響應(yīng)面優(yōu)化超聲波法提取竹葉黃酮

李 燁，朱志強(qiáng)，集 賢，張 平，邢亞閣，楊文宇，，李宣林

(1.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384；2.國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；3.宜賓西華大學(xué)研究院食品非熱加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室食品非熱加工工程技術(shù)研究中心，四川 宜賓 644004；4.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039)

竹子是禾本科多年生的常綠植物，具有非常高的使用價(jià)值，是當(dāng)今世界最具有使用價(jià)值的植物之一[1-2]。竹葉是我國中醫(yī)的傳統(tǒng)藥材。根據(jù)古代藥典《本草求真》當(dāng)中的記載：竹葉具有“涼心緩脾，清痰止渴，治療上焦風(fēng)邪煩熱、咳逆順促、嘔穢吐血、一切中風(fēng)驚癇等癥”的特殊功效。究其原因，是因?yàn)橹袢~中含有諸多微量元素如錳、鋅、硒等，以及大量的黃酮類物質(zhì)、酚酸、竹葉多糖、多種氨基酸以及芳香成分[3]。其中含量最多的黃酮類物質(zhì)對人體大有裨益。竹葉黃酮的作用原理與銀杏黃酮類似[3]?，F(xiàn)代研究證明，竹葉黃酮類物質(zhì)在抑菌、抗氧化、抗糖化、抗炎[4-5]改善人體血液循環(huán)、抗疲勞等方面都有明確的功效[6-8]。同時，竹葉黃酮類物質(zhì)具有顯著的抑制潰瘍、解除局部痙攣以及降糖降血脂等作用[9]。黃酮類提取物已廣泛應(yīng)用在食品、藥品等工業(yè)中[10]。

目前，竹葉黃酮類物質(zhì)的提取方法主要是以乙醇[11-12]、丙酮[13]等作為溶劑進(jìn)行熱回流。當(dāng)前竹葉黃酮的工業(yè)化提取依然使用熱回流法，但該法存在耗能較大、耗時長，步驟繁瑣、可能會出現(xiàn)二次污染、加大企業(yè)生產(chǎn)成本等缺點(diǎn)，同時，成品水溶性較差，會降低提取物的活性[14]。因此，基于超聲波提取工藝時間短、能耗小、操作方法簡單的優(yōu)勢，本次試驗(yàn)應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化法對新型超聲波提取技術(shù)進(jìn)行研究，最終得出實(shí)驗(yàn)室提取竹葉黃酮的最佳工藝參數(shù)，為車間中試和企業(yè)生產(chǎn)提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品：四川樂山產(chǎn)干燥后的淡竹葉。

藥品：乙醇、蘆丁、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

儀器：UV-2450紫外分光光度計(jì)，島津集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；FVSY-360超聲波提取儀，北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 檢測方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作采用以下步驟[15]：1)準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.25、0.5、0.75、1 mL，分別相當(dāng)于蘆丁質(zhì)量0、0.25、0.625、1.25、1.875、2.5 mg；2)將以上蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液分別移入10 mL刻度的加蓋玻璃管中，加入30%乙醇至5 mL刻度處；3)在以上溶液中分別加入5%濃度亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻后放置5 min。再分別加入10%濃度的硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min。再分別加入濃度1.0 moL/L的氫氧化鈉溶液4 mL。4)最后，用30%乙醇定容至10 mL刻度處，搖勻后放置10 min。5)以零管為空白，將制得的溶液倒入1 cm比色皿中，在510 nm的波長處測量不同濃度的蘆丁溶液的吸光度。6)以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終得到回歸方程，A=0.956 97C+0.059 21，式中：C為配制的黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(mg/L)；A為測得黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值。R2=0.997 75，根據(jù)此方程，求算樣品總黃酮的含量。

1.2.2 竹葉黃酮提取率的測定與計(jì)算

用移液搶吸取5 mL竹葉黃酮提取液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的操作步驟，在510 nm波長處測量吸光度。通過下述公式計(jì)算竹葉黃酮的提取率[15]。

