卵裂期凍融復(fù)蘇胚胎進一步發(fā)育情況對臨床結(jié)局的影響

惠董娜，任文娟，雷鑫，劉建榮，王懷秀，李弘

(山西省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，太原 030012)

卵裂期凍融復(fù)蘇胚胎進一步發(fā)育情況對臨床結(jié)局的影響

惠董娜，任文娟，雷鑫，劉建榮，王懷秀，李弘*

(山西省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，太原 030012)

目的 探討卵裂期凍融復(fù)蘇胚胎過夜培養(yǎng)后胚胎生長個數(shù)及卵裂球增殖情況對臨床結(jié)局的影響。 方法 回顧性分析我中心268個卵裂期FET周期，根據(jù)過夜培養(yǎng)后復(fù)蘇胚胎的生長個數(shù)分為0個生長組(A1，n=46)、1個生長組(A2，n=48)和2個及以上生長組(A3，n=174)；根據(jù)卵裂球增殖情況分為<8細胞組(B1，n=39)、8～16細胞組(B2，n=57)和含融合細胞組(B3，n=126)；比較各組間的種植率、妊娠率和多胎率。 結(jié)果 A3組妊娠率、種植率(分別為55.17%、34.29%)顯著高于A1組(分別為15.22%、6.67%)、A2組(分別為29.17%、16.00%)(P<0.01)，且A2組妊娠率、種植率顯著高于A1組(P<0.01)，A3組多胎率顯著高于A2組(36.46% vs.7.14%)(P<0.01)，A1組無多胎妊娠；B2組妊娠率顯著高于B1組(52.63% vs.27.59%)(P<0.01)，B2組種植率顯著高于B1組(31.15% vs.10.71%)(P<0.05)，而B2組與B3組妊娠率、種植率均無顯著差異(P>0.05)，三組間多胎率無顯著差異(P>0.05)，但B3組多胎率有所升高。 結(jié)論 卵裂期凍融胚胎經(jīng)過夜培養(yǎng)后，有2個及以上生長的胚胎，且卵裂球發(fā)育到8～16細胞或有融合細胞階段者，能獲得更好的臨床結(jié)局；對移植含2個及以上生長的胚胎，可考慮選擇單胚胎移植，以降低多胎妊娠長方案及拮抗劑方案中HCG日孕酮水平對IVF-ET妊娠結(jié)局的影響。

卵裂期胚胎； 凍胚移植； 過夜培養(yǎng)； 種植率； 臨床妊娠率； 多胎率

(JReprodMed2017，26(1)：19-23)

凍融胚胎移植(FET)作為輔助生殖中一項重要的衍生技術(shù)，可避免卵巢過度刺激綜合征(OHSS)，使患者一次促排卵周期形成的胚胎實現(xiàn)最大限度的利用，有效地提高了臨床累積妊娠率[1]。FET能否取得較好的臨床結(jié)局與解凍復(fù)蘇后的胚胎質(zhì)量密切相關(guān)[2-3]。通過觀察過夜培養(yǎng)后胚胎進一步發(fā)育情況評估胚胎質(zhì)量，為選擇具有高種植潛力和發(fā)育潛能的胚胎提供了一個重要指標[4]，并以此達到改善臨床結(jié)局的目的。本文回顧性分析我中心268個FET周期，依據(jù)凍融復(fù)蘇后移植胚胎生長個數(shù)以及卵裂球增殖情況探討胚胎質(zhì)量對FET臨床結(jié)局的影響。

資料與方法

一、臨床資料

收集2013年6月至2014年12月在本院生殖醫(yī)學(xué)科行全胚冷凍或新鮮周期移植失敗的患者234例，268個周期。女方年齡21～48歲，不孕年限1～20年。

納入標準：卵裂期凍融胚胎移植周期；女方因盆腔輸卵管、排卵障礙等因素不孕，男方少、弱、畸精、無精癥等因素不育，以及免疫因素、原因不明致不孕；內(nèi)膜準備方案均為人工周期。

排除標準：移植單個卵裂期胚胎；女方子宮內(nèi)膜異位癥、宮腔粘連等影響著床的因素。

二、方法

1.冷凍胚胎的選擇：胚胎質(zhì)量評分按我科標準進行評級：Ⅰ級≥8細胞，卵裂球大小均勻，碎片<5%，無空泡，無多核；Ⅱ級≥7細胞，卵裂球大小均勻或大致均勻，碎片10%～20%，無空泡，無多核；Ⅲ級4～7細胞或≥8細胞，卵裂球大小不均勻，碎片≤20%，有少量空泡，無多核；Ⅳ級4～7細胞或≥8細胞，碎片>20%，卵裂球大小不均勻，有多核；Ⅴ級<4細胞或大量碎片，半數(shù)卵裂球為多核。D3選擇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級胚胎進行冷凍。

