Nucleophosmin及notch1在肺腺癌中的表達及意義

賀兼斌 劉理靜 向志 肖集文 肖海波

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Nucleophosmin及notch1在肺腺癌中的表達及意義

賀兼斌1劉理靜4向志1肖集文2肖海波3

目的 觀察Nucleophosmin蛋白及notch1受體蛋白在肺腺癌組織中的表達并探討其意義。方法 選擇2012，10-2015，06我院確診的肺腺癌患者的腫瘤標本共107例，采用免疫組織化學染色方法檢測Nucleophosmin蛋白和notch1受體蛋白質(zhì)的表達情況。結(jié)果 Nucleophosmin蛋白和Notch1受體蛋白質(zhì)在肺腺癌組織中皆為陽性表達，臨床分期越高，Nucleophosmin蛋白和Notch1受體蛋白質(zhì)的表達越高，同時Nucleophosmin蛋白和Notch1受體蛋白質(zhì)在腫瘤細胞的表達隨分化程度的升高而降低。結(jié)論 Nucleophosmin、Notch1受體蛋白質(zhì)在肺腺癌組織中的高表達可能與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展，侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)，兩者的過表達可能促進肺腺癌的進展，侵襲及轉(zhuǎn)移。

Nucleophosmin；Notch1；肺腺癌；轉(zhuǎn)移

肺癌是危害人類生命的惡性腫瘤之一，中晚期肺癌因轉(zhuǎn)移或瘤體大而無手術(shù)機會，綜合治療的主要手段是化療，但到目前為止，5年生存率仍然很低，不超過15%，治療失敗的主要原因包括化療耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中，許多基因及基因產(chǎn)物參與了腫瘤的進展過程，其中某些基因及基因產(chǎn)物與腫瘤的侵襲，轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，探尋這些基因及基因產(chǎn)物有利于揭示腫瘤的發(fā)病機理，并使其成為腫瘤靶向治療潛在的靶標，有可能為腫瘤的治療開辟新的治療途征。有研究表明Nucleophosmin、Notch1受體與某些腫瘤的生長，侵襲，轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1-2]，但它們與肺腺癌的關(guān)系鮮見報道，本研究收集足夠樣本量的經(jīng)過病理學確診的肺腺癌患者腫瘤組織標本，以免疫組織化學方法檢測腫瘤組織中Nucleophosmin、Notch1受體表達，探討其與肺腺癌發(fā)生，發(fā)展的關(guān)系。

資料與方法

一、一般資料

選擇2012，10-2015，06我院經(jīng)電子支氣管鏡活檢、CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺肺活檢或轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)活檢及外科手術(shù)確診的肺腺癌患者的腫瘤標本共107例。其中男41例，女66例，年齡41-76歲，平均56.7歲，依據(jù)2009年第7版肺癌TNM分期標準，Ⅰ期15例，Ⅱ期34例，Ⅲ期39例，Ⅳ期19例，低分化31例，中分化43例，高分化33例。所有標本均用10%中性甲醛溶液固定并石蠟包埋保存于我院病理標本庫，行4um連續(xù)切片，由2 位有經(jīng)驗的病理專家確診，符合2015年的WHO腫瘤組織學分類標準[3]及2011年IASLC/ATS/ERS肺腺癌新分類標準[4]。

二、主要試劑

一抗小鼠抗人Nucleophosmin單克隆抗體和羊抗人Notch1 多克隆抗體均購自美國Santa Cruz 公司，免疫組織化學檢測試劑盒及DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

