全外顯子組測(cè)序在遺傳性乳腺癌易感基因發(fā)掘中的應(yīng)用

周楠，楊康

全外顯子組測(cè)序在遺傳性乳腺癌易感基因發(fā)掘中的應(yīng)用

周楠1，楊康2△

遺傳易感因素是誘發(fā)乳腺癌的重要原因之一。乳腺癌易感變異根據(jù)個(gè)體發(fā)病率可分為低外顯率、中外顯率和高外顯率3種。傳統(tǒng)方法限制了中外顯率和高外顯率乳腺癌易感基因的發(fā)掘，而全外顯子測(cè)序技術(shù)為乳腺癌易感基因的發(fā)掘提供了快速高效的方法。目前，利用全外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了一些此前未發(fā)現(xiàn)的乳腺癌易感基因，這些易感基因?qū)z傳性乳腺癌發(fā)病的危險(xiǎn)評(píng)估和發(fā)病機(jī)制的研究提供了有益指導(dǎo)。本文對(duì)遺傳性乳腺癌的全外顯子組測(cè)序研究進(jìn)行綜述，對(duì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)過濾策略、統(tǒng)計(jì)意義和關(guān)聯(lián)分析進(jìn)行討論。

乳腺腫瘤；疾病遺傳易感性；序列分析；全外顯子組測(cè)序

遺傳易感因素是誘發(fā)乳腺癌的重要原因之一［1］，遺傳變異相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值常被作為評(píng)估遺傳因素的重要參數(shù)，高外顯率易感基因變異相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值大于4［2］，中外顯率易感基因變異相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值在2～4之間［3］，低外顯率易感基因變異相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值小于2［4］。近年來，全外顯子組測(cè)序技術(shù)得到了飛快發(fā)展，并在遺傳性乳腺癌的研究中得到廣泛應(yīng)用。本文就全外顯子組測(cè)序技術(shù)在遺傳性乳腺癌中的研究進(jìn)行綜述，對(duì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)過濾策略和關(guān)聯(lián)分析進(jìn)行討論。

1 發(fā)掘乳腺癌易感基因的方法

分析乳腺癌易感基因的傳統(tǒng)方法主要有遺傳連鎖分析法和候選基因分析法。乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2是利用遺傳連鎖分析法發(fā)現(xiàn)的［5］，但是之后利用該方法沒有發(fā)現(xiàn)其他乳腺癌易感基因。利用連鎖分析在染色體上的定位經(jīng)常是厘摩（centimorgan,cM）級(jí)別，其中可能包含成百上千個(gè)基因，因此對(duì)于復(fù)雜疾病，連鎖分析只能提供部分參考性意見。利用候選基因分析法發(fā)現(xiàn)了很多BRCA通路中的基因，這些基因被認(rèn)為是乳腺癌易感基因的候選基因［2］。這種方法的局限性在于對(duì)基因的選擇太依賴于已知的乳腺癌信號(hào)通路。

隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，全外顯子組測(cè)序已被廣泛應(yīng)用于遺傳病和癌癥研究中［6］。全外顯子組測(cè)序是指利用高效的序列捕獲技術(shù)，將全基因組范圍內(nèi)的外顯子區(qū)域DNA捕獲、富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因組分析方法［7］。相比全基因組測(cè)序，該方法能夠迅速獲得所有外顯子區(qū)域的遺傳信息，在大幅提升效率的同時(shí)也降低了成本，同時(shí)可在減少數(shù)據(jù)分析量的基礎(chǔ)上有針對(duì)性地得到大部分全基因組測(cè)序所能得到的信息［8］。在過去幾年里，全外顯子組測(cè)序技術(shù)得到飛快發(fā)展，并在遺傳性乳腺癌的研究中得到廣泛應(yīng)用［9］。目前為止，至少有45個(gè)關(guān)于遺傳性乳腺癌的研究應(yīng)用了全外顯子組測(cè)序的方法。

2 乳腺癌易感基因的全外顯子組分析策略

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 為檢測(cè)增加遺傳性乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的罕見變異，研究者通常選用兩種不同的策略。第一種方法是對(duì)患者家族進(jìn)行全外顯子組測(cè)序［10］，通過不同個(gè)體間比較，得到遺傳變異位點(diǎn)，一些變異位點(diǎn)可能位于遺傳性乳腺癌易感基因中，隨后對(duì)候選變異位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。第二種方法是對(duì)一些不具血緣關(guān)系的患者進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，這種方法能發(fā)現(xiàn)高度異質(zhì)性的位點(diǎn)，進(jìn)而為遺傳性乳腺癌的研究提供線索，當(dāng)在不具有血緣關(guān)系的患者個(gè)體中發(fā)現(xiàn)遺傳重疊時(shí)，需通過相關(guān)性分析檢測(cè)遺傳重疊的顯著性。

