微生物發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的測定研究

陳 珊，黃艷玲，張 樂，，劉安軍

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學院，天津300350；2.天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457）

微生物發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的測定研究

陳 珊1，黃艷玲1，張 樂1，2，*劉安軍2

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學院，天津300350；2.天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457）

聚蘋果酸及其衍生物主要應用在生物醫(yī)藥、食品包裝材料等重要領(lǐng)域，其生產(chǎn)方法分為化學合成法和生物合成法，微生物發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸具有較大的優(yōu)勢。通過闡述微生物發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的菌種、培養(yǎng)基優(yōu)化、培養(yǎng)條件優(yōu)化、測定方法、聚蘋果酸的提取純化等方面，以期對聚蘋果酸的研究起到促進作用。

聚蘋果酸；微生物；發(fā)酵

0 引言

聚蘋果酸是以蘋果酸為唯一單體，單體間通過-OH和-COOH形成酯鍵而連接起來的水溶性脂肪族聚酯。目前，聚蘋果酸在市場上擁有很重要的地位，因為其主要在醫(yī)藥、食品包裝材料、吸水材料、化妝用品行業(yè)有廣泛應用。它以蘋果酸為唯一單體的高分子化合物，主要有α型、β型和α，β型3種結(jié)構(gòu)。存在于生物體內(nèi)的只有β型聚蘋果酸，由于具有特殊結(jié)構(gòu)，使其具有可吸收性和生物降解性。雖然聚蘋果酸具有非常重要的經(jīng)濟價值，但是其相關(guān)研究非常少，相關(guān)報道也不多，尤其是發(fā)酵法生產(chǎn)聚蘋果酸的報道更是不多。因此，對微生物發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的研究進行整理具有一定的意義。

1 生產(chǎn)聚蘋果酸的菌種

經(jīng)研究報道，生產(chǎn)聚蘋果酸的發(fā)酵生產(chǎn)菌種為短梗霉、出芽短梗霉、環(huán)狀青霉、黏菌等。

1.1 多頭絨泡菌

屬于黏菌門，它的生活史包括微觀的變形蟲階段和巨大多核原質(zhì)團階段。對多頭絨泡菌合成聚蘋果酸（PMLA）的研究多集中在合成機制及調(diào)控方面，發(fā)酵方面的研究較少。目前，利用P.polycephalum發(fā)酵合成PMLA多是采用傳統(tǒng)原質(zhì)團細胞發(fā)酵的方法。

1.2 青霉

有研究報道，利用青霉也能夠得到聚蘋果酸，最早是從圓弧青霉（Penicillium cyclopium）中分離得到一種酸性大分子化合物，這種物質(zhì)有抑制蛋白酶的活性，后來證明此為聚蘋果酸。

1.3 氧化黑酵母

有研究報道，從氧化黑酵母篩選得到了一種能夠發(fā)酵生產(chǎn)PMLA的菌株，以甘露醇為主要碳源，氮源為硝酸銨，無機鹽為磷酸二氫鉀、硫酸鎂、檸檬酸、吐溫80篩選培養(yǎng)基；加入玉米浸泡，丁二酸作為種子培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上改良加入碳酸鈣，于25℃條件下培養(yǎng)7 d，得到的發(fā)酵液中聚蘋果酸的產(chǎn)量為0.4 g/g。

1.4 出芽短梗霉

出芽短梗霉是目前報道最多的產(chǎn)聚蘋果酸菌種。劉雙江[1]從荷蘭和德國菌種保藏中心篩選出2株具有較高產(chǎn)聚蘋果酸能力的出芽短梗霉菌株DSM2404和CBS591.75，并對CBS591.75進行2 L和20 L發(fā)酵條件的摸索。王麗燕等人[2]分離了1株菌株A.pullulans BS02，并在搖瓶的水平上對發(fā)酵聚蘋果酸的條件進行了研究，碳源主要采用葡萄糖，培養(yǎng)基中加入50 g/L的CaCO3，控制pH值和溫度等條件發(fā)酵10 d，聚蘋果酸產(chǎn)量可達到30 g/L。Zhang H L等人[3]從新鮮的植物樣品中分離得到1株A.pullulans，通過發(fā)酵條件進行優(yōu)化，在搖瓶水平上進行了研究，確定最終合成聚蘋果酸的質(zhì)量濃度達到62.3 g/L；并且對10 L發(fā)酵罐試驗進行了研究，合成聚蘋果酸的質(zhì)量濃度為57.2 g/L，雖然沒有搖瓶水平高，但是也對小型發(fā)酵罐研究聚蘋果酸具有一定的意義。徐玲芬等人[4]從自然界植物樣本中分離得到1株產(chǎn)PMLA的菌株A. pullulansZUCC-41，培養(yǎng)基中加入30 g/L的CaCO3，該菌株發(fā)酵合成聚蘋果酸的質(zhì)量濃度為26.2 g/L，其中，發(fā)現(xiàn)利用出芽短梗霉發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸，加入碳酸鈣對合成聚蘋果酸具有一定的意義。

