孢子絲菌相關(guān)復(fù)合種需加強(qiáng)生物安全檢控

黃夢(mèng)雅 周汛

(重慶市中醫(yī)院皮膚美容科，重慶 400021)

自然界真菌的物種數(shù)總數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)植物和脊椎動(dòng)物物種數(shù)的總和，較為保守的估計(jì)有150萬(wàn)種。作為真核生物內(nèi)的單系群，已合格發(fā)表的真菌總數(shù)約達(dá)1.8萬(wàn)屬、12萬(wàn)種[1]。這其中僅少數(shù)對(duì)人體有害，主要引起人體的淺表皮膚或深部真菌感染。作為我國(guó)的對(duì)內(nèi)對(duì)外門(mén)戶(hù)，國(guó)家進(jìn)出口檢疫部門(mén)對(duì)包括真菌在內(nèi)的各個(gè)物種進(jìn)行緊密、準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)，建立一個(gè)完善的真菌檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)生態(tài)安全和國(guó)民健康至關(guān)重要。

1 真菌命名及分類(lèi)的歷史與發(fā)展

真菌病原學(xué)的研究歷史悠久。發(fā)現(xiàn)、更新以及特異性鑒定與研究真菌新菌種為真菌感染性疾病制定防范方案、早期診斷以及研發(fā)特異性抗真菌藥物發(fā)揮了突出的作用。既往真菌病原學(xué)物種的鑒定及分類(lèi)命名主要依據(jù)損處組織塊或濃汁顯微鏡及電鏡檢查、培養(yǎng)觀察菌落形態(tài)、血清學(xué)、組織病理學(xué)以及免疫熒光染色等法，這些方法為我國(guó)乃至世界的真菌學(xué)分類(lèi)研究奠定了重要基礎(chǔ)。

但這些方法特異性不高，隨著20世紀(jì)90年代以來(lái)分子生物學(xué)在真菌研究上的飛速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，近20年來(lái)真菌學(xué)也有了突出的進(jìn)步，尤其是通過(guò)DNA序列的比較表明基于物種的形態(tài)識(shí)別往往低估了真菌的多樣性。此外，分子生物學(xué)和微生物學(xué)利用高通量測(cè)序的集體種作業(yè)方法可以更快速地鑒定菌種[2]。目前，真菌分類(lèi)已從既往的形態(tài)表型分類(lèi)向分子基因型分類(lèi)轉(zhuǎn)變，許多現(xiàn)有的真菌病原菌物種名稱(chēng)較以前發(fā)生了明顯的變化，部分菌種被重新命名，部分菌種新增了多個(gè)真菌署名[3]。以DNA序列數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的遺傳分類(lèi)學(xué)，較之形態(tài)學(xué)建立了一個(gè)更佳準(zhǔn)確、更為穩(wěn)定的真菌分類(lèi)平臺(tái)。

真菌分類(lèi)系統(tǒng)的變化大大沖擊了傳統(tǒng)的真菌分類(lèi)學(xué)，參考最近的分子系統(tǒng)發(fā)育分析，一個(gè)全面的系統(tǒng)分類(lèi)真菌王國(guó)已經(jīng)誕生，大量新的菌種、屬，甚至科、目等更高級(jí)、更廣泛的分類(lèi)級(jí)別將得到持續(xù)的改變與發(fā)展[3]。這為進(jìn)出境檢疫等非真菌學(xué)研究者的工作與研究帶來(lái)了不便。因此，新的真菌種名的不斷產(chǎn)生意味著檢疫系統(tǒng)新的物種檢測(cè)方法和重點(diǎn)需要持續(xù)性更新。

