基于金納米顆粒負載的金屬有機骨架材料的癌胚抗原傳感器的研制

白茹燕+張坤蕾+李德蕾+張茜+劉婷知+劉儀+胡蓉+楊云慧

摘 要 以負載Au的金屬有機骨架材料（AuNPs/Cu.TPA）標記CEA抗體（Ab2）為信號探針，通過電還原的方法將氧化石墨烯還原到電極上，研制了一種捕獲CEA抗體（Ab1）的電化學免疫傳感器，并將其應(yīng)用于癌胚抗原（CEA）檢測。所合成的MOFs材料中含有大量Cu2+， 且電化學信號比較穩(wěn)定，因此可以通過檢測MOFs材料中Cu2+的信號實現(xiàn)對CEA的檢測。此信號探針不需要預(yù)處理和酸處理，易負載貴金屬從而固定抗體，大大簡化了檢測步驟并縮短了檢測時間。此傳感器對CEA的檢測靈敏度好，操作簡便。在最優(yōu)實驗條件下，此傳感器的線性范圍為0.1～80 ng/mL，檢出限為0.03 ng/mL，線性相關(guān)系數(shù)為0.9887，可用于真實樣品中CEA的測定。

關(guān)鍵詞 癌胚抗原； 金屬有機骨架材料； 電化學免疫傳感器

1 引 言

腫瘤標記物（Tumor marker）是腫瘤細胞產(chǎn)生的，含量遠高于正常細胞的特異性物質(zhì)。癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen， CEA）是一種參與細胞粘附的糖蛋白，通常是在胎兒發(fā)育過程中產(chǎn)生。1965年，Gold等從結(jié)直腸腺瘤和胎兒腸中首次分離出CEA[1]。在健康成年人血清中，CEA含量通常很低，在正常組織中，CEA主要分布在胃腸道上皮細胞中。在腫瘤組織中，CEA不僅在結(jié)直腸癌中表現(xiàn)出來[2]，而且在其它類型的癌癥，如胃癌[3]，肺癌[4]、乳腺癌[5]、甲狀腺癌[6]等癌癥中也表現(xiàn)出來。因此癌胚抗原成為目前公認的一種腫瘤標志物，它的臨床檢測在評估病變范圍、預(yù)測療效、監(jiān)測復(fù)發(fā)等方面具有較高參考價值[7]， 檢測CEA有助于提高腫瘤患者的診斷率，監(jiān)測腫瘤早期轉(zhuǎn)移，并可為患者根治性手術(shù)后是否進行輔助化療、療效判斷、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等具有一定的指導(dǎo)意義，對患者的病情預(yù)后判斷有著至關(guān)重要的臨床意義[8]。常用的CEA的檢測方法有實時熒光極化免疫測定法（FPIA）[9]、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）[10]、放射免疫測定（RIA）[11]、免疫金標技術(shù)[12]等方法。但是，熒光免疫測定法的應(yīng)用范圍比較窄，儀器成本較高，而酶聯(lián)免疫吸附測定法靈敏度不高，放射免疫分析法自身存在放射污染，免疫金標技術(shù)法操作較復(fù)雜[13]。這些傳統(tǒng)方法需要具有專門技術(shù)的操作人員，限制了這些方法在普通實驗室的應(yīng)用，難以實現(xiàn)快速檢測。電化學免疫傳感器由于具有操作程序簡單、易于集成化、靈敏度高、成本低等優(yōu)點， 已廣泛應(yīng)用于腫瘤標記物的檢測。隨著電化學免疫傳感器的日趨成熟， 現(xiàn)代檢測技術(shù)也將向微型化、集成化的方向發(fā)展[14]。