三、免疫組織化學檢測

對入選病例的腫瘤組織及癌旁組織標本使用免疫組織化學法檢測Nucleophosmin、Notch1受體蛋白質(zhì)的表達，分析Nucleophosmin、Notch1受體蛋白質(zhì)的表達與腫瘤臨床及病理分期的關(guān)系。免疫組織化學檢測步驟按試劑盒操作說明書嚴格進行，一抗分別為小鼠抗人Nucleophosmin單克隆抗體、羊抗人Notch1 多克隆抗體，抗體稀釋濃度為1 ∶100，陰性對照為用PBS緩沖液代替一抗。結(jié)果判斷：Nucleophosmin蛋白為腫瘤細胞胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒,Notch1受體蛋白質(zhì)為腫瘤細胞細胞質(zhì)內(nèi)及細胞膜上呈棕黃色顆粒，蛋白表達結(jié)果采用全自動圖像分析系統(tǒng)測定平均灰度值表示，平均灰度值越高，蛋白表達越強。

四、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、不同臨床分期患者腫瘤中Nucleophosmin、Notch1受體蛋白質(zhì)的表達

Nucleophosmin蛋白的表達：肺腺癌各臨床分期標本Nucleophosmin皆為陽性表達，隨腫瘤進展，臨床分期越高，Nucleophosmin的表達越高，Ⅰ期與Ⅱ期比較差異無顯著性(P>0.05)，其它各期比較有差異顯著性(P<0.05)，Nucleophosmin蛋白在癌旁組織中表達極低，與腫瘤組織比較有差異顯著性(P<0.05)；Notch1受體蛋白質(zhì)的表達：肺腺癌各臨床分期標本Notch1受體蛋白質(zhì)皆為陽性表達，與Nucleophosmin蛋白的表達類似，隨腫瘤進展，臨床分期越高， Notch1受體蛋白質(zhì)的表達越高，各期比較有差異顯著性(P<0.05)，而癌旁組織中表達極低，與腫瘤組織比較有差異顯著性(P<0.05)，各臨床分期患者腫瘤中Nucleophosmin、Notch1受體蛋白質(zhì)的表達(見表1，圖1)。

表1 不同臨床分期患者腫瘤中Nucleophosmin、 Notch1受體蛋白質(zhì)的表達

二、不同分化程度患者腫瘤中Nucleophosmin、Notch1受體蛋白質(zhì)的表達

圖1 不同臨床分期患者腫瘤中Nucleophosmin蛋白質(zhì)和Notch1受體蛋白質(zhì)的表達(SP×100)

Nucleophosmin在肺腺癌細胞的表達隨分化程度的升高而降低，低分化肺腺癌表達最高，高分化肺腺癌表達最低，各組間比較有差異顯著性(P<0.05)；Notch1受體蛋白質(zhì)的表達與Nucleophosmin表達類似，各組間比較有差異顯著性(P<0.05)，各分化程度患者腫瘤中Nucleophosmin、Notch1受體蛋白質(zhì)的表達(見表2，圖2)。

圖2 不同分化程度患者腫瘤中Nucleophosmin蛋白質(zhì)和Notch1受體蛋白質(zhì)的表達(SP×100)表2 不同分化程度患者腫瘤中Nucleophosmin、 Notch1受體蛋白質(zhì)的表達

分化程度nNucleophosmin灰度值Notch1灰度值低分化31147.02±6.19139.26±5.43中分化4389.77±4.8186.37±4.52高分化3365.14±4.2361.58±4.39

討 論

肺癌是惡性程度較高的腫瘤，它嚴重損害患者的健康和生命，其發(fā)病率和死亡率皆高，是發(fā)病率和死因第一位的惡性腫瘤[5-6]。在上世紀中葉，鱗癌是肺癌的主要組織學亞型，腺癌所占比例極少僅約為5%，但近年來，肺腺癌的發(fā)病率在快速上升[6]。因肺腺癌組織內(nèi)血管豐富，淋巴結(jié)和血行轉(zhuǎn)移早，進展快，導(dǎo)致療效差，預(yù)后不佳，因此，探尋肺腺癌的有效治療方案或?qū)ふ移錆撛诘闹委煱袠司哂兄匾囊饬x。惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展與多種癌基因及基因產(chǎn)物過度表達，以及腫瘤抑制基因失活或基因產(chǎn)物的缺失密切相關(guān)[7-8]，因此, 進一步研究新的基因功能改變與肺癌發(fā)生發(fā)展及其惡性特征的關(guān)系，對進一步揭示肺癌發(fā)生發(fā)展的可能機理、設(shè)計合理的治療藥物抑制肺癌細胞浸潤或增強其對放化療的敏感性及判斷患者預(yù)后和提高我國肺癌的治療水平都具有積極意義。既往有較多研究表明Nucleophosmin、Notch1受體參與了某些腫瘤的生長，侵襲和轉(zhuǎn)移[1-2]，但它們與肺腺癌的關(guān)系鮮見報道，本研究通過檢測Nucleophosmin和Notchl在肺腺癌組織中的表達，試圖初步分析與其與肺腺癌發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