研究表明：在特定基因中有一個(gè)或一組變異位點(diǎn)，該位點(diǎn)的變異與遺傳性乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)［11-12］。有學(xué)者對(duì)患者家族進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，6%（6/107）的患者家族檢測(cè)出新的遺傳變異位點(diǎn)，94%（101/107）的患者家族沒有發(fā)現(xiàn)與乳腺癌危險(xiǎn)變異存在關(guān)聯(lián)的變異位點(diǎn)［13］。極少有研究利用二代測(cè)序進(jìn)行已知乳腺癌易感基因的遺傳變異篩選，全外顯子組測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)之前，多數(shù)研究?jī)H在患者家族中進(jìn)行乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的遺傳變異篩選，而篩選結(jié)果證明是擬表型［11-12］。因此，多數(shù)借助全外顯子組測(cè)序技術(shù)在患者家族中進(jìn)行的研究均未提及已知乳腺癌易感基因的突變［13］。Cybulski等［14］對(duì)沒有血緣關(guān)系的患者個(gè)體進(jìn)行全外顯子組測(cè)序研究，發(fā)現(xiàn)只有5例患者具有RECQL的截?cái)嗤蛔?。Snape等［15］的研究發(fā)現(xiàn)只有4例患者存在已知的乳腺癌易感基因變異。因此，完善全外顯子組測(cè)序的試驗(yàn)設(shè)計(jì)具有十分重要的意義。

2.2 數(shù)據(jù)過濾策略 利用全外顯子組測(cè)序技術(shù)，每個(gè)個(gè)體一共能得到20 000～30 000個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）和插入/缺失（insertion/deletion,Indel）變異位點(diǎn)［16-17］，因此如何篩選有效變異位點(diǎn)成為難題［18］。遺傳性乳腺癌的全外顯子組測(cè)序研究強(qiáng)調(diào)候選變異是具有潛在致病性且與癌癥相關(guān)的變異位點(diǎn)［19-25］。數(shù)據(jù)過濾策略主要目的是對(duì)不同變異位點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)先級(jí)排序，主要有分離濾波消除變異和分層過濾兩種方法。

分離濾波消除變異基于“被過濾掉的變異是不致病的”這樣一種假設(shè)［18］。基于罕見變異增加患癌風(fēng)險(xiǎn)的假設(shè)，利用最小等位基因頻率進(jìn)行分析是常用的方法。高外顯率乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2在人群中的等位基因頻率為0.125%～0.25%［26］，最小等位基因頻率小于1%；中外顯率乳腺癌易感基因TP53和CHEK2的最小等位基因頻率也均低于1%［27］。因此，最小等位基因頻率小于1%、具有潛在致病性且與癌癥相關(guān)的基因可作為遺傳性乳腺癌易感基因。目前，至少有4項(xiàng)乳腺癌全外顯子組研究采取這種分析方法［19-22］。遺傳性乳腺癌易感基因在普通人群中以較低的等位基因頻率存在，在全外顯子組研究中設(shè)置較低的最小等位基因頻率閾值（＜1%）對(duì)于高效、快速地發(fā)掘遺傳性乳腺癌易感基因更有利［21］。

在個(gè)體20 000～30 000個(gè)遺傳變異中，如何有效地從非風(fēng)險(xiǎn)等位變異中發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)等位變異仍困難重重。為了進(jìn)行有效篩選，基于基因功能進(jìn)行分層過濾是常用的方法。大多數(shù)已知的遺傳性乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)等位基因參與基因組的完整性或者DNA修復(fù)，因此，可重點(diǎn)關(guān)注參與DNA修復(fù)過程相關(guān)基因的有害突變，同時(shí)刪除無義突變，以減少測(cè)試壓力［22］。分層過濾策略雖然可以快速識(shí)別有效變異位點(diǎn)，但它基于已有的基因功能研究，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致疏漏。

