處理松材線蟲病疫木的木腐真菌篩選*

王旻嘉 葉建仁 涂煜昇 杜方平

(1.南京林業(yè)大學林學院 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210037；2.安徽金寨縣金山寨食(藥)用菌種植專業(yè)合作社 金寨 237300)

松材線蟲病(Bursaphelenchusxylophilus)又稱松樹萎蔫病(pine wilt disease,PWD)，是一種短時間內(nèi)就可導致松屬(Pinus)樹種大量萎蔫死亡的毀滅性病害，全球已有52個國家將其作為檢疫性病蟲害(Motaetal.，2009)。該病害起源于北美，目前分布于美國、加拿大、墨西哥、日本、韓國、中國、葡萄牙和西班牙等(Inacioetal.，2015；王曦茁等，2018)，對北美洲本土松種未造成明顯危害，對亞洲國家松樹危害最為嚴重(Alexanderetal.，2011)。1982年中國在江蘇南京首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲病(孫永春，1982)，其后病害不斷擴散蔓延。據(jù)國家林業(yè)和草原局2020年第4號公告，我國松材線蟲病疫區(qū)已有18個省(區(qū)、市)、666個縣級行政區(qū)、4 333個鄉(xiāng)鎮(zhèn)級行政區(qū)，1年內(nèi)新增85個縣級疫區(qū)，發(fā)生面積已超過110萬hm2(董瀛謙等，2020；潘佳亮等，2021)，中國已成為全球松材線蟲病發(fā)生最嚴重的地區(qū)。隨著疫情的發(fā)展，病害寄主植物、傳播媒介昆蟲和適生范圍都在不斷變化，病情呈現(xiàn)由點狀分布向片狀發(fā)展，逐漸向西向北呈現(xiàn)跳躍式擴散趨勢(程功等，2015；李曉冬等，2020)。2017年，疫情發(fā)生區(qū)域已突破年均10 ℃等溫線(理永霞等，2018)，紅松(Pinuskoraiensis)、落葉松(Larixspp.)成為病害新寄主，云杉花墨天牛(Monochamussaltuarius)成為松材線蟲病在我國北方森林的傳播新媒介(于海英等，2018；2019)。2019年，首次發(fā)現(xiàn)樟子松(P.sylvestrisvar.mongolica)自然感病(于海英等，2020)。全國6 000萬hm2松林正面臨著松材線蟲病嚴重威脅，防控形勢十分嚴峻。

人為因素造成疫木及其制品的擴散流通是導致我國疫情在短短四十年內(nèi)蔓延爆發(fā)的主要原因(潘宏陽，2007；葉建仁等，2012)。針對這一現(xiàn)狀，目前采取的主要防控措施包括檢疫與監(jiān)測、疫木除治和媒介昆蟲防治等，其中疫木除治是從源頭阻斷該病害傳播蔓延的關(guān)鍵環(huán)節(jié)(葉建仁，2019)。目前的疫木處理方法是就地粉碎或焚燒等(張麗榮等，2019；朱寧波，2019)，但依然還是存在著疫木就地除治比較困難、不徹底，造成環(huán)境污染等問題(鄭禮平，2017)，故亟待尋找更加高效環(huán)保的疫木除害新技術(shù)，從源頭上提高阻斷病害擴散蔓延的效率。