X=m1/5

式中：X為總黃酮含量(mg/mL)；m1為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的被測溶液中對應(yīng)的蘆丁含量(mg)； 5 為被測樣品的取樣量(mL)。

總黃酮提取率% =(m1×V×100)/m2

式中：m2為竹葉的質(zhì)量(mg)；V為提取液的總體積(mL)。

1.3 樣品處理

1.3.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的試驗(yàn)

取4 g過20目篩竹葉粉末，采用200 kW[17]提取功率，料液比1:25，浸潤30 min后，分別選取體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，超聲提取60 min的條件下試驗(yàn)，分別測定吸光度并計(jì)算提取率。

1.3.2 不同料液比試驗(yàn)

取4 g過20目篩竹葉粉末，分別選取1:15、1:20、1:25、1:30、1:35共5個不同料液比，浸潤30 min后，采用200 kW[17]提取功率，50%乙醇，超聲提取60 min的條件下試驗(yàn)，分別測定吸光度并計(jì)算提取率。

1.3.3 不同提取時間試驗(yàn)

取4 g過20目篩竹葉粉末，50%乙醇，料液比1:25，浸潤30 min后，采用200 kW[17]提取功率，分別選取10、20、30、40、50、60 min 6個不同提取時間的條件下試驗(yàn)，分別測定吸光度并計(jì)算提取率。

1.3.4 不同浸潤時間試驗(yàn)

取4 g過20目篩竹葉粉末，料液比1:25，分別選取10、20、30、40、50、60 min 6個不同浸潤時間，采用200 kW[17]提取功率，50%乙醇，超聲提取40 min的條件下試驗(yàn)，分別測定吸光度并計(jì)算提取率。

1.3.5 不同提取功率試驗(yàn)

取4 g過20目篩竹葉粉末，分別選取50、100、150、200、250 kW 5個不同提取功率，50%乙醇，料液比1:25，浸潤30 min后提取40 min的條件下試驗(yàn)，分別測定吸光度并計(jì)算提取率。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)前期單因素試驗(yàn)的結(jié)果分析，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和提取功率對竹葉黃酮提取率的影響較大，而料液比和浸潤時間對竹葉黃酮提取率的影響較小。以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取功率3個因素為自變量，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%作為影響因素乙醇體積分?jǐn)?shù)的水平數(shù)值，選取提時間30、40、50 min作為影響因素提取時間的水平數(shù)值，選取提取功率150、200、250 kW作為影響因素提取功率的水平數(shù)值。利用Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)得出三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)方案，以竹葉黃酮提取率作為響應(yīng)值，采用回歸分析方程擬合自變量與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過回歸方程來優(yōu)化工藝參數(shù)，預(yù)測響應(yīng)值，獲得最佳工藝條件[16]。試驗(yàn)因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平編碼

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過3次重復(fù)試驗(yàn)，單因素試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)計(jì)算、繪制圖表和分析采用Excel 2007及SPSS17.0軟件，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和繪制圖表采用Design Expert軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單獨(dú)因素對竹葉黃酮提取率的影響

2.1.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對竹葉黃酮提取率的影響

由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～80%時，竹葉黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增大而逐漸升高，在體積分?jǐn)?shù)為50%時達(dá)到最高值，之后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大竹葉黃酮的提取率逐步呈現(xiàn)下降的趨勢。這可能是由于隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，提取液中除總黃酮外的其他物質(zhì)的提取率也隨之升高，從而影響總黃酮的提取，造成竹葉中總黃酮的提取率下降。由試驗(yàn)結(jié)果可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時竹葉黃酮的提取率最高。

圖1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對竹葉黃酮提取率的影響

2.1.2 不同料液比對竹葉黃酮提取率的影響

由圖2可知，在不同料液比情況下，竹葉黃酮的提取率隨著料液比的變小而逐漸變大，在1:25料液比條件下達(dá)到最大值，之后隨著料液比的繼續(xù)變小而逐漸變小，但總體變化平穩(wěn)。