近年來，性能優(yōu)良的新型金屬有機骨架材料（Metal.organic frameworks，MOFs）成為研究者關(guān)注的熱點[15]。 Cu.MOF由苯環(huán)有機連接體和含Cu2+的金屬羧酸配合物團簇組成，含有四方形配位結(jié)構(gòu)，是一類比表面積大，且具有納米級規(guī)整孔道結(jié)構(gòu)、呈多維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔材料[16]。這種材料的優(yōu)良特性促使其迅速發(fā)展， 并成為材料、化學、環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點，在氫氣儲備、催化反應(yīng)、氣體吸附與分離及電化學傳感器等應(yīng)用領(lǐng)域有著廣闊的研究和應(yīng)用前景[17，18]， 其結(jié)構(gòu)如圖1所示。Cueto等[19]以對苯二甲酸和Cu（NO3）2合成了Cu（tpa）·3（H2O） （Cu.TPA），由于其合成方法與MOF.2[20]相似，所以結(jié)構(gòu)類似于MOF.2（Zn.BDC），是一種多孔四方錐形材料，但其性質(zhì)有異于MOF.2。Cu.TPA表現(xiàn)出更高的表面積，它在氣體分離和存儲和以及催化方面具有較高的應(yīng)用價值[21]。

雖然金屬離子已被用作信號標記物，但制備過程普遍費時，如Gao等[22]利用Cu2 +作為標記物檢測樹狀大分子聚合DNA的電化學信號。本研究表明，Cu.TPA材料中的Cu2+氧化還原峰比較穩(wěn)定，可單獨作為一個信號基團，因此將這種Cu.TPA材料用作信號探針，Cu2+的電化學信號可以在緩沖溶液中很容易地檢測出來。此新型信號探針不同于傳統(tǒng)的探針，它不需要用酸溶解富集進行檢測，因此極大地簡化了檢測步驟。此外，由于金屬納米顆粒可以很容易摻入MOFs中，使得隨后偶聯(lián)抗體的步驟也較簡單穩(wěn)定。鑒于這種信號探針的獨特的性能，用其構(gòu)建新型CEA電化學傳感器對于腫瘤的早期診斷具有重要意義。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Cu（NO3）2·3H2O（天津市風船化學試劑科技有限公司）； 對苯二甲酸（C 8H 6O4，薩恩化學技術(shù)（上海 ）有限公司）； N，N.二甲基甲酰胺（DMF，西隴化工有限公司）； CEA酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒及純化CEA抗體（anti.CEA）購于鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司；牛血清白蛋白（BSA，美國Sigma.Aldrich公司）；氯金酸（HAuCl4，昆明鉑銳金屬材料有限公司）； 冰醋酸（CH3COOH，成都化學試劑廠）； 醋酸鈉（CH3COONa， 麥克林試劑有限公司）； 無水乙醇（成都格雷西亞化學技術(shù)有限公司）；所有試劑均為分析純，所用水為去離子水。

JEM.2100透射電鏡儀（TEM，日本電子株式會社）； S.3000N掃描電子顯微鏡 （SEM， 日本Hitachiscience Systemsltd公司）； DX.2700X射線粉末衍射儀 （丹東方圓儀器有限公司）； CHI660D電化學工作站（上海辰華公司）。實驗中采用三電極體系。

2.2 實驗方法

2.2.1 Cu.TPA材料的合成 參照文獻[21]合成Cu.TPA。將0.5265 g Cu （NO3）2·3H2O和0.724 g對苯二甲酸溶解在43.5 mL N，N.二甲基甲酰胺中，溶液變成藍色；將所得溶液轉(zhuǎn)移到高壓反應(yīng)釜中，于110℃下反應(yīng)36 h，自然冷卻，用無水乙醇洗滌3次，于80℃真空干燥12 h， 即制得Cu.TPA。

2.2.2 金納米顆粒的合成 參照文獻[23]合成金納米顆粒。將 500 μL 1% HAuCl4 加入到50 mL 去離子水中，攪拌加熱至沸騰，快速向沸騰溶液中加入2 mL 1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)攪拌20 min，等到溶液變?yōu)榫萍t色，冷卻至室溫，即可得到金納米顆粒。