Nucleophosmin是主要的核仁磷酸化蛋白，它參與了rRNA前體加工、RNA裝配及合成、染色體復(fù)制、調(diào)節(jié)抑癌基因p53和p14的活性及作為分子伴侶防止蛋白集聚等病理和生理過程，Nucleophosmin還參與監(jiān)控核仁活性及細胞增殖[9-10]。有研究[11-12]表明Nucleophosmin在多種腫瘤組織中過度表達，具有促進細胞惡性轉(zhuǎn)化、促進癌細胞增殖和抑制凋亡的作用，其高水平表達與惡性腫瘤的進展階段呈正相關(guān)，Nucleophosmin在多種實體腫瘤中存在過度表達，甚至可作為胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和前列腺癌的腫瘤標志物，但其與肺癌的關(guān)系少見報道，未見Nucleophosmin與肺癌發(fā)生發(fā)展及侵襲和轉(zhuǎn)移的研究報道。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Nucleophosmin在肺腺癌中的表達隨患者的臨床分期的升高而增加，除Ⅰ期和Ⅱ期之間比較無顯著性差異外，其它各組比較皆有顯著性差異(P<0.05)，在各分化程度肺腺癌比較，隨分化程度降低，Nucleophosmin在肺腺癌中的表達增加，各組間比較有顯著性差異(P<0.05)，不同臨床分期和不同分化程度的肺腺癌組織中Nucleophosmin蛋白的表達均存在差異，且隨著臨床分期的升高和細胞分化程度的降低，染色程度不斷加深，Nucleophosmin蛋白表達的灰度值升高，這可能與腫瘤細胞后期的生長和浸潤轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系。以上結(jié)果表明Nucleophosmin在肺腺癌中具有類似癌基因的功能，檢測Nucleophosmin的表達情況可能對肺癌早期診斷、指導(dǎo)治療、預(yù)后預(yù)測有一定價值。但Nucleophosmin在腫瘤進展中的具體作用機制還不完全明了，可能與Nucleophosmin可以導(dǎo)致c-myc穩(wěn)定性增強，p53 基因失活，進而促進細胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)[13-14]，也可能與Nucleophosmin通過促進PCNA的表達促細胞增殖有關(guān)[15]。Notch是一種單次跨膜受體蛋白，Notch信號通路具有高度保守性，許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展均與Notch信號通路失調(diào)有關(guān)，其中Notch1是Notch信號通路中的重要受體，在多種腫瘤形成中發(fā)揮重要作用[16-17]。有研究報道在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)Notch1的異常表達，但它在不同腫瘤中發(fā)揮的作用卻并不相同，在某些腫瘤中呈現(xiàn)促癌作用，可是在另一些腫瘤中卻呈抑癌作用，也有研究表明即使在同一種腫瘤發(fā)生的不同時期Notch1起的作用也不相同[18-19]，近年來Notch1在肺癌中的作用也逐漸成為研究熱點，有研究表明Notchl在非小細胞肺癌中高表達，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期呈正相關(guān)[20]，本研究中發(fā)現(xiàn)，Notchl在肺腺癌的表達隨臨床分期的升高而升高，各組間比較有顯著性差異(P<0.05)，同時隨細胞分化的減低而增加，各組間比較有顯著性差異(P<0.05)，本研究發(fā)現(xiàn)在肺腺癌組織中Notch-1的陽性表達隨臨床分期明顯上調(diào)，表明Notch-1在肺腺癌的發(fā)生過程中起到了促癌作用，另發(fā)現(xiàn)Notch-1的表達隨肺腺癌分化程度降低而增高，推測Notch-1可能通過抑制細胞分化促進肺腺癌的發(fā)展， Notch-1高表達與肺腺癌組織分期、病理分級、臨床分期具有相關(guān)性，說明其與肺腺癌的惡性程度及侵襲性呈正相關(guān)，Notch-1促進肺腺癌發(fā)生，發(fā)展，侵襲和轉(zhuǎn)移的機制可能與Notch信號通路參與上調(diào)VEGF，競爭性結(jié)合核因子NF-κB 抑制因子，上調(diào)NF-κB等促進腫瘤微血管的形成，誘導(dǎo)細胞增殖[20]有關(guān)， 而Notch-1在腫瘤中的不同作用可能與腫瘤細胞類型、生長背景和腫瘤干細胞有關(guān)[21]。