圖2 不同料液比對竹葉黃酮提取率的影響

2.1.3 不同提取時間對竹葉黃酮提取率的影響

由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，竹葉黃酮的提取率隨著提取時間的增加而逐漸增大，在提取時間為40 min時提取率最高，之后隨著提取時間的增大迅速下降，并趨于平緩。這可能是因?yàn)樵诔曁崛r超聲波會使提取液的溫度升高，隨著溫度的上升提取液內(nèi)的分子熱運(yùn)動會增加，從而有利于黃酮類物質(zhì)向提取劑中運(yùn)動，而隨著提取時間的增加，提取液溫度持續(xù)升高，可能會破壞黃酮的結(jié)構(gòu)，使得提取率迅速下降。

圖3 不同提取時間對竹葉黃酮提取率的影響

2.1.4 不同浸潤時間對竹葉黃酮提取率的影響

由圖4可知，在不同浸潤時間下，竹葉黃酮提取率沒有形成規(guī)律，在浸潤時間30 min時竹葉黃酮提取率最高，但總體來看，提取率沒有明顯的變化。

2.1.5 不同提取功率對竹葉黃酮提取率的影響

由圖5可知，在50～250 kW之間，竹葉黃酮的提取率隨著提取功率的增大而升高，在提取功率達(dá)到200 kW時提取率最大，之后隨著提取功率的增加而迅速下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)樵谔崛∵^程中超聲波的功率直接決定了機(jī)械振動的能量和空化作用的效果。超聲波功率低時產(chǎn)生的能量較小，對竹葉的破壁效果不顯著，導(dǎo)致提取率低；但隨著超聲波功率的增加，產(chǎn)生的機(jī)械作用逐漸增強(qiáng)，超過一定能量后反而會破壞竹葉中黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，同時會使空化趨于飽和，產(chǎn)生大量無用的氣泡，從而增加散射衰減，降低空化強(qiáng)度，造成提取率迅速下降[17]。由此可知，最佳提取功率為200 kW。

2.2 采用響應(yīng)面優(yōu)化對黃酮提取率進(jìn)行分析

2.2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化分析試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken的設(shè)計(jì)原理，分別以乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%)、提取時間(30、40、50)、提取功率(150、200、250 kW)設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，以黃酮提取率作為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

圖5 不同提取功率對竹葉黃酮提取率的影響

試驗(yàn)號因素ABC黃酮提取率/%1-1-114.2662-1113.56631005.4394-11-13.12150005.336600-13.44270005.38480014.13990-105.52310-1005.1351111-13.51212-1-1-13.852130005.269141-114.635150005.189160105.13171-1-13.862180005.387190005.2201114.32

2.2.2 數(shù)學(xué)模型的建立及分析

利用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到多元回歸模型為：Y=5.28+0.18A-0.25B+0.31C+0.096AB+0.09AC+0.008BC+0.021A2+0.06B2-1.48C2為檢驗(yàn)試驗(yàn)?zāi)Ｐ头匠痰挠行裕瑢Τ暡ǚㄌ崛≈袢~黃酮的提取率模型進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表3。

由表3可知，該模型方程的F值為253.75，P<0.000 1，極顯著(P<0.01)，說明在描述各影響因素與影響值之間的關(guān)系，因變量和全體自變量之間建立的竹葉黃酮提取率的模擬回歸方程極顯著，誤差極小，方法可靠。由表3還可以看出，失擬項(xiàng)P值為0.844 5>0.05，說明失擬項(xiàng)相對于純誤差是不顯著的，表明模擬回歸方程擬和情況良好，試驗(yàn)誤差小，失擬項(xiàng)模型選擇合適。同時，模型的決定系數(shù)R2=0.991 7，說明試驗(yàn)結(jié)果有99.17%受試驗(yàn)因素影響，模型模擬度良好，試驗(yàn)誤差較小，因此該模型可以用來分析和預(yù)測竹葉黃酮提取工藝條件。

