三維培養(yǎng)在腫瘤細胞生物學研究中的應(yīng)用

呂東來，陸林，盧虎生，徐秀理，胡宗濤

(解放軍第105醫(yī)院腫瘤診療中心，合肥 230031)

綜述

三維培養(yǎng)在腫瘤細胞生物學研究中的應(yīng)用

呂東來*，陸林，盧虎生，徐秀理，胡宗濤

(解放軍第105醫(yī)院腫瘤診療中心，合肥 230031)

近年來， 三維培養(yǎng)技術(shù)逐漸成為腫瘤細胞培養(yǎng)領(lǐng)域研究的熱點，其利用各種方法及材料， 在體外模擬體內(nèi)微環(huán)境培養(yǎng)細胞，使腫瘤細胞呈空間立體方式生長，表現(xiàn)出很多不同于傳統(tǒng)二維培養(yǎng)的特點。三維培養(yǎng)為深入研究腫瘤的細胞生物學特性，尤其是藥物敏感性這個轉(zhuǎn)化醫(yī)學的關(guān)鍵點提供了良好的平臺，有望成為生物醫(yī)學體外實驗中，傳統(tǒng)二維培養(yǎng)和動物實驗中的一個橋梁。本文綜述了近年來三維培養(yǎng)在腫瘤細胞生物學和藥敏試驗研究中的應(yīng)用和進展。

三維培養(yǎng)；腫瘤細胞生物學

腫瘤細胞培養(yǎng)是腫瘤細胞生物學研究的基礎(chǔ)技術(shù)之一。傳統(tǒng)的單層培養(yǎng)技術(shù)無法模仿體內(nèi)腫瘤的三維空間體系結(jié)構(gòu)，導致所培養(yǎng)的細胞在形態(tài)、增殖、細胞連接、信號轉(zhuǎn)導、分化等方面與體內(nèi)生長細胞存在諸多不同。為了更好的模擬體內(nèi)細胞的微環(huán)境，三維培養(yǎng)便在近年里走上了細胞生物學研究的舞臺[1]。

腫瘤細胞的三維培養(yǎng)屬于細胞生物學和組織工程學的交叉領(lǐng)域，它是傳統(tǒng)單層培養(yǎng)技術(shù)和腫瘤體內(nèi)實驗的一個橋梁。起初，人們對細胞三維培養(yǎng)的研究目的主要集中在體內(nèi)損傷組織的修復與替代重建方面[2]，但此后研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)三維培養(yǎng)狀態(tài)下的腫瘤細胞在細胞粘附、遷移、增殖和超微結(jié)構(gòu)等方面與二維培養(yǎng)的腫瘤細胞存在顯著不同[3]，因此本世紀初Weinberg等知名腫瘤生物學家開始強調(diào)三維培養(yǎng)腫瘤模型的重要意義[4]，越來越多的實驗中心也開始將三維細胞培養(yǎng)應(yīng)用在腫瘤基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，包括臨床前藥物體外篩選、腫瘤干細胞維持和分化、信號異常轉(zhuǎn)導等方面[5-7]。尤其在少見惡性腫瘤的臨床前藥敏試驗和藥物篩選中，利用三維細胞培養(yǎng)這種方法將有效的避免不必要的臨床I、Ⅱ期實驗，從而減少病人資源和后續(xù)研究資金的浪費[8]。本文按照三維培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展脈絡(luò)就目前腫瘤細胞體外三維培養(yǎng)的主要方法和其在抗腫瘤藥物研究中的作用做簡要綜述。

1 目前抗腫瘤藥物臨床前體外實驗方法的不足

目前抗腫瘤藥物體外實驗方法主要是由美國國家癌癥研究所（NCI）于上世紀八十年代創(chuàng)建的以檢測單層培養(yǎng)細胞對藥物的反應(yīng)來進行，但在臨床應(yīng)用中，常發(fā)現(xiàn)體外實驗敏感的藥物效果與患者體內(nèi)實體瘤臨床評估的藥效偏差較大[9]。既有研究表明，這至少部分是由于單層培養(yǎng)的體外細胞生長喪失了三維空間結(jié)構(gòu)，無法相對真實地反映體內(nèi)腫瘤細胞的病理生理結(jié)構(gòu)、生長狀態(tài)以及相對耐藥耐輻射的腫瘤干細胞水平[5,10]。如三維生長狀態(tài)下的肝腫瘤細胞可對治療耐受，且其耐藥特征與體內(nèi)實體瘤相似[11]。三維支架中生長的乳腺癌MCF-7細胞對內(nèi)分泌治療藥物他莫昔芬的抵抗力強于單層培養(yǎng)的腫瘤細胞[6]。 這些研究都反映出腫瘤細胞所處的微環(huán)境將顯著地改變藥物的效果，傳統(tǒng)的體外藥物篩選模型應(yīng)有所發(fā)展，應(yīng)用三維細胞培養(yǎng)來盡可能模擬腫瘤所處的內(nèi)環(huán)境并建立相應(yīng)體外研究平臺應(yīng)成為抗腫瘤藥物篩查研究的一個重要方向。