2.胚胎凍融、培養(yǎng)與移植：按上述標準冷凍保存D3胚胎。胚胎冷凍采用玻璃化法冷凍試劑盒(Kitazato，日本)，操作按說明書進行，每載桿放置2～3枚胚胎，置于最前端，快速放入液氮中保存；于移植前一天下午解凍，根據(jù)患者情況選擇解凍胚胎的數(shù)量，一般2或3枚胚胎，采用玻璃化解凍試劑盒(Kitazato，日本)，具體操作按說明書進行；解凍后胚胎轉(zhuǎn)入含人血清替代品的1026中(Quinn’s， SAGE，美國)，過夜培養(yǎng)17 h，第2天早上觀察胚胎、評級并做輔助孵化，再行移植。解凍后未移植的胚胎，根據(jù)其質(zhì)量決定繼續(xù)凍存或廢棄。

3.內(nèi)膜準備：內(nèi)膜準備方案均采用人工周期。月經(jīng)周期第2～3天行陰道超聲，根據(jù)患者既往內(nèi)膜厚度決定戊酸雌二醇(補佳樂，拜耳，德國)的起始用量及持續(xù)用量，待子宮內(nèi)膜≥8 mm并出現(xiàn)三線征時，加用黃體酮并誘導(dǎo)內(nèi)膜向分泌期轉(zhuǎn)化，3 d后移植。

4.研究分組：(1)根據(jù)過夜培養(yǎng)后，胚胎復(fù)蘇生長情況分為0個生長組(A1，n=46)、1個生長組(A2，n=48)、2個及以上生長組(A3，n=174)；(2)在胚胎生長組中，根據(jù)卵裂球生長情況分為≤8細胞組(B1，n=39)、8～16細胞組(B2，n=57)、含融合細胞(Compaction，CP)組(B3，n=126)。

5.隨訪及確定妊娠：移植后12～14 d檢測血清?-HCG，若血清?-HCG>25 U/L提示妊娠，則繼續(xù)黃體支持；若血清?-HCG<0.5 U/L，則未妊娠，停止黃體支持。移植后30 d超聲檢查見孕囊、胚芽，移植后35 d超聲檢查心管搏動者確定為臨床妊娠，繼續(xù)黃體支持至妊娠10～12周。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般資料

本研究共納入268個卵裂期FET周期。共解凍胚胎632枚，存活胚胎599枚，胚胎存活率94.78%；移植胚胎587枚，種植154枚，種植率26.24%；妊娠117個周期，平均妊娠率43.66%，多胎妊娠36個周期，多胎妊娠率30.77%。

根據(jù)過夜培養(yǎng)后移植胚胎生長個數(shù)分為：0個生長組(A1)；1個生長組(A2)；2個及以上生長組(A3)。三組患者的年齡、不孕年限、原發(fā)不孕比率、ICSI比率以及移植日內(nèi)膜厚度均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；2個及以上生長組(A3)全胚冷凍比例高于0個生長組(A1)及1個生長組(A2)，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

二、過夜培養(yǎng)后胚胎生長情況對臨床結(jié)局的影響

過夜培養(yǎng)后，A1組46個周期，妊娠率15.22%，種植率6.67%，無多胎妊娠；A2組48個周期，妊娠率29.17%，種植率為16.00%，多胎率7.14%；A3組174個周期，妊娠率55.17%，種植率34.29%，多胎率36.46%。三組間解凍個數(shù)、移植個數(shù)及存活率無顯著差異(P>0.05)。A3組妊娠率、種植率顯著高于A1、A2組(P<0.01)，A2組妊娠率、種植率顯著高于A1組(P<0.01)。A3組多胎率顯著高于A2組(P<0.01)，A1組無多胎妊娠(表2)。

組別周期數(shù)年齡(歲)不孕年限(年)原發(fā)不孕比例A1463028±485341±24833/46(7174)A2482868±391382±31040/48(8333)A31742934±449370±314130/174(7471)組別周期數(shù)ICSI比例全胚冷凍比例移植日內(nèi)膜厚度(cm)A1465/46(1087)20/46(4348)093±085A24813/48(2708)22/48(4583)094±090A317439/174(2241)101/174(5805)095±110

組別周期數(shù)解凍數(shù)(枚)移植數(shù)(枚)存活率A146231±047215±037108/113(9557)A248242±065214±035103/108(9537)A3174230±057219±041388/411(9440)組別周期數(shù)妊娠率種植率多胎率A1467/46(1522)?#7/105(667)?#0A24814/48(2917)?16/100(1600)?1/14(714)?A317496/174(5517)131/382(3429)#35/96(3646)

