重組酶聚合酶擴增技術及其在病毒性豬病快速檢測中的應用

■文/諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 莊夕棟

重組酶聚合酶擴增技術及其在病毒性豬病快速檢測中的應用

■文/諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 莊夕棟

重組酶聚合酶擴增(RPA)技術是近年來建立起來的一種新的核酸恒溫擴增技術，具有操作簡單、靈敏度高、特異性強、在短時間內快速擴增出目的片段等優(yōu)點，在動物疾病早期診斷、現地檢測、進出口快速檢疫等方面具有良好的應用前景。文章綜述了RPA技術及其在病毒性豬病快速檢測中的最新應用研究進展，以期為更好地防控豬病提供參考。

重組酶聚合酶擴增技術；豬病；檢測

重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技術是近幾年出現的有望替代PCR的新的核酸擴增技術。RPA技術由Piepenburg等[1]于2006年創(chuàng)立，該技術基于重組酶聚合酶介導的擴增原理，體外模擬生物體內DNA復制，在恒溫條件下即可對目的片段進行擴增[2]，特別適用于快速檢測、體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農業(yè)等領域[3]，已被成功應用到多種病原的快速檢測上。本文現將RPA技術及其在病毒性豬病快速檢測中的最新應用綜述如下。

1 RPA技術

RPA該技術主要依賴于3種酶：能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶[4]。這3種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應溫度在37℃左右。反應過程中不需要模板鏈的熱變性，可以在恒定的低溫條件下10～20min內快速擴增目的DNA或者RNA[5]。隨后，英國TwistDx公司開發(fā)出了商品化試劑盒，加快了RPA技術的研發(fā)、推廣和應用[6]。與傳統(tǒng)聚合酶鏈式反應(PCR)相比，RPA技術具有擴增速度快、反應溫度恒定、所需儀器簡單、檢測成本低、結果確實可靠、可制作成側流層析試紙條(LFD)等優(yōu)點，適用于現場快速檢測，有望替代PCR。目前，RPA技術已經在病毒、衣原體、支原體、細菌、寄生蟲等病原檢測方面得到了開發(fā)與應用[7]。

2 RPA技術在病毒性豬病檢測中的應用

2.1 口蹄疫

口蹄疫(Foot and Mouse Disease，FMD)是由小RNA病毒科的口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)引起的一種偶蹄動物共患的急性、熱性、高度接觸性傳染病，被國際獸疫局(OIE)列為A類疾病。Abd等[8](2013)將RPA基礎反應體系中加入反轉錄酶，在RPA基因擴增與熒光檢測儀中進行RT-RPA，應用到FMDV的檢測當中，可以檢測到FMDV的所有的7個血清型，而且各型之間沒有發(fā)生交叉反應，特異性強，靈敏性高。Amer等[9](2013)研發(fā)出一種可以在4～10min內檢測到FMDV的實時RT-RPA，靈敏度高達98%。此技術成功應用于當年埃及的口蹄疫大暴發(fā)時期，有效抑制了疫情的蔓延。王紅梅等[10](2016)利用最新的RPA技術，結合LFD方法，建立了可用于O型、A型和AsiaⅠ型FMDV的通用型和血清型分型的現場快速檢測技術。在25min內即可完成RPA反應，靈敏度可達到1TCID50。楊洋等[11](2017)根據O型FMDV ON毒株3D基因保守區(qū)域設計引物和探針，建立了實時熒光反轉錄重組酶聚合酶擴增(real-time RT-RPA)檢測方法，在40℃恒溫條件下20min內可快速、特異地檢測FMDV。利用該方法對采集的臨床樣品進行檢測，檢測結果與熒光定量RT-PCR檢測結果具有100%的符合率。RPA技術為FMDV的現場檢測提供了一種靈敏、可靠的新方法，為口蹄疫疫情的診斷及預報提供了技術支持。

2.2 豬細小病毒病

豬細小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一，PPV感染主要引起胚胎和胎兒死亡、重吸收、流產、木乃伊胎等，但母豬不表現明顯的癥狀。Yang等[12](2016)研制了檢測PPV NS1基因的熒光定量RPA和LFD方法，最低可分別檢測到300和400個含NS1基因的重組質粒，平行檢測101份病料和27份陰性樣品，熒光定量RPA和LFD與熒光定量PCR結果符合率分別為94.4%和100%。