2 三維成球培養(yǎng)

2.1 靜止性懸浮成球培養(yǎng)

該方法是1992年由Reynolds BA等人在從鼠紋狀體進行神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)中發(fā)明的[12]，是目前為止應(yīng)用最為廣泛的細胞三維培養(yǎng)方法。該培養(yǎng)方法的主要特點是人為的創(chuàng)造無血清低粘附性的細胞生長環(huán)境，即：①應(yīng)用無血清、添加高濃度生長因子的培養(yǎng)液，生長因子根據(jù)不同的細胞系略有不同，如膠質(zhì)瘤干細胞的成球培養(yǎng)添加Vit-B27、EGF、bFGF；②應(yīng)用低粘附性培養(yǎng)皿，如在培養(yǎng)皿底部鋪1.5%的瓊脂糖，迫使細胞無法貼壁生長。這些細胞球依據(jù)不同的腫瘤類型和生長條件，其直徑可從20μm至1mm。人們在對其研究中發(fā)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)的腫瘤細胞球，在細胞形態(tài)、生長動力學特點、部分基因表達中展現(xiàn)了很多體內(nèi)實體瘤的細胞特點，而且腫瘤細胞球也普遍耐藥，無論是傳統(tǒng)化療藥還是單抗藥物[13,14]。目前，懸浮成球培養(yǎng)主要用來富集腫瘤干細胞亞群。在無血清的環(huán)境下，分化程度較高的細胞逐漸死亡，具備干細胞潛能的細胞才能長期生存增殖，經(jīng)過多次傳代之后，腫瘤干細胞得到純化富集[15]。有研究者認為細胞球耐藥性升高除了與藥物充分進入細胞球內(nèi)部困難外，還和腫瘤干細胞比例升高相關(guān)。

靜止性細胞懸浮成球培養(yǎng)的出現(xiàn)極大的拓展了腫瘤細胞三維培養(yǎng)的應(yīng)用與研究，其優(yōu)勢很明顯：①簡單易用，直觀地從細胞層面上體現(xiàn)了單個細胞在立體環(huán)境中的自我更新及分化能力；②能夠大量培養(yǎng)，方便進行高通量的藥物篩選研究[16]。但缺陷一樣明顯，最重要的就是仍與體內(nèi)環(huán)境大相徑庭。它懸浮生長，無法遷移運動，由單細胞分裂成球而來，無法體現(xiàn)細胞與基質(zhì)的作用，長期傳代成功率極低[17]，并且體內(nèi)腫瘤細胞也并非無法接觸血清。

2.2 液滴懸掛培養(yǎng)

該方法是將少量單細胞懸液滴于培養(yǎng)板上，然后利用微量液體與基質(zhì)表面的粘附力大于自身重力而不下墜，將培養(yǎng)板倒置，從而產(chǎn)生液滴，細胞便在在液滴尖端液氣交界處聚集，增殖并成球生長。該方法由Kelm在2003年發(fā)明[18]，它的優(yōu)點是操作簡便，有非常高的成球率，適用于絕大多數(shù)類型腫瘤細胞培養(yǎng)[17]。目前已有商業(yè)化的專用384孔液滴懸掛培養(yǎng)板[19]。但是它的局限性也很明顯：①液滴的體積上限一般為50μl，否則就會下墜，而推薦的培養(yǎng)體積僅10～20μl，這種情況下的細胞培養(yǎng)數(shù)量受限，往往難以超過500；②一旦開始培養(yǎng)則無法更換培養(yǎng)液，也難以在中途加藥。由于其固有的局限性，所以該方法在抗腫瘤藥物實驗中使用并不廣泛。

