植物快速加代技術(shù)研究及應(yīng)用

, , , , , , , (.廣州大學(xué)植物抗逆基因功能研究廣州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 廣東 廣州 50006；.廣州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 廣東 廣州 50006)

·綜述·

植物快速加代技術(shù)研究及應(yīng)用

孔曜1,姚焱1,郭培國(guó)1,李榮華1,張平1,黃紅弟2,李光光2,張華2
(1.廣州大學(xué)植物抗逆基因功能研究廣州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 廣東 廣州 510006；2.廣州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 廣東 廣州 510006)

獲得遺傳穩(wěn)定的植物永久分離群體或新品種需要多年時(shí)間，成為限制作物遺傳研究及育種的瓶頸。研究者利用多種方法加速植物世代的進(jìn)程，尤其是人工調(diào)控生長(zhǎng)條件與幼胚培養(yǎng)結(jié)合法的研究和應(yīng)用，使植物短時(shí)間內(nèi)建成遺傳穩(wěn)定的群體或品系成為可能。應(yīng)進(jìn)一步開(kāi)展該技術(shù)規(guī)范化、工廠化實(shí)施的應(yīng)用研究，提高大規(guī)模應(yīng)用的可能性；同時(shí)與分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合，提高我國(guó)農(nóng)作物遺傳改良的效率和水平。

快速加代； 胚培養(yǎng)； 逆境調(diào)控； 遺傳改良

永久分離群體是現(xiàn)代植物育種及遺傳學(xué)研究的重要基礎(chǔ)和材料。雙單倍體DH(doubled haploid)群體和重組自交系RILs(recombinant inbred lines)是應(yīng)用較普遍的分離群體。DH技術(shù)是已知的、可在1代內(nèi)有效實(shí)現(xiàn)基因穩(wěn)定的方法，但由于DH群體的建成受到基因型限制，許多植物種或基因型目前無(wú)法建成DH群體, 而且還減少了遺傳重組及選擇的機(jī)會(huì)[1]。利用SSR單籽傳代法建立重組自交系RILs，不受基因型的限制而普遍采用。為了構(gòu)建重組自交系，需要F2群體通過(guò)單籽傳代法(SSD)自交至少5～6代才能夠獲得遺傳穩(wěn)定的群體[2]。在育種實(shí)踐中，對(duì)于親緣關(guān)系較近的單交組合，加代到F4即可；雙交、復(fù)合交或親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的需要加代至F5～F6甚至更高的代數(shù)[3]。由于許多作物1年1代或2年1代，過(guò)長(zhǎng)的加代時(shí)間成為瓶頸。為此，作物遺傳及育種研究者通過(guò)多種方法加速植物世代的進(jìn)程。

1 田間快速加代方法

田間快速加代一般可以分為異地加代和就地保護(hù)設(shè)施加代兩類(lèi)。是指將植物材料種植于田間，植物依據(jù)育種地的地理特性、氣候條件完成自然世代周期。某些情況下輔助以人工設(shè)施完成生長(zhǎng)周期[3]。

1.1 異地加代法

受地理、季節(jié)、光熱條件影響，許多作物1年只能進(jìn)行1季的生長(zhǎng)，若要1年繁殖多代，多采取異地加代方式。中國(guó)地域遼闊、地形復(fù)雜、氣候多樣。采用異地加代繁育方式，如夏季已種植1代的育種材料，冬季移至海南南方地區(qū)再種植1代；或利用北方地區(qū)氣候冷涼、晝夜溫差大、日照時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，將東南部地區(qū)育種材料再移至北方青海等地加代種植。這樣南北交替種植，1年繁育多代，可以縮短育種年限，加快新材料、新品種的選育。許多作物通過(guò)此種方式成功進(jìn)行加代[4-9]。但異地加代也存在一些問(wèn)題：異地繁殖可能造成檢疫性病害、蟲(chóng)害、草害流行；南方熱帶地區(qū)病、蟲(chóng)害易發(fā)生，增加了災(zāi)害控制的人力物力投入；北方繁育基地受到氣候、熱量條件制約，只能滿(mǎn)足某些類(lèi)型品種生長(zhǎng)制種的需求，對(duì)生育期較長(zhǎng)類(lèi)型易受凍害而導(dǎo)致減產(chǎn)或絕收[4]。異地加代操作成本比較高[10]。

