖維化提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)[8-9]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 4周齡雄性BALB/c小鼠36只，購于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào) SCXK(豫)2010-0002。嬰兒雙歧桿菌粉(山東科興生物制品有限公司)，ConA(美國Sigma公司)，小鼠透明質(zhì)酸(HA)、Ⅲ型前膠原肽(PC Ⅲ)、Ⅰ型膠原(ColⅠ)、Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-10、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(TIMP)-1、基質(zhì)蛋白金屬酶(MMP)-1、MMP-2、MMP-9 ELISA檢測(cè)試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與造模 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為：正常組、模型組、嬰兒雙歧桿菌組，每組12只。于造模首日，正常組靜脈注射生理鹽水，模型組和嬰兒雙歧桿菌組靜脈注射12.5 mg/kg ConA的溶液，此后每周注射1次，連續(xù)7周。于造模首日起，每日給予正常組和模型組蒸餾水灌胃，嬰兒雙歧桿菌組給予嬰兒雙歧桿菌溶液灌胃，劑量0.5 g/kg，每日1次，持續(xù)7周。末次給藥后，各組小鼠禁食不禁水12 h，稱重后摘眼球取血，將收集的全血放置于1.5 mL離心管靜置60 min，4 ℃3 500 r/m離心15 min，取血清保存于-20 ℃冰箱，用于血清指標(biāo)檢測(cè)。取血完畢后脫頸椎處死小鼠，摘取小鼠肝臟組織，生理鹽水沖洗干凈后稱重。每只小鼠取3片肝組織，將其中一片置于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，經(jīng)常規(guī)病理組織學(xué)檢查；另外兩片肝組織經(jīng)液氮冷凍后于-80 ℃低溫冰箱中保存，用于指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 小鼠肝臟質(zhì)量指數(shù) 電子天平稱量小鼠空腹體重及肝臟質(zhì)量，計(jì)算肝臟質(zhì)量與空腹體重比(mg/g)，即肝臟質(zhì)量指數(shù)。

1.4 小鼠血清ALT、AST和ALB水平檢測(cè) 取小鼠血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清ALT、AST、ALB水平。

1.5 小鼠肝纖維化因子及炎癥因子檢測(cè) 取小鼠血清，ELISA法檢測(cè)HA和PC Ⅲ的含量。取肝組織勻漿，ELISA法檢測(cè)ColⅠ、Col Ⅲ、TNF-α、IL-6、IL-10的含量。

1.6 小鼠肝組織細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)因子檢測(cè) 取肝組織勻漿，ELISA法檢測(cè)TIMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-9的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0分析。3組小鼠各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠肝臟病理組織學(xué)表現(xiàn) 正常組小鼠肝組織內(nèi)肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞變性壞死。模型組及嬰兒雙歧桿菌組小鼠肝組織內(nèi)肝細(xì)胞排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，匯管區(qū)結(jié)締組織增生，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞變性壞死。嬰兒雙歧桿菌組小鼠肝組織內(nèi)纖維化程度較模型組減輕。見圖1。

A:正常組；B: 模型組；C:嬰兒雙歧桿菌組。圖1 3組小鼠肝組織HE染色結(jié)果(×200)

2.2 3組小鼠肝臟質(zhì)量指數(shù)和血清ALT、AST、ALB水平的比較 結(jié)果見表1。與正常組相比，模型組小鼠肝臟質(zhì)量指數(shù)顯著升高，血清ALT、AST水平顯著升高，ALB水平顯著降低。與模型組相比，嬰兒雙歧桿菌組小鼠上述指標(biāo)明顯改善。

2.3 3組小鼠肝纖維化因子及炎癥因子水平的比較 結(jié)果見表2、3。與正常組相比，模型組小鼠血清HA、PC Ⅲ及肝組織ColⅠ、Col Ⅲ、TNF-α、IL-6含量升高，IL-10含量降低。與模型組相比，嬰兒雙歧桿菌組小鼠血清HA、PCⅢ濃度降低，肝組織中ColⅠ、Col Ⅲ和TNF-α、IL-6含量降低，IL-10含量升高。

表1 3組小鼠肝臟質(zhì)量指數(shù)和血清ALT、AST和ALB水平的比較

*：與正常組相比,P<0.05；#:與模型組相比，P<0.05。

表2 3組小鼠肝纖維化因子HA、PC Ⅲ、ColⅠ和Col Ⅲ的比較

*：與正常組相比,P<0.05；#:與模型組相比，P<0.05。

表3 3組小鼠炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-10的比較 mg/kg

*：與正常組相比,P<0.05；#:與模型組相比，P<0.05。

2.4 3組小鼠肝組織TIMP-1、MMP-2、MMP-9含量的比較 結(jié)果見表4。與正常組相比，模型組小鼠肝組織TIMP-1、MMP-2、MMP-9含量升高，MMP-1含量降低。與模型組相比，嬰兒雙歧桿菌組小鼠肝臟TIMP-1、MMP-2、MMP-9含量降低，MMP-1含量升高。