2.2.3 AuNPs/Cu.TPA復(fù)合材料的合成 取50 mg Cu.TPA粉末溶于15 mL金納米顆粒溶液中，室溫攪拌12 h，溶液由藍色變?yōu)榈凵?。將反?yīng)產(chǎn)物離心分離，60℃真空干燥6 h。

2.2.4 AuNPs/Cu.TPA復(fù)合材料標記CEA抗體 取2 mg AuNPs/Cu.TPA復(fù)合材料溶于1 mL去離子水中，用0.2 mol/L Na2CO3調(diào)節(jié)溶液至pH 9，取10 μL 1 mg/mL CEA抗體分5次加入（每隔3 min加一次，每次2 μL ）上述溶液中進行標記，然后將溶液在室溫下振搖反應(yīng)2 h ，加入10% BSA 25 μL，繼續(xù)振搖反應(yīng)30 min 以封閉剩余的活性位點。將所得溶液以5000 r/min低溫離心5 min，用PBS溶液洗滌2次，分散在1 mL Eluent 緩沖溶液中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.5 免疫傳感器的制備 將玻碳電極（Φ=3 mm）在金相砂紙上打磨后，用 Al2O3粉末將電極表面拋光，依次用HNO3（1∶1）、無水乙醇、蒸餾水各超聲洗滌電極5 min。晾干后，參照文獻[24] 方法還原氧化石墨烯，即將玻碳電極浸入到含有氧化石墨烯的電解質(zhì)溶液中，通過循環(huán)伏安法，將分散液中的氧化石墨烯直接進行電化學還原并沉積在裸電極表面，電壓掃描范圍為

1.5～1.0 V。在晾干后的沉積有還原石墨烯（rGO）的電極上滴加30 μg/mL CEA抗體10 μL，4℃過夜。將此免疫傳感器用0.01 mol/L PBS溶液滴洗3次，晾干后在37℃下用牛血清白蛋白（1% BSA） 封閉1 h，以封閉電極上的非特異性結(jié)合位點。滴加一定濃度的CEA抗原孵育50 min，沖洗后滴加10 μL AuNPs/Cu.TPA復(fù)合材料標記過的CEA抗體培育50 min，制得免疫傳感器（見圖2）。

2.2.6 檢測方法 將在不同濃度CEA抗原溶液中培育過的免疫傳感器放入10 mL HAc.NaAc緩沖溶液（0.2 mol/L， pH 4.5）中，連接好三電極體系，在0.3～

0.4 V電位范圍內(nèi)采用示差脈沖伏安法（DPV）進行檢測，振幅50 mV， 脈沖時間0.05 s，脈沖周期0.2 s。實驗結(jié)束后， 用0.01 mol/L PBS清洗電極，并置于4 mol/L尿素溶液中攪拌浸泡30 min， 洗脫電極上結(jié)合的抗原，使電極再生。當電極不用時，于4℃保存。

3 結(jié)果與討論

3.1 Cu.TPA材料的表征

3.1.1 Cu.TPA材料的XRD表征 對合成的Cu.TPA材料進行了X射線粉末衍射表征， 并與文獻[18]及XRD數(shù)據(jù)庫所得的Cu.TPA單晶數(shù)據(jù)圖進行對比，如圖3所示。得到的衍射面數(shù)據(jù)分別為（110）， （001）， （020）， （11， （20

1）， （021）， （111）， （130）， （131）。經(jīng)過實驗值計算，證實本實驗所合成的材料Cu.TPA與文獻[18]報道的一致，為MOF材料。