2.3 機械運動式培養(yǎng)

所謂機械運動式培養(yǎng)包含了攪拌式生物反應(yīng)器、旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器這兩種培養(yǎng)方法，其共有的特點是利用生物反應(yīng)器的機械運動使細胞運動懸浮而難以貼壁，從而成球生長。這種培養(yǎng)方式目前多結(jié)合微載體或者微囊，以增加細胞生長的效率，提高對細胞的保護[20]。其中，攪拌式生物反應(yīng)器的發(fā)明源于Sutherland上世紀70年代對于腫瘤細胞放療抵抗性的研究[21]，是最早的細胞成球培養(yǎng)方法，至今仍在使用。該培養(yǎng)法通過葉輪或槳式攪拌器的轉(zhuǎn)動來攪動培養(yǎng)液，流動的液體阻止了細胞貼壁粘附，也確保了氧氣和各種養(yǎng)分均勻分布，有利于細胞成球和新陳代謝。其不足之處在于攪拌過程中產(chǎn)生的泡沫及流體剪切力對細胞存在較明顯的損傷作用，但若攪拌速度過低則不利于氧氣和營養(yǎng)成分的擴散，且細胞容易貼壁。旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器由前者改良而來，它發(fā)明于1992年，設(shè)計初衷是利用培養(yǎng)器自身的水平旋轉(zhuǎn)，模擬微重力狀態(tài)，研究這種情況下的細胞生物學特性[22]?，F(xiàn)在該裝置也較廣泛的應(yīng)用于腫瘤細胞的三維培養(yǎng)。它較前者的優(yōu)點是可有效的降低流體剪切力帶來的細胞損傷，但仍然不能避免細胞與生物反應(yīng)器壁之間碰撞所造成的細胞機械性損害。

這兩種利用機械裝置的三維培養(yǎng)模型最大的優(yōu)點是能產(chǎn)生大量的均一性尚可的細胞球[23,24]，因此目前常用來進行大批量的細胞培養(yǎng)。但是它們的缺點也很突出：①培養(yǎng)后期，生物反應(yīng)器中的細胞易聚集沉積，不能支持高密度的細胞培養(yǎng)；②兩種反應(yīng)器都是特制的細胞培養(yǎng)裝置，使用成本較高；③培養(yǎng)、收集、加藥后檢測均需要額外的操作步驟，難以進行藥效作用動態(tài)性和及時性的觀測，所以不利于其在腫瘤藥敏試驗中發(fā)揮作用。

3 凝膠包埋培養(yǎng)

細胞成球培養(yǎng)方法雖各不相同，但最后形成三維結(jié)構(gòu)均是細胞球。然而懸浮的細胞球畢竟無法與基質(zhì)粘附，只能很局限的模擬體內(nèi)腫瘤細胞生長的部分微環(huán)境。而體內(nèi)腫瘤細胞是與其他細胞和細胞外基質(zhì)緊密連接的。因此隨著研究的深入，更先進的細胞三維培養(yǎng)方法也陸續(xù)出現(xiàn)了，其中之一便是凝膠包埋法。凝膠是一種具有高親水性的聚合物，細胞在凝膠中生長多自發(fā)形成球樣結(jié)構(gòu)，這時的球體除了細胞與細胞之間的粘附，還存在細胞與細胞外基質(zhì)的接觸，更加的接近體內(nèi)微環(huán)境。

3.1 膠原

膠原是目前用于細胞培養(yǎng)的凝膠中，應(yīng)用最廣泛的材料。作為細胞外基質(zhì)中最主要的成分之一，膠原對于絕大多數(shù)細胞都具有良好的生物相容性。最早應(yīng)用膠原是用來進行組織培養(yǎng)的。上世紀80年代，有人曾將切割后的腫瘤組織塊（直徑約1mm）包埋入膠原中進行培養(yǎng)，結(jié)果在幾個月后，腫瘤組織結(jié)構(gòu)和細胞活力仍保持良好[25]。此后亦有人將其應(yīng)用于腫瘤組織培養(yǎng)和藥敏測試，但類似研究數(shù)量很有限[26]。應(yīng)用膠原基質(zhì)凝膠進行腫瘤細胞三維培養(yǎng)最早見于乳腺癌細胞的研究，該研究發(fā)現(xiàn)凝膠中的癌細胞生長成類似體內(nèi)腫瘤才能形成的導管樣結(jié)構(gòu)[27]。亦有應(yīng)用膠原基質(zhì)進行不同腫瘤細胞系培養(yǎng)后藥敏作用觀測的，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細胞三維培養(yǎng)后抗藥性與單層培養(yǎng)的細胞存在明顯不同[28]。