2.3 統(tǒng)計(jì)意義和關(guān)聯(lián)分析 在全基因組關(guān)聯(lián)分析中，顯著性閾值為5×10-8；但在全外顯子組測(cè)序分析中，罕見變異的研究仍處于起步階段，顯著性閾值尚不統(tǒng)一［24］。在全外顯子組測(cè)序分析中1個(gè)基因是1個(gè)基本單位，顯著性閾值可設(shè)置為1.7×10-6，該值非常保守，是利用多重檢驗(yàn)Bonferroni校正30 000個(gè)獨(dú)立測(cè)試得到的，目前多個(gè)全外顯子組研究均使用這一顯著性閾值［24-27］。

目前，全外顯子組研究雖然存在一些不足，但是利用這種手段仍可發(fā)現(xiàn)一些罕見的變異位點(diǎn)，然后通過關(guān)聯(lián)分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行初步驗(yàn)證。Cybulski等［14］在波蘭和魁北克人群中發(fā)現(xiàn)了乳腺癌易感基因變異位點(diǎn)，最終確定2個(gè)RECQL基因中的截?cái)嗤蛔兣c遺傳性乳腺癌之間存在顯著關(guān)聯(lián)。樣本量大能提高權(quán)重（power）、降低P值，利于發(fā)現(xiàn)更多遺傳性乳腺癌易感基因。Gracia-Aznarez等［12］發(fā)現(xiàn)FANCM基因發(fā)生無義突變時(shí)和遺傳性乳腺癌之間不存在關(guān)聯(lián)，但Peterlongo等［25］對(duì)8 635例遺傳性乳腺癌患者和6 625例正常人進(jìn)行基因分型分析，提供了足夠的權(quán)重，P值為0.017，證明兩者之間存在關(guān)聯(lián)。

3 展望

許多危險(xiǎn)因素可誘導(dǎo)乳腺癌的發(fā)生，平均每8名婦女中就有1名患乳腺癌［1］。發(fā)現(xiàn)新的乳腺癌易感基因?qū)τ陲L(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、遺傳咨詢和疾病機(jī)制研究有十分重要的意義。對(duì)于那些不是因?yàn)槿橄侔┮赘谢駼RCA1和BRCA2變異而引發(fā)乳腺癌的患者，其發(fā)病原因可能與SNP有關(guān)［16］。因此，挖掘與乳腺癌發(fā)病相關(guān)的SNP位點(diǎn)的全外顯子組測(cè)序方法被廣泛應(yīng)用。目前為止，至少70個(gè)SNP位點(diǎn)與乳腺癌的發(fā)病有關(guān)［20-27］，發(fā)現(xiàn)更多遺傳性乳腺癌易感基因及其變異位點(diǎn)對(duì)于乳腺癌的治療和預(yù)防具有十分重要的意義。在遺傳性乳腺癌的研究中，利用全外顯子組測(cè)序已獲得大量數(shù)據(jù)，為遺傳性乳腺癌的研究提供了豐富的資源。

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（2016-12-26收稿 2017-04-21修回）

（本文編輯 李國(guó)琪）

Whole exome sequencing in the application of hereditary breast cancer susceptibility gene discovery

ZHOU Nan1,YANG Kang2△
1 Department of Radiotherapy,the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Huhehaote 010050,China;2 School of Life Science,Tianjin University△

E-mail:Sunny20160826@163.com

Genetic susceptibility factor is one of the important reasons to induce breast cancer.Breast cancer risk variants are divided into three categories including high,moderate and low penetrances.Traditional BC susceptibility gene discovery approaches limit the search for breast cancer susceptibility genes with high and moderate risk variants.Whole exome sequencing technology provides a quick and efficient method to discover breast cancer susceptibility genes.At present,a number of breast cancer susceptibility genes have been identified by whole exome sequencing method,which provides useful guidance for the risk assessment and pathogenesis of hereditary breast cancer.In this paper,we reviewed the whole exome sequencing technology and discussed the experimental design,data filtering strategy,statistical significance and correlation analysis.

breast neoplasms;genetic predisposition to disease;sequence analysis;whole exome sequencing

R737.9

：A

10.11958/20161587

內(nèi)蒙古青年創(chuàng)新科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015FB051）；天津市自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（16JCQMJC09800）

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院放療科（郵編010050）；2天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

周楠（1986），女，本科，護(hù)師，主要從事腫瘤方向研究

△通訊作者 E-mail:Sunny20160826@163.com