3.1.2 Cu.TPA微觀形貌表征 采用掃描電鏡、透射電鏡表征了Cu.TPA的微觀形貌結(jié)構(gòu)。從圖4可見，Cu.TPA呈均勻的棒狀，長度約為200 nm。

3.1.3 Cu.TPA/AuNPs材料的表征 為了確定AuNPs/Cu.TPA的微觀形貌結(jié)構(gòu)，采用TEM對其形貌進行了表征。從圖5可以清晰看出AuNPs被均勻地負載到 Cu.TPA材料上。

3.2 氧化還原峰電流與掃描速度的關(guān)系

為進一步了解AuNPs/Cu.TPA labeled anti.CEA/CEA/anti.CEA/石墨烯/GCE免疫傳感器的電化學行為，實驗還考察了掃描速度對AuNPs/Cu.TPA labeled anti.CEA/CEA/anti.CEA/石墨烯/GCE的峰電流的影響，當掃描速度在10～100 mV/s 范圍內(nèi)變化時，傳感器在HAc.NaAc緩沖溶液 （0.2 mol/L，pH 4.5）中的循環(huán)伏安行為如圖6所示，峰電流與掃描速度的平方根成正比，說明該電化學反應(yīng)過程受擴散控制，這可能是因為在合成Cu.TPA過程中，Cu的價態(tài)發(fā)生了改變。然而，陰極峰電流較小，說明此電化學過程是不可逆的[25]。

3.3 不同修飾電極界面的交流阻抗行為

交流阻抗常被用于表征電極修飾過程。 圖7為不同修飾電極在5 mmol/L K3Fe（CN） 6/K4Fe（CN） 6溶液中的交流阻抗圖。曲線a為裸玻碳電極的阻抗圖，近似呈直線，說明電子傳遞幾乎沒有阻礙；曲線b為修飾了石墨烯后玻碳電極的阻抗圖，阻抗改變很小。曲線c為固定抗體在修飾了石墨烯的玻碳電極上的阻抗圖，阻抗有所增加（R et=500 Ω），這是由于不導(dǎo)電的抗體阻礙了電子在電極表面的傳遞，說明抗體已固定在電極表面上。曲線d是培育CEA抗原后的電極的交流阻抗圖，與曲線c相比，半圓直徑顯著增大（R et=700 Ω），這是由于抗體和抗原的特異性結(jié)合阻礙了電子的傳遞。曲線e是培育了AuNPs/Cu.TPA labeled anti.CEA之后的電極交流阻抗圖，阻抗值進一步增大（R et=1450 Ω），這說明免疫復(fù)合物對電子的阻礙作用增強。

3.4 實驗條件優(yōu)化

3.4.1 緩沖溶液pH值對傳感器峰電流的影響 溶液的pH值會影響標記材料中Cu的峰電流信號，從而影響免疫傳感器的檢測，實驗考察了pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的HAc.NaAc緩沖溶液對標記抗體材料中Cu的峰電流響應(yīng)的影響。如圖8所示，當pH值從3.0增加到4.5，還原峰電流也隨之增加； pH值繼續(xù)增加，還原峰電流反而減小，在pH 4.5時，免疫傳感器的電流響應(yīng)值最大。故選擇pH 4.5的HAc.NaAc緩沖溶液作為最佳測試底液。

3.4.2 固定抗體的濃度對傳感器峰電流的影響 固定抗體濃度是影響免疫傳感器靈敏度和檢測范圍的重要因素，實驗對固定抗體濃度進行了優(yōu)化，濃度優(yōu)化范圍為10～60 μg/mL，結(jié)果如圖9所示，隨著固定抗體濃度增大，傳感器的響應(yīng)電流逐漸增大，當抗體濃度達到30 μg/mL時，響應(yīng)電流最大，繼續(xù)增大濃度。響應(yīng)電流有所減小。因此選擇30 μg/mL作為最佳固定抗體濃度。

3.4.3 抗原培育時間和標記抗體培育時間對傳感器峰電流的影響 為了考察抗原培育時間對免疫傳感器響應(yīng)電流的影響，采用不同時間培育10 ng/mL CEA抗原， 測定傳感器的響應(yīng)電流值，結(jié)果如圖10a所示， 響應(yīng)電流隨抗原培育時間延長而增大，50 min以后響應(yīng)電流近似平臺，因此選擇50 min作為最佳抗原培育時間。標記抗體培育時間也是影響免疫傳感器的重要因素，將修飾有相同濃度抗原的免疫傳感器在37℃的條件下采用不同時間培育標記抗體，結(jié)果如圖10b所示， 20～50 min，傳感器響應(yīng)電流的絕對值隨著培育時間的延長而逐漸增大； 50～60 min， 電流基本不變，出現(xiàn)平臺，說明此時CEA抗原和AuNPs/Cu.TPA標記的CEA抗體結(jié)合形成了穩(wěn)定的復(fù)合物。因此，最佳標記抗體的培育時間選擇為50 min。