注：與A3組比較，*P<0.01；與A2組比較，#P<0.01

三、卵裂球生長情況對臨床結(jié)局的影響

過夜培養(yǎng)17 h后，根據(jù)卵裂球生長情況分組比較。B1組39個周期，妊娠率27.59%，種植率10.71%、多胎率11.11%；B2組57個周期，妊娠率52.63%，種植率31.15%、多胎率27.59%；B3組126個周期，妊娠率52.94%，種植率36.23%、多胎率37.50%。三組間解凍個數(shù)、移植個數(shù)及存活率無顯著性差異(P>0.05)。B2、B3組種植率顯著高于B1組 (P<0.01)；B2組妊娠率顯著高于B1組(P<0.05)；B3組妊娠率顯著高于B1組(P<0.01)。三組間多胎率比較無顯著差異(P>0.05)，但B3組多胎妊娠率有所升高(表3)。

組別周期數(shù)解凍數(shù)(枚)移植數(shù)(枚)存活率B139231±047215±03786/91(9451)B257242±065214±035127/138(9203)B3126230±057219±041278/290(9586)組別周期數(shù)妊娠率種植率多胎率B1398/29(2759)?#9/84(1071)?Δ1/9(1111)B25730/57(5263)38/122(3115)8/29(2759)B312672/136(5294)100/276(3623)27/72(3750)

注：與B3組比較，*P<0.01；與B2組比較，#P<0.05，ΔP<0.01

討 論

FET因其可避免卵巢過度刺激、減少再次促排卵操作等優(yōu)點成為一些患者臨床治療的選擇方案。有研究表明胚胎質(zhì)量是影響FET臨床結(jié)局的重要因素之一[2-3]。目前對FET周期中胚胎體外培養(yǎng)時間的選擇多在解凍后2～4 h或是經(jīng)過夜培養(yǎng)后，而是否要延長凍融胚胎的體外培養(yǎng)時間，各個中心的標準不同[5-8]，且對凍融胚胎體外培養(yǎng)時間和臨床結(jié)局關(guān)系的認識也不同[6，8]。近來的一些研究顯示，凍融復(fù)蘇的胚胎經(jīng)過夜培養(yǎng)，通過觀察其是否恢復(fù)分裂并有增殖的細胞，可作為評價凍融復(fù)蘇胚胎質(zhì)量的一個指標，從而選擇出具有高發(fā)育潛能的胚胎，以提高臨床妊娠率[4，9-10]。

本研究所納入的FET周期中解凍的胚胎經(jīng)過夜培養(yǎng)后移植，根據(jù)移植時胚胎生長個數(shù)分為0個生長組、1個生長組、2個及以上生長組，各組間患者的年齡、不孕年限、原發(fā)不孕比例以及移植日內(nèi)膜厚度等臨床資料均無統(tǒng)計學(xué)差異，且內(nèi)膜準備方案均采用人工周期，避免了其它影響FET臨床結(jié)局的因素。結(jié)果顯示，移植含2個及以上生長的胚胎組，其妊娠率和種植率顯著高于0個生長組及1個生長組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，且1個生長組的妊娠率及種植率顯著高于0個生長組。說明復(fù)蘇胚胎經(jīng)過夜培養(yǎng)，能夠恢復(fù)分裂生長的胚胎具有更好的發(fā)育潛能，可作為選擇移植胚胎的一個關(guān)鍵指標，且移植含有2個及以上生長個數(shù)的胚胎能獲得更好的臨床結(jié)局。

解凍復(fù)蘇的胚胎經(jīng)過夜培養(yǎng)后進一步生長，具體表現(xiàn)為卵裂球數(shù)目的增加，即細胞的增殖。有研究表明復(fù)蘇4 h已分裂的胚胎其臨床妊娠率和單胚著床率都顯著大于未分裂組[11]，而復(fù)蘇后24 h未有卵裂球分裂生長的胚胎往往表現(xiàn)為染色體異常，僅有20%的胚胎為正常的二倍體[12]，說明復(fù)蘇后胚胎能快速恢復(fù)有絲分裂是其具有良好發(fā)育潛能的一項重要指標。本研究中復(fù)蘇后繼續(xù)生長的8～16細胞組及含CP細胞組的妊娠率、種植率顯著高于<8細胞組胚胎，而8～16細胞組和含CP細胞組的妊娠率及種植率無顯著差別，提示復(fù)蘇胚胎的卵裂球數(shù)目增加大于8細胞或已至融合階段的會有更好的種植率及妊娠率，可能是由于8～16細胞或含CP的胚胎在隨后發(fā)育中更容易形成囊胚，打破發(fā)育阻滯的情況，且發(fā)生細胞融合的胚胎促進了基因調(diào)控由母型調(diào)節(jié)向胚胎型調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)化，對囊胚腔的形成、內(nèi)細胞團及胚層分化發(fā)揮著積極作用，預(yù)示著較好的臨床結(jié)局[13-14]。