由表3可知，回歸模型的一次項(xiàng)A、B對黃酮提取率的影響顯著(P<0.05)，C對黃酮提取率的影響極顯著(P<0.01)，二次方項(xiàng)C2對黃酮提取率的影響極顯著。由F值可知，各影響因素的主次順序?yàn)椋篊>B>A，即提取功率>提取時間>乙醇體積分?jǐn)?shù)。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

注：*表示影響顯著(P<0.05)；**表示影響極顯著(P<0.01)

2.2.3 響應(yīng)面交互分析

圖6—圖8是各試驗(yàn)因子對響應(yīng)值所構(gòu)成的三維空間響應(yīng)面-等高線圖，采用Design Expert8.0軟件繪制，每個曲面表示一個變量保持最佳水平時，另外2個變量間的相互作用。結(jié)合表3可知，AB交互作用P值為0.004 2，表示影響極顯著，說明提取濃度與提取時間之間的交互作用對竹葉黃酮提取率存在極大影響；AC交互作用P值為0.005 9，表示影響極顯著，說明提取濃度與提取功率之間的交互作用對竹葉黃酮提取率存在極大影響；BC交互作用P值為0.756 9，表示影響不顯著，說明提取時間和提取功率之間的交互作用對黃酮提取率影響較小。

2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化與分析

以黃酮提取率為響應(yīng)值的回歸方程進(jìn)行分析求解，最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)69.57%、提取時間30.57 min、超聲功率193.26 kW，在該工藝條件下理論預(yù)測黃酮提取率為5.598 92%。未檢驗(yàn)試驗(yàn)方法的可靠性，根據(jù)上述最佳參數(shù)并結(jié)合實(shí)際操作的可行性，將工藝條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時間30 min、提取功率190 kW。在以上工藝參數(shù)下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到竹葉黃酮提取率的平均值為5.463%。與理論預(yù)測值相比較，相對誤差為2.48%，誤差較小，驗(yàn)證了竹葉黃酮模擬回歸模型的有效性，確定可以使用響應(yīng)面對竹葉黃酮提取率進(jìn)行預(yù)測與分析。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間的交互作用對竹葉黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取功率的交互作用對竹葉黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖

圖8 提取時間和提取功率的交互作用對竹葉黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以四川產(chǎn)淡竹葉為原料，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取功率作為影響因素，以黃酮提取率作為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面法優(yōu)化了竹葉黃酮超聲波提取工藝，建立了竹葉黃酮提取率的模擬回歸方程，經(jīng)以上試驗(yàn)證明，該方程對試驗(yàn)結(jié)果擬合度良好，可以很好地預(yù)測竹葉黃酮的提取率，且影響提取率的因素作用：提取功率>提取時間>乙醇體積分?jǐn)?shù)。優(yōu)化得到的竹葉黃酮提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時間30 min，提取功率190 kW，該條件下竹葉黃酮提取率為5.463%，接近理論預(yù)測值。

黃酮提取工藝一直是國內(nèi)外研究熱點(diǎn)。竹葉黃酮因其食用安全、質(zhì)量穩(wěn)定和功效獨(dú)特等特點(diǎn)被認(rèn)為是一種較好的保健功能成分，并具有成本低、資源豐富等優(yōu)勢[18]。從竹葉中提取黃酮類化合物的方法有很多，如水煮法和有機(jī)溶劑提取法。以水作為溶劑提取，成本低但得率也低；有機(jī)溶劑提取法不僅工作強(qiáng)度大，溶劑回收率低，活性成分易破壞，而且對設(shè)備要求較高，得率較低[19]。作為近年來發(fā)展的一門新技術(shù)，超聲波具有加熱迅速、受熱均勻、穿透力強(qiáng)、控制方便、傳質(zhì)速率和效果較好，且節(jié)約能量及不需要特殊分離步驟等優(yōu)點(diǎn)[20]。利用超聲波提取可增加有效成分的提取率，縮短提取時間，并且還可避免高溫對提取成分的影響[21]。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化竹葉黃酮超聲波提取條件，為提高竹葉黃酮的提取率提供參考，為進(jìn)一步綜合開發(fā)利用竹類資源提供科學(xué)依據(jù)。