疫木是由木材、病原線蟲、媒介昆蟲、真菌、細菌等構(gòu)成的復雜的生物群落，木腐真菌作為群落中的分解者，具備在病死木上大量繁殖并通過分解木材實現(xiàn)物質(zhì)循環(huán)的能力。已有研究表明，一些木腐真菌對松材線蟲的生長和繁殖有較強的抑殺作用 (董錦艷等，2000；李玉中等，2020；徐紅梅等，2018；張建平等，2003)，但當前關(guān)于木腐菌作用于松材線蟲的研究大多處于室內(nèi)試驗階段，對松材線蟲病疫木的處理相關(guān)研究多針對疫木伐樁(陳瑤等，2008a)以及茯苓的疫木種植(吳云忠，2013)，直接針對伐倒木段除害的研究很少。前人利用菌袋培養(yǎng)菌種，培育耗時長且培養(yǎng)基成分要求高，成本昂貴，不適用于直接廣泛推廣。因此，尋找更多容易擴繁、定殖能力強、除害效果佳的木腐真菌，使其作用于疫木，改變病原線蟲的適生環(huán)境，減少疫木中松材線蟲數(shù)量，是實現(xiàn)疫木不下山，就地除治的可能突破口。本研究通過篩選具備處理松材線蟲病疫木潛力的木腐真菌，探究不同菌株的田間效果，為研發(fā)松材線蟲病疫木除治的新途徑提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于江蘇省鎮(zhèn)江市句容林場搖令口工區(qū)(119°12′E，32°05′N)，地處長江南岸，江蘇省西南部，屬亞熱帶季風氣候，四季分明，溫暖濕潤，雨量充沛，相對濕度76%，無霜期237天。年平均溫度15.4 ℃，年極端氣溫最高39.7 ℃，最低-13.1 ℃，年平均降水量1 106 mm。試驗所用疫木均為林區(qū)內(nèi)15年生當年枯死的松材線蟲病黑松(Pinusthunbergii)疫木。

1.2 供試材料

2019年4月從安徽省池州市九華山、江蘇省南京市中山陵、江蘇省鎮(zhèn)江市下蜀林場采集腐朽松木樣品，從中分離純化得到147個真菌菌株(編號以J、H、S開頭的菌株為分離自九華山樣品，編號以Z開頭的菌株為分離自中山陵樣品，編號以X、W開頭的菌株為分離自下蜀林場樣品)，保存于4 ℃冰箱備用。糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus)、硫磺菌(Laetiporussulphureus)來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，灰葡萄孢(Botrytiscinerea)來源于南京林業(yè)大學森林病理實驗室。試驗線蟲為南京林業(yè)大學森林保護實驗室保存的松材線蟲AMA3種群。

1.3 木腐真菌的室內(nèi)篩選

1.3.1 木質(zhì)纖維素降解菌的初步篩選 將腐朽松木樣品中分離得到的147個真菌菌株，打孔直徑5 mm菌塊分別接種到PDA-愈創(chuàng)木酚(0.04%)、PDA-苯胺藍(0.1%)和羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)平板上，各設置3個重復，在25 ℃恒溫暗培養(yǎng)5天，根據(jù)愈創(chuàng)木酚平板顯色圈和苯胺藍平板脫色圈大小，判斷各菌株木質(zhì)素降解能力。采用剛果紅染色法，測量羧甲基纖維素鈉平板菌落產(chǎn)生水解透明圈直徑與菌落直徑，根據(jù)比值大小判斷各菌株纖維素降解能力(孫思琦等，2020)。綜合3種選擇培養(yǎng)基測定結(jié)果，篩選出優(yōu)良木質(zhì)纖維素降解菌株。

1.3.2 松材線蟲平板繁殖量測定 將初步篩選出的木腐真菌接于PDA平板上，待菌株長滿平板，每皿接入2 000條松材線蟲，以灰葡萄孢菌作為陽性對照，每種真菌5皿重復。將供試蟲株AMA3與不同木腐真菌在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)8天后，采用貝爾曼漏斗法對平板中的松材線蟲進行分離，統(tǒng)計不同木腐真菌平板上松材線蟲的數(shù)量變化。

1.3.3 木腐真菌腐朽能力測定 木腐真菌腐朽能力測定方法參照GB/T 13942—2009《木材耐久性能第1部分:天然耐腐性實驗室試驗方法》和駱靜怡等(2015)方法加以改進：將黑松疫木段切割為2 cm×2 cm×2 cm木塊作為腐朽試驗試樣，稱量每塊木材樣品絕對干質(zhì)量(精確到0.01 g)。室內(nèi)條件下將無菌且具相同規(guī)格的黑松木塊接種至長滿木腐菌的廣口瓶中，每個廣口瓶接2個木塊，每個菌株設置3個重復，4個月后用毛刷和流水將木塊沖洗干凈，除去表面菌絲，放入(103±2)℃烘箱烘至恒質(zhì)量，計算不同真菌侵染下木塊的失重率，反映不同木腐真菌的木材腐朽能力。