綜上所述，Nucleophosmin、Notch1受體蛋白質(zhì)在肺腺癌組織中的異常高表達可能促進肺腺癌的進展，侵襲及轉(zhuǎn)移，兩者可能成為新的評價肺腺癌腫瘤患者預(yù)后的指標和治療新靶點，但兩者在肺腺癌中的具體作用機制及兩者的交互作用有待于進一步研究。

[1] Kim CK,Nguyen TL,Lee SB,et al. Akt2 and Nucleophosmin/B23 function as an oncogenic unit in human lung cancer cells[J].Exp Cell Res,2011,317(7):966-975.

[2] 王兆輝,李傳偉,于愛蓮,等.乳腺癌懸浮微球細胞與普通貼壁細胞中Notchl、鈣黏蛋白、血管內(nèi)皮生長因子A和C以及趨化因子受體4基因的表達差異[J].中華病理學雜志，2013,42(5):338-339.

[3] 許春偉, 張博, 林冬梅. WHO(2015)肺腫瘤組織學分類[J]. 診斷病理學雜志, 2015, 22(12):815-816.

[4] Travis WD, Brambilla E, Noguchi M, et al. International Association for the Study of Lung Cancer/American Thoracic Society/European Respiratory Society: international multidisciplinary classification of lung adenocarcinoma: executive summary[J]. Proc Am Thorac Soc,2011, 8(5): 381-385.

[5] 陳萬青，張思維，李連第，等.中國部分市縣1998-2002年肺癌的發(fā)病與死亡[J].中國腫瘤，2006，15(9)：570-574.

[6] Jemal A，Siegel R，Ward E，et al．Cancer statistics，2009[J]．CA Cancer J Clin，2009，59(4)：225-249．

[7] Lee Y S，Kim S J．PAUF promotes adhesiveness of pancreatic cancer cells by modulating focal adhesion kinase[J]．Exp Mol Med，2011，43(5)：291-297．

[8] Hill R，wu H．PTEN，stem cells，and cancer stem cells[J]．J Biol Chem，2009，284(18)：11755-11759．

[9] 李祺福,石松林,劉慶榕, 等.人參皂甙R91組合誘導(dǎo)人成骨肉瘤MG-63細胞分化過程中Nucleophosmin的表達與定位變化[J]. 細胞生物學雜志,2008，30(7)：265-272．

[10] Kassem N, Hamid A.A, Attia T, et al. Novel mutations of the nucleophosmin (NPM-1) gene in Egyptian patients with acute myeloid leukemia: A pilot study[J]. J Egypt Natl Canc Inst, 2011, 23(2):73-78.