3.2 藻酸鹽

藻酸鹽來源于褐藻的細胞壁成分，最早被提取出來時人們用其培養(yǎng)肝細胞，發(fā)現(xiàn)肝細胞可在其中生長并保持合成白蛋白的功能[29]，反映了其作為培養(yǎng)基質(zhì)對細胞功能的良好維持性。它最大的優(yōu)點是可在室溫成膠，這樣就允許細胞均勻的混入凝膠原液后無損的成膠生長。已有實驗用其進行腫瘤細胞三維培養(yǎng)的藥物檢測，實驗中發(fā)現(xiàn)多種人乳腺癌細胞系可在藻酸鹽凝膠中生長，形成獨立的細胞球，這些細胞相比單層培養(yǎng)的細胞具有更強的化療抵抗性[30]。

3.3 Matrigel

Matrigel是從Engelbreth-Holm-Swarm鼠肉瘤中提取得到的，成分復雜，包含膠原、層粘連蛋白和多種細胞因子與生長因子，可用于包括細胞三維培養(yǎng)、侵襲實驗和細胞分化等多種實驗[31]。當正常前列腺上皮細胞在其中生長時，細胞會成中空、腺泡樣結(jié)構(gòu)；而當前列腺癌細胞在其中生長時，則會形成實體的、紊亂的類球樣結(jié)構(gòu)[32]。另外，乳腺癌細胞的Matrigel三維培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，原本在單層培養(yǎng)中相互獨立的信號通路，卻在三維生長時相互調(diào)節(jié)[33]。該培養(yǎng)模型的缺陷主要是價格昂貴，且成分多樣，不同批次間成分比例不確定，所以較難廣泛用于藥物篩選實驗中。

現(xiàn)在隨著材料學的進展，新的凝膠培養(yǎng)基也開始出現(xiàn)。但總的來說，無論哪種凝膠，進行三維培養(yǎng)均能提供一個細胞生長的立體空間和重要的信號模擬，而且未來可根據(jù)所研究的不同腫瘤類型來從不同組織中提取相應(yīng)的細胞外基質(zhì)成分制備凝膠，以更好的模擬體內(nèi)情況。但是凝膠包埋培養(yǎng)也缺乏供細胞支撐的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)體系，所以腫瘤細胞在其中往往易聚集成球，較少擴散轉(zhuǎn)移生長。

4 三維組織工程支架培養(yǎng)

三維支架是隨著組織工程學的發(fā)展而出現(xiàn)的，它如同三維立體的“腳手架”，為體外細胞的三維生長提供支架，如同體內(nèi)的細胞外基質(zhì)，使細胞生長形成適宜的空間分布和細胞間聯(lián)系。目前可以應(yīng)用制備支架的材料有：①天然有機物：膠原、殼聚糖、葡萄糖氨基聚糖類（主要是透明質(zhì)酸）、絲心蛋白、瓊脂糖、藻酸鹽及淀粉（主要用來做添加劑）；②無機大分子化合物：聚乙醇酸（polyglycolic acid,PGA）、聚乳酸（polylactic acid, PLA）、聚已內(nèi)酯（polycaprolactone, PCL）、聚原酸酯（polyorthodester,POE）及它們之間的多相聚合物[34]。前者具有良好的生物相容性，后者雖無生物活性，但有更好的可加工調(diào)整性與可復制性。支架的制備要比凝膠復雜得多，而且為了細胞能良好的生長和實驗的可重復性，支架的孔隙、機械強度、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和降解系數(shù)都要求盡量能夠控制。目前制備支架的工藝主要有：電噴、冰凍干燥、溶劑澆鑄、形狀沉積制造、選擇性激光燒結(jié)、熔融沉積成型和3D噴印等多種方法[34]。其中后3種制備工藝均屬于3D打印技術(shù)，也將是未來精密支架制作的主要方法。