多胎妊娠是輔助生殖技術(shù)中最為關(guān)注的問題之一，其所造成的妊娠高風險，以及對圍產(chǎn)兒及新生兒健康等方面的影響， 成為輔助生殖領(lǐng)域亟待解決的問題。為降低多胎妊娠的風險，選擇合適的單胚胎移植成為研究的焦點[15]。有研究表明，與多胎妊娠相關(guān)的因素包括年齡、獲卵數(shù)、可利用胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù)量、移植胚胎質(zhì)量以及冷凍胚胎數(shù)[16]。本文對解凍后復(fù)蘇胚胎質(zhì)量與多胎妊娠的關(guān)系進行分析，結(jié)果顯示含2個及以上生長胚胎組的多胎率顯著高于0個生長組及1個生長組，差異顯著有統(tǒng)計學(xué)意義，而0個生長組無多胎妊娠，提示過夜培養(yǎng)后，有2個及以上生長的胚胎需考慮選擇單胚胎移植以降低多胎妊娠。同時，比較了有卵裂球增殖的胚胎，發(fā)現(xiàn)含CP組多胎率較高，但與<8細胞組及8～16細胞組比較并無顯著差異，可能與樣本量有關(guān)，仍需進一步研究。

綜上所述，胚胎質(zhì)量是影響卵裂期凍融胚胎移植臨床結(jié)局的重要因素。復(fù)蘇胚胎經(jīng)過夜培養(yǎng)，能快速恢復(fù)有絲分裂并有增殖細胞者，預(yù)示有較好的發(fā)育潛能。移植中含有2個及以上生長的胚胎，且卵裂球數(shù)目在8～16細胞或含融合細胞的可獲得更好的臨床結(jié)局。對復(fù)蘇后繼續(xù)生長含有2個及以上生長的胚胎，可考慮選擇單胚胎移植，并充分告知患者，以減少多胎妊娠的風險。

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[編輯：谷炤]

Impact of further development of frozen-thawed embryo on clinical outcome

HUI Dong-na， REN Wen-Juan， LEI Xin， LIU Jian-rong，WANG Huai-xiu，LI Hong*

DepartmentofReproductiveMedicine，ShanxiProvincialPeople’sHospital，Taiyuan030012

Objective： To explore the impact of the number of grown embryos and the blastomere proliferation after overnight culture in frozen-thawed embryos at cleavage stage on the clinical outcome.Methods： A total of 268 frozen-thawed cycles were analyzed retrospectively. According to the number of grown embryos after overnight culture， the cycles were divided into three groups： no grown embryo group (A1，n=46)； one grown embryo group (A2，n=48) and more than two grown embryos group (A3，n=174). According to the proliferation of blastomere， the cycles were divided into three groups： blastomeres<8-cell group (B1，n=39)， blastomeres 8 to 16-cell group (B2，n=57) and blastomeres compacted group (B3，n=126). The implantation rate， pregnancy rate and the multiple pregnancy rate were compared among the groups.Results： The pregnancy rate (55.17%) and implantation rate (34.29%) in group A3 were significantly higher than those in group A1 (15.22%， 6.67% respectively) or group A2 (29.17%， 16.00% respectively) (P<0.01)， and those of group A2 were significantly higher than group A1 (P<0.01).The multiple pregnancy rate in group A3 were significantly higher than that in group A2 (36.46% vs.7.14%，P<0.01). There were no multiple pregnancy in group A1. The pregnancy rate (52.63% vs. 27.59%，P<0.01) and the implantation rate(31.15% vs.10.71%，P<0.05) in group B2 were significantly higher than those in group B1. The pregnancy rate and implantation rate between group B2 and B3 had no significant differences (P>0.05). There was no significant difference in multiple pregnancy rate among group B1， B2， and B3 (P>0.05)， but multiple pregnancy rate was slightly higher in group B3.Conclusions： Frozen-thawed embryos at cleavage stage after overnight culture， which had more than two grown embryos and blastomeres developed to 8 to 16-cell or compaction formed， can obtain better clinical outcomes. Single embryo transfer can be considered for patients who have more than two grown embryos after frozen-thawed to reduce multiple pregnancies.

Cleavage embryo； Frozen-thawed embryo transfer； Overnight culture； Implantation rate； Clinical pregnancy rate； Multiple pregnancy rates

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.01.004

2016-06-16；

2016-07-12

惠董娜，女，山西侯馬人，碩士，檢驗技師.(*