式中，W1：試驗前木塊絕干質(zhì)量；W2：試驗后木塊絕干質(zhì)量。

1.4 木腐真菌田間接種試驗

參照蒙海勤等(2020)的方法加以改進，沿用液體PDA搖培菌絲接種方法。選擇當年感病松材線蟲病病死木，伐倒除側(cè)枝，鋸成75 cm長木段，每棵樹3～5個木段。將所有砍伐木段按粗細大小均勻分組并編號，放置于林地上備用。用35 mm鉆頭在木段上均勻打4孔作為接種點，孔深約55 mm。接種前噴灑75%乙醇消毒，每個孔接種50 mL液體菌絲，用液體PDA浸濕的棉花球蓋住孔口，透明塑料薄膜纏繞封口。試驗設置7個木腐菌處理組，1個空白對照組，每個處理12個木段(來自3～4棵黑松疫木)。處理4個月后在垂直于接種點平面的木段側(cè)面5點均勻鉆孔取樣，分析整段疫木內(nèi)部松材線蟲數(shù)量變化。取樣結(jié)束后用油鋸將75 cm木段橫向一分為二，將所有處理組及對照組的其中一半木段(長約37.4 cm)分別放入8個20目2 m×2 m鋼絲網(wǎng)罩中，扎絲封口，另一半木段置于網(wǎng)罩外。待天牛開始羽化，將8組網(wǎng)外木段縱向劈開找尋天牛蛹室，取天牛蛹室周圍0.5～1 cm木樣，分析蛹室周圍木樣內(nèi)松材線蟲數(shù)量。同時定期捕捉網(wǎng)罩內(nèi)羽化的天牛成蟲，分析天牛身上攜帶線蟲數(shù)量。

所有取回的木樣及天牛均通過貝爾曼漏斗法分離其中線蟲數(shù)量，Leica DM500顯微鏡下計數(shù)，并將漏完蟲的木樣置于(103±2)℃烘箱中烘至質(zhì)量恒定，稱量木樣絕干質(zhì)量，計算每克木樣中所含線蟲量。

1.5 優(yōu)良木腐真菌的初步鑒定

利用CTAB法提取優(yōu)良木腐菌株基因組DNA，選用真菌通用引物ITS1/ITS4進行PCR擴增ITS序列。用濃度為1%的瓊脂糖凝膠驗證PCR產(chǎn)物，驗證成功的產(chǎn)物由上海杰李公司測序。將測序序列在NCBI上進行BLAST比對。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用IBM SPSS Statistics 20軟件處理和分析數(shù)據(jù)，表格中計算結(jié)果均用mean±SEM表示，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)方法比較各處理間差異顯著性，GraphPad Prism 6.01軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效抑制疫木中松材線蟲繁殖的木腐真菌篩選

2.1.1 具有木質(zhì)纖維素降解能力的菌株篩選 147個真菌菌株中有12個真菌在愈創(chuàng)木酚平板上產(chǎn)生紅棕色氧化帶，9個真菌在苯胺藍平板上產(chǎn)生脫色圈，14個真菌在剛果紅羧甲基纖維素鈉平板上產(chǎn)生透明圈(表1)。其中菌株J5-2、J22、J46、H12、S4、S8、S14、W4、W15、X4、Z1、Z17、Z25在1種以上的選擇培養(yǎng)基中能表現(xiàn)出變色反應，說明這些菌株可以同時分泌多種木質(zhì)纖維素降解酶系，具有較好的分解木質(zhì)纖維素潛力。從單個培養(yǎng)基分析，在愈創(chuàng)木酚平板上菌株W15顯色能力最強，其次為菌株W4、J46、Z25。在苯胺藍平板上菌株Z43、S4、S8對苯胺藍的脫色能力與其他菌株相比具有顯著差異(P<0.05)。在羧甲基纖維素鈉平板上菌株S17、W15、H12產(chǎn)生水解圈與菌落直徑比值較大，說明菌株產(chǎn)生纖維素水解酶的含量較高。綜合3種選擇培養(yǎng)基變色反應結(jié)果，初步篩選Z1、Z17、Z25、Z43、J5-2、J22、J46、H12、S4、S8、S14、S17、X4、W4、W15共15個菌株進行下一步試驗。