1.2 當(dāng)?shù)乇Ｗo(hù)地設(shè)施加代法

為克服異地加代的問(wèn)題，也可以借助當(dāng)?shù)厝展鉁厥?、塑料大棚等設(shè)施，調(diào)節(jié)室內(nèi)溫度、光照和水肥條件，使植物在不適宜生長(zhǎng)的季節(jié)也能在設(shè)施內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng)，達(dá)到一年繁殖多代的目的。在多種作物上較普遍地應(yīng)用[11-14]。

異地加代法與當(dāng)?shù)販厥掖笈锛哟ň山鉀Q因季節(jié)變換導(dǎo)致的溫度限制，能夠?qū)崿F(xiàn)1年多代。2種方法差別在于，異地加代法需要在異地建立育種基地、規(guī)劃育種用地，適合大規(guī)模育種；當(dāng)?shù)販厥掖笈锛哟ǎ瑹o(wú)需異地選址，適合較小規(guī)模的作物異季加代。

2 人工調(diào)控生長(zhǎng)條件與幼胚培養(yǎng)結(jié)合法

王海波等認(rèn)為，加速植物的發(fā)育需要以下突破： 1) 加速植株發(fā)育(指從出苗到開(kāi)花階段)。植物的生長(zhǎng)發(fā)育受水、肥、光、氣、熱的影響, 通過(guò)人為調(diào)控環(huán)境條件可以有效加速植物的發(fā)育進(jìn)程； 2) 縮短種子發(fā)育( 指從受精到種子成熟階段)。種子植物大都有1～2個(gè)月或更長(zhǎng)的種子發(fā)育期,借助離體培養(yǎng)技術(shù)直接誘導(dǎo)幼胚成苗,省去種子發(fā)育時(shí)間。 3) 快速度過(guò)春化過(guò)程(從種子萌動(dòng)到通過(guò)春化)[1，15]。

2.1 人工調(diào)控生長(zhǎng)條件

人工調(diào)控生長(zhǎng)條件，通過(guò)提高光照強(qiáng)度、調(diào)節(jié)光照時(shí)間(長(zhǎng)日照植物延長(zhǎng)光照時(shí)間，短日照植物控制光照時(shí)間)、控水控肥等措施制造植物生長(zhǎng)的逆境環(huán)境，加速植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)的進(jìn)程。

余陽(yáng)俊等發(fā)現(xiàn)，加強(qiáng)光照強(qiáng)度可以促進(jìn)大白菜的生殖生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，一定量的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)對(duì)加速大白菜植株抽薹開(kāi)花也有促進(jìn)作用[16]。光周期超過(guò)16 h，抽薹開(kāi)花期則明顯提早,以24 h效果最佳；花研等的研究表明，隨光照時(shí)間延長(zhǎng)，番茄的開(kāi)花時(shí)間縮短[17]；尹守恒等研究了光照時(shí)間與韭菜抽薹開(kāi)花結(jié)實(shí)之間的關(guān)系，結(jié)果表明，延長(zhǎng)光照時(shí)間，韭菜的抽薹期提早了3～5 d、始花期提前2～4 d[18]；Williams 和Hill[19]利用人工培養(yǎng)條件，持續(xù)24 ℃、光照20 h/d、光強(qiáng)250μmol/(m2·s)環(huán)境中實(shí)現(xiàn)了蕓薹屬植物36～60 d繁殖一代；王海波等[15]將小麥置于溫度25～32 ℃，光照14～18 h/d條件下，繁殖1代需66～69 d，1年可以繁殖5代；Zheng等[20]、Liu等[21]在此基礎(chǔ)上將光照時(shí)間延長(zhǎng)至16～20 h/d，光強(qiáng)500 μmol/(m2·s)條件，進(jìn)一步縮短了小麥1代時(shí)間；燕麥1代70～80 d，小黑麥68～81 d，為正常田間生長(zhǎng)時(shí)長(zhǎng)的一半左右；Ochatt等[22]在人工控制光溫條件的溫室中，在20/16 ℃ 日/夜(高溫不超過(guò)26 ℃)，每天16 h鈉燈或日光燈泡照射下，使豌豆94 d繁殖1代，1年可連續(xù)繁殖4代；Mobini 和Warkentin[23]將光照延長(zhǎng)至20 h/d，光強(qiáng) 500 μmol/(m2·s)(5支熒光燈管)下生長(zhǎng)，可以使豌豆34 d開(kāi)花，68 d收獲1代；Yao等[24]的研究表明，在溫度25 ℃/22(±1)℃ (日/夜)以及65%/85%(日/夜)相對(duì)濕度、光照20 h/d、光強(qiáng)500 μmol/(m2·s)條件下，油菜62～71 d繁殖1代，而正常田間1代需要112～116 d。以上研究表明，長(zhǎng)日照植物在人為延長(zhǎng)光照時(shí)間下有助于縮短生育期，如蕓薹屬植物、麥類(lèi)、豌豆可以在20～24 h下連續(xù)光照促進(jìn)發(fā)育。