3.5 免疫傳感器的校正曲線 在最佳實驗條件下，獲得了傳感器對不同濃度的CEA響應(yīng)的曲線。從圖11可見，AuNPs/Cu.TPA labeled anti.CEA/CEA/anti.CEA/石墨烯/GCE免疫傳感器的峰值電流隨CEA濃度的增加而增大，峰電流在0.1～80 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.9887，檢出限為0.03 ng/mL， 正常人體內(nèi)CEA含量為0～25 ng/mL， 所以此CEA免疫傳感器可用于真實樣品的檢測。

比較了幾種檢測CEA方法的性能。從表1可知，本研究制備的傳感器具有較高的靈敏度、良好的線性范圍和較低的檢出限。

3.6 免疫傳感器的選擇性

選擇200 ng/mL的丙氨酸（Ala）、C.反應(yīng)蛋白（CRP）和人絨毛促性腺激素（HCG）以及BSA（1%）作為干擾物質(zhì)，與40 ng/mL CEA的響應(yīng)電流作對比，檢測傳感器的抗干擾情況。如圖12所示，在相同條件下，丙氨酸、BSA（1%）、CRP和HCG的濃度遠大于CEA，但所得響應(yīng)電流較小，說明丙氨酸、BSA（1%）、CRP和HCG對CEA的檢測基本不造成干擾，傳感器對CEA具有較高的選擇性。

3.7 回收率的測定

采用標準加入法，對CEA免疫傳感器進行回收測定。在血清樣品中加入3種不同濃度的

CEA抗原，按本方法進行測定，平均回收率為97.5%～102.7%（表2），結(jié)果令人滿意，說明此傳感器可用于實際樣品中CEA含量的測定。

3.8 免疫傳感器的穩(wěn)定性

為了考察免疫傳感器的穩(wěn)定性，將所制備的免疫傳感器檢測一次后置于4℃保存，分別在7、15、30天后再次對相同濃度的CEA抗原進行檢測， 測得的電流I與初始電流I0的比值7天后下降到98%，15天后下降到87%，30天后下降到66%， 表明此傳感器的穩(wěn)定性良好。4 結(jié) 論

采用還原石墨烯作為固定基質(zhì)，研制了一種新型CEA免疫傳感器，并用于血清中CEA的檢測。合成了Cu.TPA/AuNPs復(fù)合材料，此材料中的Cu在一定的電位范圍內(nèi)可以通過DPV直接檢測到，以Cu.TPA/AuNPs復(fù)合納米材料為標記材料，制備了夾心型CEA免疫傳感器。此傳感器具有成本低、靈敏度高，抗干擾能力強，檢出限低等特點。將此傳感器用于測定血清樣品中的CEA，結(jié)果令人滿意。

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Abstract A novel and simple electrochemical immunoassay for carcino.embryonic antigen （CEA） was developed using Au nanoparticles loaded.metal.organic frameworks （AuNPs/Cu.TPA） as signal unit and electrochemical reduction of graphene oxide on the surface of electrode to capture CEA antibody （Ab1）. MOFs contain large amounts of Cu2+ ions， which can be used as stable electrochemical signals to achieve the detection of CEA. This new class of signal probe differs from traditional probe because it does not require pre.treatment and acid treatment， and easy to load noble metal for the immobilization of antibody， which will greatly simplify the detection steps and reduce the detection time. This immunosensor has good sensitivity and ease to operate. Under the optimized experimental conditions， the proposed sensing strategy provides a linear dynamic range from 0.1 ng/mL to 80 ng/mL with a detection limit of 0.03 ng/mL and linear correlation coefficient of 0.9887. The developed CEA immunosensor can be used to detect CEA in real sample.

Keywords Carcino.embryonic antigen； Metal organic framework； Electrochemical immunosensor