表1 不同木腐真菌在選擇培養(yǎng)基上的變色反應①Tab.1 Color reaction of different wood rot fungi on the selected medium

2.1.2 具有抑制松材線蟲生長繁殖能力的菌株篩選 將篩選的15個木腐真菌及硫磺菌、糙皮側(cè)耳在PDA上培養(yǎng)成熟后，接入2 000條松材線蟲，另用灰葡萄孢作為陰性對照菌株，共培養(yǎng)8天后，統(tǒng)計分析松材線蟲在不同木腐真菌平板上的數(shù)量變化(圖1)。菌株H12和對照菌株灰葡萄孢上線蟲的繁殖量與其他菌株具有顯著差異(df=17，F(xiàn)=13.743，P<0.05)，松材線蟲在菌株H12平板上數(shù)量增多約52倍，達每皿(103 967±28 395)，在灰葡萄孢上增多約50倍，說明菌株H12能夠促進松材線蟲的大量繁殖，是室內(nèi)培養(yǎng)松材線蟲的潛力菌株，不適用于松材線蟲病的疫木處理。在菌株S17、Z43、Z17、S8、S14、J22、W4上松材線蟲數(shù)量增多，但顯著小于對照菌株灰葡萄孢，其余菌株松材線蟲數(shù)量均明顯減少。其中在J5-2菌落上培養(yǎng)8天后，平均每皿僅分離出18±10條線蟲，而在硫磺菌和糙皮側(cè)耳菌落上則完全分離不到松材線蟲。最終選擇在平板培養(yǎng)上能夠明顯抑制松材線蟲繁殖的9個菌株，即X4、Z1、W15、J46、S4、Z25、J5-2、硫磺菌、糙皮側(cè)耳等進行下一步試驗。

圖1 不同木腐真菌培養(yǎng)8天后松材線蟲的數(shù)量Fig.1 The number of B. xylophilus cultured by different wood rot fungi after 8 daysB. c:灰葡萄孢B. cinerea;L. s:硫磺菌L. sulphureus；P. o:糙皮側(cè)耳P. ostreatus.下同。* 表示差異顯著(P<0.05)，虛線代表初始線蟲量(2 000條)。* indicate significant difference among all treatments at 0.05 level,the dotted line shows the initial number of nematodes(2 000 pieces).The same below.

2.1.3 具備快速降解松木能力的木腐真菌篩選 將以上篩選出的9株木腐真菌進行松木試樣侵染試驗。由圖2可知，在9個菌株處理中，有8個處理黑松木塊的質(zhì)量損失與對照相比具有顯著差異(df=9，F(xiàn)=32.961，P<0.05)，其中硫磺菌降解松木的能力最強，侵染黑松4個月后木材試樣失重率達到22.82%，與其他處理相比差異顯著；其次是菌株S4，造成木塊質(zhì)量損失21.68%；菌株J5-2和X4分別使木塊質(zhì)量減少了17.45%和15.43%；菌株W15、Z25、糙皮側(cè)耳分別使木塊質(zhì)量減少了8.28%、6.76%和6.51%；菌株J46對木塊降解較少，木塊失重率為2.26%；而菌株Z1對木塊失重影響最小，與對照組無顯著差別。木材侵染試驗表明，硫磺菌、S4、J5-2、X4降解木材能力較強，菌株W15、Z25、糙皮側(cè)耳次之，菌株J46、Z1木材降解能力較弱。

圖2 木腐真菌接種后黑松木塊失重率Fig.2 Weight loss of Pinus thunbergii wood block after inoculation with wood rot fungi不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference among all treatments at 0.05 level．

綜合室內(nèi)篩選結(jié)果，選取具有抑制松材線蟲繁殖且具備較強松木降解能力的菌株X4、W15、S4、Z25、J5-2、硫磺菌、糙皮側(cè)耳進行野外接種試驗，進一步探究利用木腐菌株進行田間疫木除害的能力。

