濃香型白酒大曲微生物研究進展

康承霞，張宿義，馬 蓉2，，楊 艷，李德林，秦 輝，

羅 杰1，2，邱川峰1，2，徐 瓊1，2，田殿梅3，代漢聰3

（1.瀘州保諾生物科技有限公司,四川瀘州646000； 2.瀘州科源生物科技有限公司四川瀘州 646000；3.瀘州老窖股份有限公司,四川瀘州646000； 4.國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，四川瀘州646000）

濃香型白酒大曲微生物研究進展

康承霞1，2，張宿義3，4，馬 蓉2，3，4，楊 艷1，2，李德林1，2，秦 輝3，4，

羅 杰1，2，邱川峰1，2，徐 瓊1，2，田殿梅3，代漢聰3

（1.瀘州保諾生物科技有限公司,四川瀘州646000； 2.瀘州科源生物科技有限公司四川瀘州 646000；3.瀘州老窖股份有限公司,四川瀘州646000； 4.國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，四川瀘州646000）

概述了大曲微生物的類型及主要微生物種類的功能和特性，歸納了近年來大曲功能菌的篩選及相關研究，為大曲微生物的研究和大曲生產工藝的優(yōu)化提供理論依據。

濃香型白酒； 大曲微生物

大曲是以小麥（大麥、豌豆等）為原料，通過自然接種、培菌發(fā)酵而成的一種聚物系、菌系、酶系為一體的微生態(tài)制品，是傳統(tǒng)固態(tài)法白酒釀造的重要物質保障。微生物作為大曲的重要組成部分，其種類和數(shù)量的多寡，直接影響到白酒的風格與品質。

隨著科學技術的發(fā)展，大量先進分析檢測技術的應用，大曲中紛繁復雜的微生物菌系逐漸被揭示，使得千百年來釀酒先輩們在釀酒實踐中總結出的“曲乃酒之骨”“有好酒必有好曲”這些精辟論斷得到了科學的應證。同時，眾多關于大曲微生物研究成果的推廣與應用，也促進了大曲品質的提升。

本研究針對近年來有關濃香型白酒大曲微生物的研究進行了系統(tǒng)歸納總結，為以后的研究工作提供一定參考。

微生物的研究是深入認識大曲微生物種群多樣性及功能特點的重要手段。根據現(xiàn)有研究結果來看，大曲微生物主要可分為霉菌、酵母菌、細菌、放線菌四大類[1]，其在白酒釀造過程中都扮演著重要的角色。

1 霉菌

大曲中的霉菌不僅是形成曲表穿衣、保證曲體排水順暢從而避免大曲酸敗的主要菌類，還是影響大曲糖化力、液化力、酯化力的主要菌類，它在大曲中的種類、數(shù)量對大曲質量起著決定性作用。一定程度上，根據大曲表面及斷面霉菌的顏色即可大致推斷大曲質量的好壞。

霉菌菌落一般較大，開始生長時往往為白色或灰白色，隨著孢子的形成菌落呈現(xiàn)出各種顏色[2]。霉菌種類不同，其代謝產物在大曲中發(fā)揮的作用也各異。黑曲霉能產生α-淀粉酶、過氧化氫酶、纖維素酶、α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、β-葡萄糖苷酶、半纖維素酶、橙皮苷酶、脂肪酶、柚苷酶、果膠酶、單寧酶霉等[3]；紅曲霉能代謝產生麥芽糖酶、蛋白酶、酯化酶等[4]；根霉產糖化酶、液化酶(淀粉酶)能力強，能將淀粉近乎理論值地轉化為葡萄糖[5]；毛霉、擬內孢霉在培菌初期生長于曲表形成“穿衣”，為菌絲進入曲體形成微孔通道打下基礎；青霉菌產生的青霉素在低濃度條件下能夠預防雜菌生長，濃度較高則會抑制正常大曲微生物的繁殖[6]。

楊耀寰等[7]采用稀釋涂布平板法從瀘州老窖大曲中分離得到2株高產糖化酶的菌株，經分子生物學方法鑒定1株為棒曲霉，1株為黑曲霉，其糖化酶活性分別達到了1842 U/g、2349 U/g；葉光斌等[8]采用稀釋涂布平板法從濃香型大曲中分離純化得到1株黑曲霉，采用酶聯(lián)免疫法發(fā)現(xiàn)該菌株產褚曲霉毒素A含量可達8.5 μg/kg。