2.3 豬圓環(huán)病毒病

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus Type 2，PCV2)是引起仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)為代表的系列疾病的病原，主要侵害6～12周齡的仔豬。PCV2的感染呈世界性分布，已成為危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要病因之一。PCV2感染可以導致動物免疫抑制，從而增強對其他多種病原體的易感性，使病情更加復雜化。Wang等[13](2016)建立了檢測PCV-2的實時熒光定量RPA方法。該方法最低可檢測100個PCV-2基因組，靈敏度與熒光定量PCR相同，較普通PCR提高了10倍。平行檢測48份病料樣品，RPA與熒光定量PCR結果一致，與普通PCR符合率為93.7%(45/48)。

2.4 豬藍耳病

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)又 稱 豬 藍 耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起的一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病，在世界范圍內的豬場廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經濟損失。Yang等[14](2016)研制了檢測高致病性豬藍耳病病毒(HPPRRSV)的熒光定量RPA方法。該方法最低可檢測到70個目的基因的重組質粒，平行檢測125份臨床樣品，熒光定量RPA與熒光定量PCR檢測結果敏感性和特異性分別為97.6%和100%。

2.5 豬流行性乙型腦炎

豬流行性乙型腦炎又名日本乙型腦炎，是由日本乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)引起的一種急性人獸共患傳染病。豬主要特征為高熱、流產、死胎和公豬睪丸炎。梁輝[15](2016)建立了JEV的RT-RPA-LFD的快速檢測方法，20～25min即可獲得穩(wěn)定、準確的檢測結果，具有耗時短、操作簡便、結果判定準確直觀的優(yōu)點，適合用于JEV現地檢測和在基層推廣應用。而且T-RPA-LFD檢測方法可以用于多種JEV分離株的檢測，方便攜帶，適用性強。

2.6 其他豬病

非洲豬瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)感染引起的家豬和野豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。臨床癥狀與豬瘟極其相似，以高熱、皮膚發(fā)紺、內臟器官嚴重出血、呼吸障礙和神經癥狀為主要特征。本病傳播快、致死率高，對養(yǎng)豬業(yè)危害巨大，是我國一類動物疫病和OIE規(guī)定的必須報告的動物疫病。王建昌等[16](2016)基于ASFV VP72基因保守序列設計并合成引物，建立了ASFV的RPA檢測方法，在38℃水浴鍋中恒溫反應30min，即可實現對目的片段的有效擴增，為ASFV的一線防控提供了一種新的、可靠的技術支持。

塞尼卡谷病毒(Seneca Valley Virus，SVV)又 稱 為 Senecavirus A(SVA)，是豬原發(fā)性皰疹病(Swine Idiopathic Vesicular Disease，SIVD)的主要病原，可感染豬，引起類似FMDV感染造成的水皰性病變。SVV感染豬群后，盡管不會造成與FMDV相同的較大政治、經濟損失，但所引起的水皰性病變與口蹄疫、豬水皰病、水皰性口炎、豬水皰疹等造成的病變相似，給臨床鑒別診斷造成了一定的困難。樊曉旭等[17](2017)利用RPA技術，針對SVV 3D基因設計引物和探針，建立了實時熒光RPA方法，在40℃、10min內檢測的最低濃度為28拷貝/μL。該等溫快速擴增方法為豬群出現水皰性疾病的鑒別診斷提供了技術支持，對及時采取適當防控措施具有重要意義。

3 前景與展望

我國養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模巨大，產值高，但是各種病害不斷出現，嚴重制約著我國畜牧業(yè)的健康發(fā)展。近些年來，隨著現代免疫學和分子生物學技術的不斷創(chuàng)新，動物病原的檢測方法取得了前所未有的發(fā)展，但各種方法或因成本過高難以推廣，或因靈敏度過低無法達到檢測要求，或因耗時耗力不實用。RPA結合了血清學和分子技術的優(yōu)點，并克服了兩種方法的缺點，是一種簡單、快速、性價比高的診斷工具，在動物疾病早期診斷、現地檢測、進出口快速檢疫等方面具有巨大的應用前景和市場[18～20]。以RPA技術為基礎建立的RPA-ELISA、on-chip RPA等擴增技術可以高通量自動化檢測多種病原體，提高檢測效率[21]。另外，RPA技術在癌癥突變檢測、遺傳病的定期和快速普查、動物食品安全衛(wèi)生、轉基因成分檢測等領域也具有廣闊的應用前景[22～25]。雖然目前RPA技術的檢測成本高于PCR等其他核酸擴增技術，但隨著RPA技術的進一步發(fā)展、完善以及生產工藝的改良，RPA技術有望成為常規(guī)的快速診斷手段，并在分子生物學、醫(yī)學、遺傳學等各個研究領域得到更加廣泛的應用。■

[1] Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, et al. DNA detection using recombination proteins[J]. PLoS biology, 2006,4(7):204.