2.2 利用木腐真菌進行田間疫木處理的除害效果

2.2.1 接種木腐真菌120天后疫木內(nèi)松材線蟲數(shù)量的變化 將不同木腐真菌通過液體菌絲就地處理疫木4個月后，對比初始疫木線蟲量，8組疫木內(nèi)松材線蟲數(shù)量均減少。其中對照組減少39%，可能因松木樹皮脫落、水分流失等多種環(huán)境因素導致線蟲種群數(shù)量下降。由圖3可知，7個施菌處理組均可使松材線蟲數(shù)量降低65%以上，與對照組相比差異顯著(df=7，F(xiàn)=4.579，P<0.05)，其中菌株J5-2使疫木木段內(nèi)線蟲數(shù)量減少最多，減少率達79%，其次是硫磺菌和糙皮側(cè)耳，線蟲減少率分別為73%、72%；菌株X4、S4、Z25、W15使線蟲數(shù)量減少67%～70%。不同菌株處理4個月后疫木內(nèi)線蟲數(shù)量減少率均大于對照組，各菌株間差異不顯著(P>0.05)，不同處理組需取蛹室周圍木樣進一步探究其除害效果。

圖3 木腐真菌接種120天后疫木內(nèi)松材線蟲減少率Fig.3 Reduction rate of PWN in plague wood after inoculated with wood rot fungi for 120 days不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference among all treatments at 0.05 level．

2.2.2 疫木接菌處理對天牛蛹室松材線蟲數(shù)量的影響 2020年5月初，即試驗地天牛羽化初期，木腐真菌處理后蛹室線蟲數(shù)量變化率如圖4。由于天牛蛹期疫木內(nèi)擴散性松材線蟲具有向蛹室聚集的效應，未施菌對照組蛹室線蟲數(shù)量與初始量相比增加44%，而7種木腐真菌接種5個月后造成疫木內(nèi)蛹室周圍線蟲數(shù)量不同程度的消減。其中，菌株J5-2處理后疫木蛹室線蟲數(shù)量減少72%，其次為硫磺菌和菌株S4，蛹室周圍線蟲減少率分別達69%、68%。菌株W15、Z25、X4處理后蛹室線蟲數(shù)量分別降低37%、36%、32%，糙皮側(cè)耳使蛹室線蟲數(shù)量下降22%。

圖4 不同木腐真菌處理后疫木內(nèi)蛹室周圍松材線蟲數(shù)量變化Fig.4 Change in the number of PWN around pupal chamber after inoculating the plague wood with different wood rot fungiL. s:硫磺菌L.sulphureus；P. o:糙皮側(cè)耳P.ostreatus.

2.2.3 疫木接菌處理對羽化后的松墨天牛攜帶線蟲量的影響 試驗地5—6月為天牛羽化高峰期，在8組網(wǎng)罩中共捕捉214只松墨天牛成蟲，對天牛身體上的松材線蟲攜帶率及攜帶數(shù)量進行檢測。由表2可知，在未接菌的對照組疫木中羽化的松墨天牛，其攜帶松材線蟲的數(shù)量范圍為120～23 400條，平均每只天牛攜帶線蟲數(shù)量為(4 396±1 143)條，顯著高于施菌處理組(df=7，F(xiàn)=7.013，P<0.05)。菌株J5-2處理下疫木內(nèi)天牛平均攜帶線蟲數(shù)量以及天牛最高攜帶數(shù)量均最少，平均每只天牛攜帶(15±4)條，最高僅攜帶60條線蟲。其次是硫磺菌及菌株S4，平均攜帶線蟲量分別為每只(55±6)條、64±19條，3個菌株最高攜帶線蟲量均低于200條。7株木腐真菌處理疫木均能使疫木木段內(nèi)羽化天牛攜帶線蟲量顯著下降，且與疫木及蛹室周圍線蟲減少量統(tǒng)計結(jié)果一致，說明室內(nèi)篩選的不同木腐真菌處理可以消減疫木內(nèi)松材線蟲，進而減少天牛攜帶線蟲數(shù)量。

表2 不同真菌處理后疫木中羽化后的天牛上攜帶松材線蟲情況①Tab.2 The number of PWN carried by M. alternatus emergenced in plague wood after treated with different wood rot fungi