許多熱帶、亞熱帶和溫帶春秋季開(kāi)花的短日照植物，如大豆、玉米、水稻等，每天光照超過(guò)12 h反而會(huì)推遲開(kāi)花，使世代周期延長(zhǎng)，因此加代處理時(shí)需要依據(jù)植物的光周期特性區(qū)別處理：水稻和玉米在20～38 ℃下光照8 h/d、棉花和大豆在20～35 ℃下光照10 h/d，水稻和棉花1年完成4代，玉米和大豆1年完成5代[15]；班巴拉花生在27 ℃/25 ℃(日/夜)，光照10 h/d強(qiáng)度5 000 lx下生長(zhǎng)，1年可以繁殖3代，而正常田間1代需要280～300 d[22]。而較高溫度對(duì)促進(jìn)植物開(kāi)花及授粉后胚的發(fā)育有一定作用，如25～30 ℃下小麥種子成熟期比溫度20 ℃下提早15～20 d，較高的環(huán)境溫度促進(jìn)種子發(fā)育和成熟[25]。

營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)植株發(fā)育有重要作用。鈕心恪等[26]在控溫溫室中用園土與蛭石(1∶1)培養(yǎng)基質(zhì)和Hoaglard’s營(yíng)養(yǎng)液栽培大白菜，70 d內(nèi)完成了1個(gè)世代。土壤或營(yíng)養(yǎng)液中含N量高時(shí)會(huì)延長(zhǎng)小麥的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng), 而P,K等高時(shí)則促進(jìn)生殖發(fā)育[1，27]。較高量的鉀、微量元素、植物桔稈、種子粉碎物、草木灰、糠醛渣等都表現(xiàn)了較強(qiáng)的促小麥植株發(fā)育的作用，王海波等[1]研制出適合小麥加代的土壤配方，既能加快發(fā)育速度,又能獲得較大的營(yíng)養(yǎng)體和生殖體。土壤營(yíng)養(yǎng)調(diào)控也可以通過(guò)土缽體積進(jìn)行調(diào)整。Liu等在對(duì)燕麥和小黑麥快速加代時(shí)發(fā)現(xiàn)，較少的培養(yǎng)土提高了植物的逆境脅迫條件，促進(jìn)了植物開(kāi)花，但降低了植株育性，當(dāng)增大培養(yǎng)土體積和適當(dāng)供肥后，有助于提高植株結(jié)實(shí)率[21]。

土壤水分含量也影響植物發(fā)育速度。適當(dāng)干旱可以提早植物開(kāi)花、縮短生育期[21，24]；人工環(huán)境下的濕度對(duì)植株的發(fā)育影響也很大,濕度過(guò)大會(huì)抑制蒸騰作用削弱植株發(fā)育；結(jié)實(shí)期過(guò)多水也將延遲胚發(fā)育速度，應(yīng)適當(dāng)控水處理[1]。

需要注意的是，過(guò)強(qiáng)的逆境環(huán)境也會(huì)影響植物的正常生長(zhǎng)、影響花粉發(fā)育及結(jié)實(shí)等[28]。因此，快速加代時(shí)的逆境條件要適度：溫度和光照的條件控制應(yīng)依據(jù)不同物種植物的需要進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整；水分和肥力控制需要依據(jù)植物生長(zhǎng)狀況，既能保證每一代的快速加代，又能滿(mǎn)足一定結(jié)實(shí)率，實(shí)現(xiàn)多代持續(xù)繁殖的目的。

2.2 幼胚培養(yǎng)

幼胚培養(yǎng)是指通過(guò)人工離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)植物的幼胚直接發(fā)育成苗而省去種子成熟、萌發(fā)過(guò)程的技術(shù)[29]。剛收獲的種子一般都具有休眠期,需要一定時(shí)間解除休眠后，種子才可順利萌發(fā)成苗[30]。幼胚培養(yǎng)技術(shù)，省去了種子成熟時(shí)間以及萌發(fā)前解除休眠所需時(shí)間，可以有效縮短世代時(shí)間。