[2] 徐潮.重組酶介導的等溫擴增技術在轉基因檢測中的應用[D].北京:中國農業(yè)科學院,2014.

[3] 景志剛,董浩,狄棟棟,等.重組酶聚合酶擴增技術研究進展[J].生物技術通報,2016,32(6):47~53.

[4] 吳耀東,徐民俊,鄭文斌,等.重組酶聚合酶擴增技術及其在動物病原快速檢測中的應用[J].中國獸醫(yī)學報,2016,36(10):1797~1802.

[5] 樊曉旭,哈登楚日亞,王英麗,等.塞尼卡谷病毒重組酶聚合酶擴增技術(RPA)實時熒光檢測方法的建立[J].中國動物檢疫,2017,34(8):81~86.

[6] 秦立得,南文龍,陳義平.重組酶聚合酶擴增技術及其在動物病毒病檢測中的應用[J].中國動物檢疫,2017,34(5):81~85.

[7] 孫魁,邢微微,徐東剛.重組酶聚合酶擴增技術的研究進展[J].軍事醫(yī)學,2015,39(10):802~804.

[8] Abd EWA, El-Deeb A, El-Tholoth M, et al. A portable reverse transcription recombinase polymerase amplifi cation assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus[J]. Plos One, 2013,8(8):71642.

[9] Amer HM, El-Wahed AA, Shalaby MA, et al. A new approach for diagnosis of bovine coronavirus using a reverse transcription recombinase polymerase amplifi cation assay[J]. J Virol Methods, 2013,193(2):337～340.

[10] 王洪梅,趙貴民,侯佩莉,等.口蹄疫病毒RPA-LFD現場快速檢測技術研究[A].中國畜牧獸醫(yī)學會生物技術學分會暨中國免疫學會獸醫(yī)免疫分會第十二次學術研討會論文集[C].昆明,2016.

[11] 楊洋,秦曉東,宋一鳴,等.口蹄疫病毒real-time RT-RPA檢測方法的建立與應用[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2017(9):172~176.

[12] Yang Y, Qin X, Zhang W, et al. Rapid and specifi c detection of porcine parvovirus by isothermal recombinase polymerase amplifi cation assays[J]. Molecular and Cellular Probes, 2016,30(5):300~305.

[13] Wang J, Wang J, Liu L, et al. Rapid detection of Porcine circovirus-2 by recombinase polymerase amplifi cation[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 2016,28(5):1~4.

[14] Yang Y, Qin X, Sun Y, et al. Rapid detection of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus by a fl uorescent probebased isothermal recombinase polymerase amplifi cation assay[J]. Virus Genes, 2016,52(6):883～886.

[15] 梁輝.流行性乙型腦炎RT-RPA-LFD檢測方法的建立與評價[D].廣州:華南農業(yè)大學,2016.

[16] 王建昌,王金鳳,劉立兵,等.非洲豬瘟病毒RPA等溫檢測方法的建立[J].中國動物檢疫,2016,33(7):78~81.

[17] 樊曉旭,趙永剛,李林,等.重組酶聚合酶擴增技術在疾病快速檢測中的研究進展[J].中國動物檢疫,2016,33(8):72~77.

[18] 董德榮.一種新型核酸恒溫擴增方法的研究及其在現場檢測中的應用[D].北京:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院,2016.

[19] 鄭文斌,吳耀東,馬劍鋼,等.重組酶聚合酶擴增技術及其在寄生蟲檢測中的應用[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2015,33(5):382~386.

[20] 高威芳,朱鵬,黃海龍.重組酶聚合酶擴增技術:一種新的核酸擴增策略[J].中國生物化學與分子生物學報,2016,32(6):627~634.

[21] 劉冬虹,王德蓮,郭燕華,等.重組酶聚合酶擴增技術的研究進展[J].檢驗檢疫學刊,2016,26(5):65~68.

[22] 陳斌,楊銀梅,鐘志敏,等.重組酶聚合酶等溫擴增快速檢測結核分枝桿菌[J].熱帶醫(yī)學雜志,2016,16(8):955~957.

[23] 郭燕華,陳遂,王德蓮,等.基于重組酶等溫擴增技術快速檢測生鮮肉中豬源性成分[J].食品安全質量檢測學報,2017,8(6):2012~2016.

[24] 任航.三種重要傳染病病原體重組酶擴增檢測技術的建立與應用[D].北京:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院,2016.

[25] 曹雪鋒,康曉平,李裕昌,等.五種出血熱病毒重組酶聚合酶等溫擴增方法的建立[J].解放軍醫(yī)學雜志,2017,42(6):526~531.