近年來，陸續(xù)有一些應(yīng)用支架進行三維腫瘤細胞培養(yǎng)的高水平研究見諸報道。Dhiman等人應(yīng)用殼聚糖支架培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細胞，發(fā)現(xiàn)細胞在支架上能很好的粘附并增殖，以此進行了對他莫昔芬的藥敏試驗，結(jié)果顯示支架上生長細胞的抗藥性是單層培養(yǎng)的10倍[6]。戴建武團隊應(yīng)用三維膠原支架進行了相同細胞系的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細胞在三維支架上生長的惡性表型的顯著增強，另外乳腺癌干細胞（CD44+/CD24-）的比例顯著增多，細胞成瘤能力明顯增強[5]。Mikos等人應(yīng)用PCL的三維支架培養(yǎng)尤文肉瘤細胞TC-71，結(jié)果顯示三維培養(yǎng)的腫瘤細胞在生長形態(tài)、增殖動力學和多種蛋白表達上都更貼近體內(nèi)培養(yǎng)的細胞，在IGF-1R和mTOR相關(guān)信號通路上與單層培養(yǎng)的細胞都有很大不同，且三維培養(yǎng)的細胞對表柔比星的抗藥性遠遠大于單層生長的細胞[7]。

5 三維培養(yǎng)技術(shù)在腫瘤基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用前景和未來發(fā)展方向

腫瘤細胞所處的三維微環(huán)境對細胞的重要作用已經(jīng)越來越受到學者的重視。從目前的技術(shù)進展來看，凝膠和三維支架，尤其是支架在模擬體內(nèi)腫瘤細胞三維空間結(jié)構(gòu)及所處生長環(huán)境中有一定的優(yōu)勢，相對來說能更真實地反映體內(nèi)細胞-細胞間和細胞-基質(zhì)間的相互作用。未來的發(fā)展趨勢包括：①應(yīng)用更先進的材料和加工科技，讓培養(yǎng)基質(zhì)的各項系數(shù)可控可調(diào)，依據(jù)不同的腫瘤類型和設(shè)定的研究目的來制備更加適合三維培養(yǎng)材料，比如研究骨轉(zhuǎn)移瘤時可考慮應(yīng)用降解系數(shù)低的支架，或者可在支架上添加所需的VEGF等生長因子，促進血管擬態(tài)及相關(guān)藥物的研究；②與不同類型的生物反應(yīng)器結(jié)合，如與灌流式生物反應(yīng)器結(jié)合，來解決三維培養(yǎng)中代謝產(chǎn)物或者藥物運動擴散受限的情況；③以此為平臺建立多種細胞共培養(yǎng)體系，如腫瘤細胞+免疫細胞+內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)等，以明確腫瘤細胞與基質(zhì)及其他相鄰細胞之間同時作用的影響。以上這些都將更好地模擬體內(nèi)腫瘤細胞真實的微環(huán)境情況，有助于我們得出更準確的科學結(jié)論。

三維細胞培養(yǎng)從單純的懸浮成球到現(xiàn)在復雜的組織工程支架培養(yǎng)，都在證明三維培養(yǎng)將在未來腫瘤細胞生物學體外實驗中起到越來越重要的作用，尤其在血管生成、干細胞培養(yǎng)以及以此為靶向的抗腫瘤藥物研發(fā)中有著獨特的優(yōu)勢，值得進行更深入的研究。

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Application of three-dimensional culture in tumor cell biology research

Lv Donglai*, Lu Lin, Lu Husheng, Xu Xiuli, Hu Zongtao
(Clinical Oncology Center, The 105 Hospital of The People’s Liberation Army, Hefei 230031, China)

In recent years, in vitro three-dimensional (3D) cell culture technology, which simulates in vivo microenvironment of tumor growth, has become increasingly popular in tumor cell biology research. 3D culture allows in vitro tumor cells to grow in all directions, therefore display different characteristics from the traditional two-dimensional (2D) culture. 3D cell culture provides a good platform for further study on cellular characteristics of tumor, especially on the key area of drug sensitivity in translational medicine,.It holds a great promise to bridge traditional 2D culture to animal experiments, which is essential to advance on tumor cells biology research. The recent progression and advances of 3D cell culture applications in tumor cell biology research and drug susceptibility test are reviewed in this paper.

Three-dimentional culture; tumor cell biology

R730.2

A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 05. 012

2017-04-25

2017-09-25

教育部腫瘤免疫病理學重點實驗室開放課題基金資助（2012jsz106）

呂東來，男（1981年），漢族，副主任醫(yī)師，博士

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：lvxunhuan@163.com