胡曉龍等[9]、唐圣云等[10]分別采用稀釋涂布平板法從五糧液大曲中分離篩選出1株紅曲霉菌株和1株嗜熱紅曲霉菌株，通過超濾法對紅曲霉菌株的固態(tài)發(fā)酵物浸液進行濃縮后發(fā)現(xiàn)，其酯化活力比濃縮前提高了2倍左右，嗜熱紅曲霉菌株也具有較高酯化活力，其酯化酶活可達280 U/g；王曉丹等[11]利用微生物分離技術從濃香型大曲中篩選到1株高產酯化酶的菌株，根據形態(tài)和培養(yǎng)特征、生理生化特征、分子生物學等方法鑒定為紫色紅曲霉，其酯化力為236 mg/g·100 h；羅惠波等[12]采用稀釋平板涂布法從濃香型大曲中分離出1株菌株，通過18S rDNA的PCR擴增及測序得出該菌屬于紅曲霉屬，并對該菌產桔霉素條件進行研究，確定了該菌株在添加EDTA的酵母浸膏蔗糖培養(yǎng)基中產桔霉素能力較高；胡靖等[13]從濃香型大曲中分離篩選得到1株產己酸乙酯的菌株，根據其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、18S rDNA分子克隆測定及系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定為紫色紅曲霉，用該菌株制成麩曲，在實驗室條件下其酯化力可達62.79 mg/g·100 h。

黃丹等[14]采用稀釋涂布平板法從濃香型大曲中分離得到1株產酯化酶霉菌，經形態(tài)、Biolog微生物自動分析系統(tǒng)鑒定該霉菌為黃曲霉，其酶活力為6.75 U/mL；羅惠波等[15]采用稀釋劃線平板法從中高溫大曲中分離得到1株菌株，經菌落觀察、鏡檢及分子生物學手段鑒定，該菌株為黃曲霉屬，采用酶聯(lián)免疫法對該菌株產黃曲霉毒素B1進行定量檢測，其最高值可達13.6 μg/kg。

呂梅等[16]采用稀釋平板涂布法從濃香型中高溫大曲中分離篩選得到1株高產酯化酶菌株，經形態(tài)鏡檢及18S rDNA片段序列分析鑒定該菌株為多枝橫梗霉，其產酶活力可達到41.22 U/mL。

2 細菌

細菌是大曲中產蛋白酶和香味物質的重要菌類。在高溫條件下，部分細菌能分解大曲原料中的蛋白質產生酚類、酯類、醛類等揮發(fā)性香味物質，從而賦予大曲獨特的曲香味。

大曲中常見的細菌有芽孢桿菌、乳酸菌、醋酸菌等。芽孢桿菌能通過自身的代謝使糖、蛋白質、脂肪這三大營養(yǎng)物質發(fā)生轉化，形成典型濃香型白酒風格的風味物質，并能為白酒提供營養(yǎng)成分；乳酸菌代謝產物乳酸可降低白酒刺激感、增加酒體的濃厚度、延長白酒后味、增加酒體的回甜感，同時乳酸也是形成乳酸乙酯及其他香味成分的重要基礎物質[17]；醋酸菌產生的醋酸是白酒的主要香味成分，同時也是丁酸、己酸及其酯類的前體物[18]。適量的乳酸菌、醋酸菌能一定程度上抑制雜菌生長，并能促進美拉德反應、促進釀酒發(fā)酵、維護與保持釀酒微生態(tài)環(huán)境等。同時，乳酸菌等生酸菌在大曲中的大量存在，也會給大曲帶來酸味、臭味等異味。

袁先玲等[19-20]采用稀釋涂布平板法從濃香型大曲中分離純化得到5株產蛋白酶細菌，經分離鑒定為蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌，對其中產酶能力最強的蠟狀芽孢桿菌優(yōu)化培養(yǎng)后，酶活可達262.18 U/mL；衛(wèi)春會等[21]采用稀釋涂布平板法從濃香型大曲中篩選得到1株產蛋白酶細菌，采用硫酸銨分級沉淀、透析、吸附樹脂處理等方法提取該細菌所產的蛋白酶，并對該酶的最適pH值、pH值穩(wěn)定性、最適溫度、溫度穩(wěn)定性、金屬離子影響等進行了研究。