2 聚蘋果酸發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

研究發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的菌種多是出芽短梗霉。王麗燕等人[2]利用出芽短梗霉A.pullulans BS02發(fā)酵制備生物降解材料聚蘋果酸，并在搖瓶水平上進行研究，確定了出芽短梗霉發(fā)酵制備聚蘋果酸的搖瓶培養(yǎng)條件。其中，優(yōu)化的培養(yǎng)基為葡萄糖120.0 g/L、丁二酸銨3.0 g/L，丁二酸2.0 g/L，MnSO4·H2O 0.005 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，加入玉米漿以及碳酸鈣，在最優(yōu)條件下，聚蘋果酸產(chǎn)量可達到30 g/L。程媛媛等人[5]采用響應面法對出芽短梗霉菌發(fā)酵制備β-聚蘋果酸的培養(yǎng)基進行了響應面優(yōu)化，確定了聚蘋果酸的最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖、丁二酸銨和碳酸鈣，最佳質(zhì)量濃度分別為110.91，3.66，45.30 g/L，β-聚蘋果酸的發(fā)酵產(chǎn)量達到41.36 g/L，較優(yōu)化前的20.74 g/L提高了199%。

3 聚蘋果酸發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵條件優(yōu)化

聚蘋果酸發(fā)酵條件對產(chǎn)生聚蘋果酸的產(chǎn)量也非常重要，接種量、溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時間對產(chǎn)量都有影響。靳挺等人[6]對出芽短梗霉生產(chǎn)聚蘋果酸的發(fā)酵條件進行了研究，確定搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，溫度25℃，發(fā)酵培養(yǎng)6 d，最終聚蘋果酸的產(chǎn)量達到了16.58 g/L。李睿穎等人[7]對出芽短梗霉發(fā)酵合成聚蘋果酸進行了研究，確定了最佳生長溫度為30℃，最佳產(chǎn)酸溫度為25℃，最適接種量為8%。除此之外，利用玉米芯水解液發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸，采用固定化纖維床反應器技術(shù)進行重復分批發(fā)酵試驗，可以提高初始水解糖濃度，聚蘋果酸的得率從0.28 g/g提高到0.30 g/g。

4 聚蘋果酸發(fā)酵代謝途徑的研究

喬長晟等人[8]對出芽短梗霉發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的代謝通量及關(guān)鍵酶活性進行了分析，確定丙酮酸羧化途徑及乙醛酸途徑是合成聚蘋果酸的主要途徑，TCA循環(huán)途徑在發(fā)酵后期比較弱，通過酶活分析證明了高產(chǎn)菌株比出發(fā)菌株的聚蘋果酸合成能力強。

程若東等人[9]對出芽短梗霉積累聚蘋果酸途徑及調(diào)控進行了研究，采用分階段對發(fā)酵溫度進行調(diào)節(jié)，即0～24 h設(shè)定發(fā)酵溫度為30℃，24 h以后調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度為25℃，攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min，通風比1∶1.2，此時聚蘋果酸產(chǎn)量為45.2 g/L。

5 聚蘋果酸的測定方法

聚蘋果酸是一種水溶性脂肪族聚酯，目前檢測聚蘋果酸的方法主要有酶試劑盒法、紙層析法、高效液相色譜法等。研究表明，高效液相色譜法以及酶試劑盒這2種方法檢測聚蘋果酸的精度比較高，但是其成本比較高；紙層析法相對較簡單，但是方法耗時太長，數(shù)據(jù)平行性比較差。王鳳榮等人[10]對聚蘋果酸采用α-2,7-萘二酚法和酶試劑盒法進行了對比研究，結(jié)果這2種檢測方法都能有效地提取聚蘋果酸。

鄭誼豐等人[11]采用高效液相法利用Prevail C18型色譜柱（4.6 mm×250 mm，4 μm）測聚蘋果酸的含量，方法的回收率接近100%，是一種非常高效、定量、快速的定量分析方法。