[11] 劉巖，張飛，郭華，等.Nucleophosmin/B23 對結(jié)腸癌侵襲能力的影響[J].中國腫瘤臨床，2012，39(7)：373-376．

[12] Calli A.O, Sari A, Evcim G, et al. The enigmatic role of nucleophosmin in malignant melanoma: does it have an effect[J]. Ind J Path Microb, 2011,54(3): 482-486.

[13] 李祺福，唐劍， 劉慶榕，等.HMBA誘導(dǎo)人肝癌SMMC．7721細胞分化過程中Nucleophosmin的表達與定位變化[J]. 中國生物化學與分子生物學報，2008, 24 (2):172-179.

[14] 石松林，陳蘭英，劉用金，等. 姜黃素誘導(dǎo)人食管癌EC9706細胞凋亡過程中核磷蛋白的表達與定位變化[J]. 解剖學報，2014, 4 5(2):221-227.

[15] 余秀琴，駱丹，林秉獎，等. 黃芩苷和核磷蛋白基因沉默對人皮膚鱗癌細胞增殖的影響[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學雜志，2013，12(2)：75-78.

[16] Mazur PK, Einwachter H, Lee M,et al. Notch2 is required for progression of pancreatic intraepithelial neoplasia and development of pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(30):13438-13443．

[17] Kim MY,Ma JS，Ann EJ,et al．Regulation of Notchl signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notchl intracellular domain and RBP-Jk[J]．J Cell Sci,2011,124(pt11)：1831-1843．

[18] Wang J，F(xiàn)u L，Gu F，et al．Notchl is involved in migration and invasion of human breast cancer cells[J]．Oncol Rep，2011，26(5)：1295-1303．

[19] 弭麗麗，殷飛，杜韶波，等.Notchl在人肝細胞癌組織的表達及其臨床意義[J]．中華肝臟病雜志，2012，20(8)：628-629．

[20] 曹慧秋，文繼舫，胡玉林，等.肺鱗狀細胞癌中Notchl-4和DLL4的表達及與微血管密度的相關(guān)性[J].臨床與實驗病理學雜志，2012，28(8)：842-847．

[21] Miele L．Notch signaling[J].Clin cncer Res，2006,12(4)：1074-1079．

Expression and significance of Nucleophosmin and Notch1 in lung adenocarcinoma

HEJian-bin,LIULi-jing,XIANGZhi,XIAOJi-wen,XIAOHai-bo

DepartmentofRespiration,theFirstPeople'sHospitalofHuaihua,Huaihua,Hu'nan418000,China

Objective To observe the expression of Nucleophosmin protein and Notch1 receptor protein in lung adenocarcinoma and to discuss its significance. Methods A total of 107 patients with lung adenocarcinoma, who were admitted to our hospital from October 2012 to June 2015, were enrolled in the study. Immunohistochemical assay was used to analyze the expression of Nucleophosmin protein and Notch1 receptor protein in lung adenocarcinoma. Results Nucleophosmin protein and Notch1 receptor protein were positive expression in lung adenocarcinoma, and the expression of Nucleophosmin protein and Notch1 receptor protein was higher at high clinical stage than at low clinical stage, while it in tumor cells decreased with the rise of differentiation degree of the tumor. Conclusion The high expression of Nucleophosmin protein and Notch1 receptor protein in lung adenocarcinoma may be closely related with tumor occurrence, development, invasion and metastasis. The over expression of them in lung adenocarcinoma may promote progress, invasion and metastasis.

Nucleophosmin; Notch1; lung adenocarcinoma; metastasis

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.02.004

湖南省衛(wèi)生廳科研基金(No B2013-157)

1. 418000 湖南 懷化，懷化市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 2. 418000 湖南 懷化，懷化市第一人民醫(yī)院腫瘤中心 3. 418000 湖南 懷化，懷化市第一人民醫(yī)院病理科 4. 418000 湖南 懷化，湖南醫(yī)藥學院臨床醫(yī)學院

2016-07-06]