謝國排等[22]利用熱處理、高溫培養(yǎng)等方法，從金種子濃香型大曲中分離出6株產蛋白酶的嗜熱細菌，通過GC-MS檢測其單菌種發(fā)酵液中香氣成分，發(fā)現(xiàn)這些菌株均有產芳香族化合物、酚類、酯類等白酒風味物質的能力；明紅梅等[23]采用稀釋涂布平板法和二氧化碳培養(yǎng)法分別從濃香型大曲中分離純化得到2株細菌，經形態(tài)觀察、生理生化鑒定為地衣芽孢桿菌和棒狀桿菌，通過頂空固相微萃取氣相色譜質譜聯(lián)用分析2株菌的固態(tài)發(fā)酵產物的揮發(fā)性物質發(fā)現(xiàn)，2株菌均能代謝產生吡嗪類物質、苯乙醇、愈創(chuàng)木酚等香味物質；陳曉旭等[24]采用平板篩選和16S rDNA鑒定方法，在濃香型大曲中分離得到1株具有高液化力的枯草芽孢桿菌，其液化力高達11.756 g/g·h，通過HS-SPME-GC-MS確定了其代謝產物含有吡嗪類物質、愈創(chuàng)木酚和苯甲醛等多種重要的大曲風味物質。

王勇等[25]采用傳統(tǒng)微生物分離方法從濃香型白酒大曲中篩選出8株優(yōu)勢芽孢桿菌，經形態(tài)特征觀察，結合細菌脂肪酸鑒定技術(MIDI鑒定系統(tǒng))對其進行鑒定表明，8株芽孢桿菌分屬于5個種，分別為巨大芽孢桿菌、浸麻類芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。趙東等[26]從濃香型曲藥中分離篩選得到1株產紅色素的細菌，經純化鑒定為枯草芽孢桿菌，該菌能在較廣泛的溫度和酸度條件下生長，且具有分解淀粉和液化明膠的能力。

黃丹等[27]采用稀釋平板涂布法從濃香型大曲中分離篩選得到1株產酯化酶細菌，通過形態(tài)特征和Biolog微生物自動分析系統(tǒng)鑒定為血紅鞘氨醇單胞菌，通過對其培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化后，該菌所產的酯化酶酶活可達18.26 U/mL。

3 酵母菌

酵母菌是影響白酒發(fā)酵產酒的主要菌類。大曲中的酵母菌主要有產酒酵母、產酯酵母以及假絲酵母等，產酒酵母是酒曲中主要的產酒功能菌，能夠將糟醅中的淀粉發(fā)酵為酒精；產酯酵母又稱為生香酵母，能促進發(fā)酵過程中酯類的生成，形成濃香型白酒的特征風味物質。

明紅梅等[28]采用稀釋涂布平板法從濃香型大曲中分離純化得到1株酵母菌，該菌株發(fā)酵后的培養(yǎng)基質中含有濃郁的酒香味，經形態(tài)學觀察和分子生物學鑒定，該菌株為異常威克漢姆酵母，采用頂空固相微萃取氣相色譜質譜聯(lián)用技術對這株菌的發(fā)酵產物進行揮發(fā)性成分檢測，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵產物中香味物質含有吡嗪類物質、苯乙醇、愈創(chuàng)木酚等。祝云飛等[29]采用傳統(tǒng)平板分離法從濃香型大曲中分離得到1株酵母菌，通過形態(tài)特征觀察以及Biolog鑒定為休哈塔假絲酵母，對其固態(tài)發(fā)酵代謝的揮發(fā)性產物進行HS-SPME-GC-MS分析表明，其揮發(fā)性產物主要為乙醇、異戊醇和苯乙醇等醇類，同時還含有多種其他香味物質如異戊酸、苯乙醛、辛酸乙酯等。

劉宏媛等[30]采用稀釋平板劃線法從曲藥中分離純化出2株酵母菌，經Biolog鑒定系統(tǒng)鑒定為Zygosaccharomyces florentinus和 Hyphopichia burtonii A，采用Biolog 96孔碳源的利用情況研究表明，前者主要利用D-蜜二糖、蔗糖，后者主要利用麥芽三糖、α-D-葡萄糖。徐麗萍[31]采用稀釋平板劃線法從中高溫大曲中分離出了8株酵母菌，經菌落形態(tài)和生理生化鑒定分別為假絲酵母屬、漢遜酵母屬、酒香酵母屬和德克酵母屬，并從中篩選出1株高效產酯的漢遜酵母，其產酯量高達1.479 g/L。