植物幼胚培養(yǎng)時(shí)胚齡的選擇和培養(yǎng)基成分對(duì)幼胚培養(yǎng)成功起著關(guān)鍵作用。不同物種適宜的幼胚培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)方法存在差異。賈春蘭等[31]在大白菜的加代繁殖過(guò)程中，剝?nèi)【G熟期種子中的倒生胚進(jìn)行離體培養(yǎng),結(jié)果得到，白菜倒生胚生長(zhǎng)的適宜培養(yǎng)基為MS+2,4-D 0.01～0.005 mg/L+6-BA 1～2 mg/L+蔗糖2%，誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基為MS+IBA 0.2～0.4 mg/L+蔗糖2%，采用固態(tài)培養(yǎng)基與液態(tài)培養(yǎng)基交替使用的方法誘導(dǎo)幼胚萌發(fā)成苗，可以縮短種子成熟期10～20 d；王海波等[15]發(fā)明了適合于多種植物的快速加代技術(shù)，將小麥、水稻、玉米、棉花、大豆的幼胚(適宜培養(yǎng)的幼胚胚齡為小麥8～12 d、水稻12 d、春夏玉米10 d、春夏大豆14 d和棉花10 d)培養(yǎng)在PM培養(yǎng)基上誘發(fā)成苗，實(shí)現(xiàn)5種作物60～89 d內(nèi)繁殖1代；于清濤等[32]將四季蘿卜花后25 d胚齡的胚進(jìn)行離體培養(yǎng)，結(jié)果幼胚成活率在90%以上；嚴(yán)慧玲等[33]將甜(辣)椒授粉后30～35 d的幼胚接種到MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)成苗，可縮短種子成熟期20～30 d；王濤濤等[34]將甘藍(lán)和芥菜型油菜不育系遠(yuǎn)緣雜種胚在授粉后10 d進(jìn)行培養(yǎng)，在MS基本培養(yǎng)基中添加1 mg/L BA，0.1 mg/L NAA和活性炭的條件下誘導(dǎo)胚發(fā)育成苗；何道一等認(rèn)為，大豆開(kāi)花后20 d的幼胚結(jié)合高溫預(yù)處理(37 ℃)能夠顯著提高幼胚萌發(fā)率和成苗率，不同培養(yǎng)基對(duì)成苗率無(wú)顯著影響[35]；Zheng等[20]、Liu等[21]和Yao等[24]分別將小麥、大麥、燕麥、小黑麥和油菜的12 d胚齡的幼胚置于改良的MS+10% 椰青汁培養(yǎng)基中，7～14 d后產(chǎn)生的幼苗即可移入土壤進(jìn)入下一代周期。實(shí)現(xiàn)小麥和大麥1代39～55 d、燕麥和小黑麥1代48～61 d和油菜1代48～56 d，與單純?nèi)斯きh(huán)境調(diào)控下加代相比，每代縮短20～25 d的種子成熟時(shí)間，實(shí)現(xiàn)1年繁殖6～9代；Ochatt 等[22]將豌豆幼胚置于改良的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)成苗，實(shí)現(xiàn)63 d 1代，而田間正常生長(zhǎng)需要143 d；班巴拉花生幼胚在BM添加0.5～1 mg/L NAA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出苗良好，85～90 d繁殖1代；Mobini 和Warkentin[23]將豌豆開(kāi)花后13～17 d胚齡的幼胚置于HS (Holland SecretTM) 培養(yǎng)基進(jìn)行幼胚培養(yǎng)成苗，1年內(nèi)可以連續(xù)繁殖7代并成功建立2個(gè)豌豆RILs。研究中發(fā)現(xiàn)，由于環(huán)境條件對(duì)開(kāi)花授粉后胚的發(fā)育有很大影響，適宜培養(yǎng)的胚齡數(shù)不是固定不變的。較高的溫度條件、適當(dāng)控水將促進(jìn)胚發(fā)育，使適宜離體培養(yǎng)的胚齡提前[24]。如授粉后將小麥植株移到較高的溫度 25～28 ℃環(huán)境，24 h全光照，可使幼胚培養(yǎng)時(shí)間提前1～2 d[1]；對(duì)于誘導(dǎo)胚成苗的培養(yǎng)基成分，目前還無(wú)普遍適宜的配方，需依據(jù)不同植物種類(lèi)進(jìn)行調(diào)整。