不同處理組與對照組天牛平均攜帶線蟲數(shù)量分布存在差異。由圖5可知，對照組和糙皮側(cè)耳處理組中存在3個極端異常值，除此之外對照組與各施菌處理組的平均數(shù)普遍高于其中位數(shù)，說明各組中均存在少數(shù)天牛攜帶線蟲數(shù)量較高的情況。根據(jù)箱型圖上下限分布可知，對照組天牛成蟲平均攜帶線蟲數(shù)量分布離散程度最高，中位數(shù)集中在900條。施菌處理組中除糙皮側(cè)耳外，其余6個菌株天牛成蟲平均攜帶線蟲數(shù)量上限值均低于600條，中位數(shù)低于300條。綜合分析，處理組中菌株S4、硫磺菌、菌株J5-2天牛平均攜帶線蟲數(shù)量最低，數(shù)據(jù)在均值上下集中分布，穩(wěn)定性高。

圖5 不同木腐真菌處理后天牛平均攜帶線蟲數(shù)量Fig.5 The average number of PWN carried by M. alternatus after inoculated with wood rot fungi “·”表示數(shù)據(jù)異常值；“+”表示數(shù)據(jù)平均值?！啊ぁ眎ndicate outliers,“+”indicates average value.

2.3 優(yōu)良木腐真菌的初步鑒定

結(jié)合室內(nèi)和田間試驗結(jié)果，將效果最優(yōu)菌株J5-2進行基因組測序，登陸NCBI數(shù)據(jù)庫，將測序拼接后的菌株J5-2序列進行Blast比對，結(jié)果顯示菌株J5-2與Ceriporia相似度最高，為100%，初步鑒定菌株J5-2為多孔菌科(Polyporaceae)蠟質(zhì)菌屬(Ceriporia)一種。

3 討論

本研究通過室內(nèi)試驗篩選出7株能夠有效降解松木并且抑制松材線蟲繁殖的木腐真菌，根據(jù)松材線蟲病流行規(guī)律，選擇病原及媒介天牛均處于病死木樹體中的最佳除害時期，即11月至翌年4月，人工接種優(yōu)良木腐真菌，使其在野外快速定殖并占據(jù)疫木內(nèi)微生物群落生態(tài)位，根據(jù)抑減疫木體內(nèi)松材線蟲的數(shù)量和松墨天牛成蟲的線蟲攜帶量，進一步驗證室內(nèi)篩選菌株的田間除害效果，為篩選松材線蟲病疫木處理潛力菌株提供了新的方法思路。