賴穎等[32]采用稀釋平板涂布法從宋河中高溫大曲中篩選出10株能在45℃以上生長的耐熱酵母菌，其中1株酵母菌在58℃高溫條件下還能正常生長，經生理生化特征鑒定其為Saccharomyces屬的發(fā)酵性接合酵母，該菌發(fā)酵后的酒精得率高達55%。

4 放線菌

放線菌為單細胞菌，其結構簡單，能代謝產生抑制其他微生物生長、代謝的抗生素，可以調節(jié)多菌種的混合發(fā)酵途徑和代謝產物的積累，同時也能產生一定量的淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶[7，33-34]。

近年來，有關濃香型大曲中放線菌的研究成果鮮有報道，僅游劍等[35]采用傳統(tǒng)方法從枝江大曲春季和夏季發(fā)酵用大曲中分離到了放線菌，初步鑒定以鏈霉菌屬為優(yōu)勢菌群。針對濃香型大曲放線菌研究報道較少的原因，筆者認為，放線菌主要有好氣與嫌氣、腐生與寄生、中溫與嗜熱(少數(shù)嗜低溫)的存在方式，自然環(huán)境下生長的放線菌絕大部分都是中溫、好氣的腐生菌，且對周圍生長條件要求較高，尤其酸堿度(pH值)對放線菌的影響最為突出[36]。大曲在開放式的生產條件下，其獨特的生產工藝和發(fā)酵方式都不利于放線菌的生長繁殖，即使有少量放線菌存在，因取樣的隨機性、放線菌可培養(yǎng)性以及培養(yǎng)條件偏頗都可能會導致分離失敗。

5 展望

科學技術的進步，是推動白酒產業(yè)健康、快速發(fā)展的動力。借助高速發(fā)展的檢測技術與分析手段，科研工作者們揭開了大曲中微生物的神秘面紗，高糖化力菌株、高液化力菌株、高酯化力菌株、高產蛋白酶菌株以及特殊產香菌等大曲功能菌的發(fā)現(xiàn)，為大曲品質的提升及功能曲、強化曲的研究提供了技術支撐，同時也為研究大曲微生物對白酒風格風味的影響奠定了基礎。但“開放式、自然接種”的大曲生產原本是多菌群此消彼長、相互影響的一種發(fā)酵模式，單一強化某一特定功能的研究方式可能無法全面提升大曲品質，多種功能菌類的共同培養(yǎng)、相互作用的研究將是今后大曲微生物研究的一個重要方向。此外，有關放線菌的研究較少，對于放線菌在濃香型大曲中的作用功能認知極少，有必要采用更多、更新的技術手段進行研究和定位。

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Research Progress in Daqu Microbes of Nongxiang Baijiu

KANG Chengxia1,2,ZHANG Suyi3,4,MA Rong2,3,4,YANG Yan1,2,LI Delin1,2,QIN Hui3,4, LUO Jie1,2,QIU Chuanfeng1,2,XU Qiong1,2,TIAN Dianmei3and DAI Hancong3
（1.Baonuo Biotechnology Co.Ltd.,Luzhou,Sichuan 646000;2.Keyuan Biotechnology Co.Ltd.,Luzhou,Sichuan 646000;
3.Luzhou Laojiao Co.Ltd.,Luzhou,Sichuan 646000;4.National Engineering Technology Research Center of Solid-state Brewing,Luzhou,Sichuan 646000,China）

In this paper,the types of Daqu microbes and the function and features of the main microbial species were reviewed,and the screening of Daqu functional bacteria in recent years and their related research were summed up,which could provide theoretical basis for the research on Daqu microbes and the optimization of Daqu-making process.

Nongxiang Baijiu;Daqu microbes

TS262.3；TS261.1；TQ925.7

A

1001-9286（2017）05-0088-05

10.13746/j.njkj.2017027

四川省科技成果轉化項目《濃香型白酒智能化與自動化生產關鍵技術集成及產業(yè)化示范》（2016CC0032）；瀘州市科技計劃項目(2015-S-36)。

2017-02-16

康承霞(1989-)，女，本科，研究方向：微生物與發(fā)酵。

張宿義(1971-)，男，博士，正高級工程師，中國釀酒大師，研究方向：微生物與發(fā)酵。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2017-04-17；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170417.1007.003.html。