2.3 加速春化過(guò)程

春化是某些高等植物在低溫誘導(dǎo)下促使成花轉(zhuǎn)變的過(guò)程[36]。低溫是一些2年生植物(如白菜、甘藍(lán)、青花菜、芹菜、胡蘿卜等)和1年生冬性植物(如小麥、黑麥等)誘導(dǎo)花發(fā)生所必需的條件,如果在這些植物可以感受低溫誘導(dǎo)時(shí)期,進(jìn)行一定時(shí)間的適宜低溫處理,可以縮短其生育時(shí)間,促使其提前開(kāi)花結(jié)實(shí)[37]。有研究表明，種子出于自身保護(hù)或環(huán)境適應(yīng)所形成的一系列先“休眠”或“抑制”，然后再慢慢解除這種“休眠”或“抑制”的機(jī)制, 不僅使其發(fā)育過(guò)程變得復(fù)雜, 也無(wú)謂地拖長(zhǎng)了春化和苗穗期階段的發(fā)育時(shí)間, 減少這種曲折便可簡(jiǎn)化發(fā)育過(guò)程[1,15]。利用幼胚培養(yǎng)萌苗，不僅可節(jié)省種子后熟所耗的時(shí)間, 還減少了“發(fā)育抑制物”的積累。對(duì)于冬性小麥材料，越早開(kāi)始幼胚培養(yǎng)，春化越非必要條件。如冬小麥9306種子正常條件下須經(jīng)30 d春化處理才能抽穗，而其15 d胚齡的幼胚經(jīng)離體培養(yǎng)的誘導(dǎo)苗不經(jīng)春化也能抽穗結(jié)實(shí)[15]。Zheng等[20]，Liu等[21]和Yao等[24]分別將小麥、大麥、燕麥、小黑麥和油菜的不同早、中、晚熟品種進(jìn)行幼胚培養(yǎng)誘導(dǎo)成苗后，均不需要低溫春化處理，可以在39～56 d內(nèi)完成開(kāi)花結(jié)實(shí)的過(guò)程。這些也表明幼胚培養(yǎng)可以有效減少種子內(nèi)“發(fā)育抑制物”的積累，為克服春化過(guò)程加速植株發(fā)育提供了途徑。

對(duì)于冬性較強(qiáng)的材料，如果幼胚培養(yǎng)成苗也無(wú)法完全克服春化過(guò)程，那么尋找快速通過(guò)春化的辦法是快速加代的重要切入點(diǎn)。冬小麥加速發(fā)育進(jìn)程的方法值得借鑒：在小麥胚培養(yǎng)出苗1～3 d 后開(kāi)始春化(一般選擇苗齡小但體積大的植株更易進(jìn)行)，冬性較強(qiáng)的材料春化25～30 d,冬性較弱的材料春化20～25 d；春化結(jié)束前用KT 溶液泡根2 d, 有助于加速發(fā)育[1]。丁曉義等[38]將小麥胚齡為12～14 d的幼胚置于PM培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4 d,然后在8～10 ℃、1 000 lx、24 h/d的光照條件下春化處理25～30 d，可使小麥個(gè)體發(fā)育加速，實(shí)現(xiàn)1年繁殖5代。

3 展 望

植物快速加代技術(shù)，極大地加快分離群體材料遺傳穩(wěn)定的速度和進(jìn)程，在重組自交系的基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展為近等基因系、單片段代換系等，便于重要基因的精確定位，在植物遺傳研究中有重要價(jià)值；在育種實(shí)踐中，快速加代技術(shù)為新品種快速選育提供了條件。目前，人工調(diào)控生長(zhǎng)條件與幼胚培養(yǎng)結(jié)合技術(shù)在許多植物中還需要依據(jù)不同植物生物學(xué)特性開(kāi)展規(guī)范化、工廠化實(shí)施的應(yīng)用研究，提高大規(guī)模應(yīng)用的可能性；為使快速加代技術(shù)有效地發(fā)揮作用,應(yīng)加快主要作物重要經(jīng)濟(jì)及農(nóng)藝性狀的分子標(biāo)記研究，將加代技術(shù)與分子標(biāo)記選擇結(jié)合加速植物的遺傳改良，進(jìn)一步提高我國(guó)農(nóng)作物遺傳改良的效率和水平。

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(本欄目責(zé)任編輯：周介雄)

Studies and Applications in Plant Rapid Generation Technology

KONGYao1,YAOYan1,GUOPeiguo1,LIRonghua1,ZHANGPing1,HUANGHongdi2,LIGuangguang2,ZHANGHua2

2017-01-26

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015 A 020209191)；國(guó)家自然科學(xué)基金(41373118)；廣州市教育局教育系統(tǒng)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(13 C 02)。

孔 曜(1992—)，男，廣州人；碩士研究生，主要從事植物生物技術(shù)改良研究。

姚 焱(1972—)， 女，河南省開(kāi)封人；博士，副教授，主要從事植物遺傳育種研究；E-mail:yaoyannn@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.07.056

S 330

A

1001-4705(2017)07-0056-04