表4 3組小鼠肝臟組織TIMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-9含量的比較 mg/kg

*：與正常組相比,P<0.05；#:與模型組相比，P<0.05。

3 討論

在肝纖維化發(fā)展過程中，多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的平衡被打破，各種促肝纖維化因子的合成增加、活性發(fā)生變化，而抗肝纖維化因子的效應(yīng)減弱或受到抑制，細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡而發(fā)生過度沉積，最終導(dǎo)致肝硬化的發(fā)生。MMPs是一組可降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要酶類，而TIMPs則能夠結(jié)合MMPs以降低其表達(dá)，肝損傷發(fā)生后肝組織內(nèi)MMPs減少，TIMPs增加[10]。PCⅢ、ColⅣ、層黏連蛋白、HA與肝纖維化的活動(dòng)程度密切相關(guān)，均可反映肝纖維化因子合成狀況和炎癥活動(dòng)程度。自身免疫反應(yīng)引起的TNF-α和白介素家族的異常表達(dá)是免疫性肝纖維化形成的主要原因之一[11-12]。在免疫功能紊亂的情況下，TNF-α可引起細(xì)胞外基質(zhì)合成和沉積，最終導(dǎo)致肝纖維化形成[13-14]。IL-6可促進(jìn)肝成纖維細(xì)胞增生和膠原合成，并可影響肝臟組織內(nèi)MMPs和TIMPs的合成和降解，從而發(fā)揮促肝纖維化作用[15]。IL-10可下調(diào)MMPs的表達(dá)和抑制TIMPs的合成，通過免疫調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)揮抗纖維化的作用[16]。李延玲等[4]研究發(fā)現(xiàn)，含雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、腸球菌三聯(lián)活菌的益生菌膠囊能抑制肝硬化大鼠肝細(xì)胞凋亡，具有肝臟保護(hù)作用。Zuo等[6]研究發(fā)現(xiàn)，嬰兒雙歧桿菌可調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞型的生物學(xué)功能，通過干預(yù)細(xì)胞免疫而緩解結(jié)腸炎癥狀。

該研究選擇ConA作為誘導(dǎo)劑，建立小鼠自身免疫性肝纖維化動(dòng)物模型，經(jīng)病理證實(shí)模型組和嬰兒雙歧桿菌組小鼠肝纖維化存在。該研究結(jié)果顯示與正常組相比，模型組小鼠肝功能指標(biāo)(肝臟質(zhì)量指數(shù)、ALT、AST、ALB)和肝纖維化指標(biāo)(HA、PC Ⅲ、ColⅠ、Col Ⅲ)含量明顯升高，炎癥因子及細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)因子(TNF-α、IL-6、IL-10、TIMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-1)均明顯異常，而與模型組相比，嬰兒雙歧桿菌組小鼠以上指標(biāo)均有顯著改善，說明嬰兒雙歧桿菌可能通過干預(yù)肝纖維化因子、炎癥因子及細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)因子等指標(biāo)而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

總之，該研究結(jié)果顯示給予肝纖維化小鼠嬰兒雙歧桿菌可能抑制肝纖維化，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)肝臟TNF-α，IL-6和 IL-10表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)小鼠肝纖維化過程中的免疫反應(yīng)有關(guān)。

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(2016-09-11收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

Effect of infant bifidobacteria on liver fibrosis of mice induced by ConA

LIUChao1)，GUOQi2)，ZHENGPengyuan3)，LIUXia1)，YUYong3)，TANGFu′ai1)，ZHAOZhiguo1)

1)DepartmentofGastroenterology,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014DepartmentofUltrasound,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014DepartmentofGastroenterology,theFifthAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

infant bifidobacteria;mouse;liver fibrosis;concanavalin

Aim: To research the preventive effects and mechanism of infant bifidobacteria on liver fibrosis of mice induced by concanavalin A(ConA). Methods: The mice were randomly allocated into three groups: normal group, model group and infant bifidobacteria-treated group，12 in each group. The ConA solution(12.5 mg/kg) was given by intravenous injection to the model group and infant bifidobacteria-treated group once a week, normal group and model group were given normal saline by gavage,and infant bifidobacteria-treated group was given infant bifidobacteria(0.5 g/kg) by gavage once a day. After 7 weeks, liver weight index, liver function, concentrations of HA and PCⅢ in serum, as well as collagen Ⅰ, collagen Ⅲ, MMP-1, MMP-2, MMR-9, TIMP-1,TNF-α, IL-6, IL-10 in liver tissue were determined. Results: Infant bifidobacteria could decrease liver weight index(P<0.05), improve the liver function(P<0.05), decrease the serum concentrations of HA and PC Ⅲ(P<0.05), decrease the contents of collagen Ⅰ, collagen Ⅲ, MMP-2, MMR-9, TIMP-1,TNF-α, IL-6(P<0.05) in mice liver tissue, and increase the contents of MMP-1 and IL-10 in mice liver tissue(P<0.05).Conclusion: Infant bifidobacteria could prevent liver fibrosis of mice induced by ConA.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.004

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 81370494;鄭州市科技領(lǐng)軍人才項(xiàng)目 131PLIRC656

R575