6 聚蘋果酸產(chǎn)物的提取和純化

聚蘋果酸提取的難點在于，先要將發(fā)酵液中的普魯蘭多糖去除，才能提取出聚蘋果酸，但提取聚蘋果酸過程中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中還有很多副產(chǎn)物多糖。為了減少有機溶劑使用的成本，解除環(huán)境問題的影響，因此很多學者對提取聚蘋果酸進行了研究。畢藝成等人[12]采用兩步超濾膜法對出芽短梗霉發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸進行了分離與提取，采用離心、超濾、濃縮、沉淀、冷凍干燥獲得聚蘋果酸，其質(zhì)量分數(shù)可以達到82.3%，提取收率為57.56%。除了利用超濾進行提取聚蘋果酸之外，王浩等人[13]利用離子交換法提取聚蘋果酸，主要利用D296樹脂，最終使得聚蘋果酸的純度達到93.2%，提取收率為79.46%。

7 結(jié)論

主要就形成聚蘋果酸的菌種、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件優(yōu)化、發(fā)酵代謝途徑的研究、聚蘋果酸的測定方法以及提取純化進行了總結(jié)，因為聚蘋果酸無毒性、無免疫原性、良好生物相容性和生物降解性，因此在醫(yī)學藥學領(lǐng)域發(fā)展前景非常廣闊，化學法制備聚蘋果酸雜質(zhì)殘留太多、步驟繁瑣，希望微生物發(fā)酵為生產(chǎn)聚蘋果酸提供新的途徑。

[1]劉雙江.出芽短梗霉菌株CBS591.75和DSM2404發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的研究[J].生物工程學報，1997，13（3）：279-283.

[2]王麗燕，鄭誼豐，劉婷婷，等.聚蘋果酸的發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].生物加工過程，2010，8（2）：41-45.

[3]Zhang H L，Cai J，Dong J Q，et al.High-level production of poly（β-L-malic acid）with a new isolated aureobasidium pullulans strain[J].Appl Microbiol Biotech，2011，92（2）：295-303.

[4]徐玲芬，陳忠華，趙婧，等.聚蘋果酸高產(chǎn)菌株的篩選及鑒定[J].浙江大學學報（醫(yī)學版），2012，41（4）：434-440.

[5]程媛媛，鄭誼豐，王麗燕，等．響應面法優(yōu)化β－聚蘋果酸發(fā)酵培養(yǎng)基的研究[J]．食品工業(yè)科技，2011，32（5）：197-199.

[6]靳挺，武玉學，陳真，等.出芽短梗霉發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的研究[J].中國食品學報，2012，12（10）：125-130.

[7]李睿穎，喬長晟，國華，等.出芽短梗霉發(fā)酵合成聚蘋果酸的研究[J].食品與發(fā)酵科技，2011，47（5）：68-71.

[8]喬長晟，鄭志達，孟迪，等.出芽短梗霉發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的代謝通量及關(guān)鍵酶活性分析[J].現(xiàn)代食品科技，2014，30（7）：71-80.

[9]程若東，王浩，周華，等.出芽短梗霉積累聚蘋果酸途徑及調(diào)控研究[J].化工學報，2012（11）：3 639-3 644.

[10]王鳳榮，喬長晟，江建梅，等.出芽短梗霉發(fā)酵液中聚蘋果酸測定方法的比較[J].食品工業(yè)科技，2010，31（6）：347-352.

[11]鄭誼豐，周華，王麗燕，等.高效液相色譜法測定發(fā)酵液中聚蘋果酸方法的建立[J].食品科技，2010，35（4）：243-246.

[12]畢藝成，陸宏艷，王浩，等.兩步超濾膜法分離提取發(fā)酵液中聚蘋果酸[J].膜科學與技術(shù)，2015，35（1）：97-102.

[13]王浩，鄭誼豐，程媛媛，等.離子交換法從發(fā)酵液中提取聚蘋果酸[J].離子交換與吸附，2010，27（3）：257-263.◇

Study on Production of Poly Malic Acid by Microbial Fermentation

CHEN Shan1，HUANG Yanling1，ZHANG Le1，2，*LIU Anjun2
（1.Tianjin Modern Vocational Technology College，Tianjin 300350，China；2.College of Food Science and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Poly malic acid and its derivatives have important applications in biomedicine，food packaging materials and other fields.The production method of poly malic acid is divided into chemical synthesis and biosynthesis.In this paper，the production of poly malic acid by microbial fermentation，optimization of culture medium,optimization of culture conditions，determination method and extraction and purification of poly malic acid are described.The study on poly malic acid has certain significance.

poly malic acid；microorganism；fermentation

TQ920

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.05.041

1671-9646（2017）05b-0049-02

2017-04-26

陳珊（1983—），女，碩士，副教授，研究方向為生物反應工程。

*通訊作者：劉安軍（1963—），男，博士，教授，博士生導師，研究方向為水產(chǎn)品、畜產(chǎn)（副產(chǎn)）品高附加值的開發(fā)利用及功能性食品研究等。