在平板抑蟲試驗中，松材線蟲在硫磺菌、糙皮側(cè)耳等菌株上完全不能存活，這與陳瑤等(2008a)、張建平等(2003)、向紅瓊等(2000)的試驗結(jié)果一致。蒙海琴等(2020)發(fā)現(xiàn)在茯苓的菌落上也完全分離不到松材線蟲。鄧習金等(2014)和陳瑤等(2008b)研究發(fā)現(xiàn)硫磺菌菌株對疫木伐樁具有較強的分解力和定殖力，并對伐樁中線蟲有抑殺作用。在本研究中，硫磺菌侵染松木試樣4個月后失重率達22.82%，顯著高于其他試驗菌株，且田間試驗結(jié)果表明，硫磺菌處理后疫木內(nèi)蛹室線蟲數(shù)量減少69%，羽化天牛平均攜帶線蟲數(shù)量少于100條，驗證了硫磺菌的良好田間應用潛力。在蒙海琴等(2020)的報道中，茯苓液體菌絲和固體菌劑接種150天后，分別可使疫木內(nèi)松材線蟲含量減少74.51%和65.78%。在野外接種1個月后，筆者發(fā)現(xiàn)硫磺菌接種點附近產(chǎn)生大量橘黃色孢子，菌絲體生長沒有J5-2菌株旺盛，硫磺菌在野外疫木環(huán)境中菌絲延伸能力沒有菌株J5-2強，從而導致田間效果不及菌株J5-2好。一些木腐真菌在室內(nèi)平板上雖具有抑殺線蟲的效果，但田間效果不理想，如糙皮側(cè)耳，其對松木的降解率僅為6.51%，田間試驗使蛹室線蟲數(shù)量減少22%。可能由于針葉樹大多具萜類及脂類等物質(zhì)，具有天然耐腐性，對木腐真菌的生長起強烈的抑制作用(Lahretal.，2013)，這也是許多闊葉樹上常見木腐真菌無法成功定殖在松屬植物上的原因，故前期菌株篩選工作可以從野外腐朽松木上分離能夠在松樹上定殖的木腐真菌，以達到預期的接種試驗效果。疫木中真菌的種類可以影響樹體中松材線蟲數(shù)量及天牛攜帶線蟲的數(shù)量(Maeharaetal.，2000；2002；鄭雅楠等，2014)，當適合于線蟲繁殖的真菌普遍存在時，會導致樹體中線蟲密度增加，更多的線蟲在蛹室周圍聚集，最終天牛攜帶的線蟲數(shù)量增加(Maeharaetal.，2005)，而當拮抗真菌占優(yōu)勢時，蛹室周圍線蟲密度下降，導致天牛攜帶的線蟲密度下降(Maeharaetal.，1997)。本研究證實接種不利于線蟲繁殖的木腐真菌并使其在疫木中大量定殖，能夠降低蛹室線蟲密度，從而使天牛攜帶線蟲數(shù)量明顯下降。研究表明，松墨天牛攜帶松材線蟲的密度決定病害的嚴重程度(Futai，2010)。當天牛攜帶10 000多條線蟲時，它們可以在5天內(nèi)將平均1 500條線蟲傳播到健康樹木的嫩枝上，而攜帶1 000～9 999條中等數(shù)量線蟲的天牛在傳播曲線的峰值平均傳播370條線蟲。當天牛攜帶不到1 000條線蟲，即使聚集到一棵樹上也無法致病(Togashi，1985；2014)。在早期的研究中，Hashimoto(1974)發(fā)現(xiàn)接種300條以上松材線蟲會導致8年生松樹發(fā)病，說明若天牛有效傳播300條線蟲到樹體即可致病。本研究除糙皮側(cè)耳菌株外，其余6個木腐真菌處理后的疫木中松墨天牛攜帶線蟲量范圍均低于1 000條，菌株J5-2、硫磺菌、S4處理組天牛攜帶線蟲數(shù)量均低于200條，說明3種木腐真菌具有疫木除害處理的潛力，施菌處理阻礙了疫木內(nèi)松材線蟲向媒介天牛聚集，減少了天牛攜帶線蟲量，從而降低松材線蟲向健康木上的傳播效率和可能性。由于真菌的生長受環(huán)境因素影響大，同時媒介天牛傳播松材線蟲具有累加效應，通常一棵樹會有幾只或幾十只天牛取食或產(chǎn)卵，實際防病效果還應該在林間應用后進行評估。

本研究中首次發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)菌屬Ceriporia真菌對松材線蟲繁殖有抑制作用，是處理松材線蟲病疫木的潛力菌株。對于優(yōu)良菌株在疫木中抑制線蟲的具體機制，其代謝產(chǎn)物是否影響線蟲與天牛間的化學信號的傳導以及不同木腐真菌混合接種的除害效果等一系列問題需要開展進一步的探究。此外，由于松材線蟲病疫區(qū)不斷向北遷移，木腐菌的實際應用需要考慮到施用菌株的低溫適應性。本研究林間試驗期間11月至翌年4月所在地平均溫度為11～13.3 ℃，需要篩選更多耐低溫的試驗菌株以保證在北部低溫地區(qū)也能夠具備良好的除疫效果。蒙海勤等(2020)的研究證實，液體搖培菌絲接種具備保濕性好、菌絲量大、成本低等特點，優(yōu)于固體菌絲(袋)接種。但前期準備液體菌絲工作量較大，今后可以針對具備林間應用潛力的菌株進行培養(yǎng)基優(yōu)化及菌劑開發(fā)，提高生物量，擴大林間接種量，促進菌絲向蛹室的延展，從而達到更好的除害效果。

4 結(jié)論

本研究中菌株J5-2(Ceriporiasp.)、硫磺菌和糙皮側(cè)耳等木腐菌對松材線蟲的抑制作用明顯，硫磺菌和菌株S4降解木材的能力強，菌株J5-2、硫磺菌、S4的林間效果最好，可使疫木中線蟲數(shù)量減低65%以上。利用木腐真菌是松材線蟲病疫木就地處理的有效途徑，值得繼續(xù)深入研究。