2 孢子絲菌分類(lèi)的變化

孢子絲菌屬存在于真菌界的子囊菌門(mén)，真子囊菌綱，長(zhǎng)喙殼菌目，長(zhǎng)喙殼菌科。它是一種雙相病原性真菌[4]，分為環(huán)境株和臨床株，在環(huán)境中主要存在于土壤及植物中[5]。1898年，孢子絲菌由美國(guó)人Shenk首次從該病患者患病組織中分離培養(yǎng)出來(lái)，被命名為申克孢子絲菌[6]。過(guò)去，申克孢子絲菌一直被認(rèn)為是孢子絲菌屬的唯一物種，申克孢子絲菌為孢子絲菌病的唯一致病菌種[7]。隨著近期分子生物學(xué)及真菌分類(lèi)研究的快速發(fā)展，目前的大量研究證實(shí)以前廣泛被認(rèn)可的孢子絲菌形態(tài)種其實(shí)是由申克孢子絲菌 (Sporothrixschenckii)、球形孢子絲菌 (Sporothrixglobos)、巴西孢子絲菌 (Sporothrixbrasiliensis，S.brasiliensis)、墨西哥孢子絲菌 (Sporothrixmexicana，S.mexicana)、白孢子絲菌 (Sporothrixpallida，S.pallida)、申克孢子絲菌盧艾里變種 (Sporothrixschenckiivarluriei，S.luriei)6個(gè)種組成的復(fù)合體[8]。

本文學(xué)者以核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (Ribosomal Internal Transcribed Spacer,ITS)序列聯(lián)合β微管蛋白 (β-tubulin)序列為引物對(duì)從我國(guó)孢子絲菌病人患處組織分離培養(yǎng)出的臨床菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)在GenBank中下載的孢子絲菌的基因序列，使用MEGA軟件與世界其他地區(qū)已發(fā)表的基因序列進(jìn)行對(duì)比，采用鄰接法 (Neighbor-Joining,NJ)進(jìn)行系統(tǒng)分析，系統(tǒng)樹(shù)各分支的置信度以1 000次自引導(dǎo)法 (Bootstrap)重復(fù)檢測(cè)，以通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析證實(shí)所鑒定的臨床株菌均為球形孢子絲菌[9-12]。此結(jié)果與我國(guó)其他學(xué)者以鈣調(diào)蛋白 (Calmodulin，CAL)或ITS基因序列為引物報(bào)道的文獻(xiàn)結(jié)論一致[13-15]。近期，已有我國(guó)學(xué)者報(bào)道利用ITS基因序列為引物鑒定為申克孢子絲菌感染的病例[16]。

3 傳入風(fēng)險(xiǎn)及潛在威脅

孢子絲菌分布于全球各地，危害甚廣，以熱帶和亞熱帶地區(qū)為主[17]。申克孢子絲菌的感染和分布表現(xiàn)出一定的全球性，在歐洲、美洲、非洲、亞洲均有被發(fā)現(xiàn)[4]，球形孢子絲菌的感染主要流行在亞洲、歐洲、美洲[15]，巴西孢子絲菌在巴西區(qū)域性分布[18]，墨西哥孢子絲菌主要分布于墨西哥[19]，僅有極少數(shù)臨床盧艾里孢子絲菌感染被報(bào)道[20]，而白孢子絲菌暫未被發(fā)現(xiàn)人畜感染[21]。大量分子生物學(xué)研究證實(shí)，我國(guó)目前僅發(fā)現(xiàn)球形孢子絲菌及申克孢子菌，而其他復(fù)合種在全球分布較廣，而目前在我國(guó)沒(méi)有報(bào)道[10,16]。

人們通常因外傷后接觸被孢子絲菌污染的植物、土壤或呼吸道吸入該菌而致病，故感染者以園藝工作者、農(nóng)民為主，該菌也可感染狗、貓等動(dòng)物[22]。孢子絲菌傳播途徑眾多，可在環(huán)境中潛伏，為人獸共患性真菌，各復(fù)合種間形態(tài)差異不大，而在遺傳學(xué)上有較大差異。通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、表型生長(zhǎng)鑒定等方法，孢子絲菌各菌種在地域分布、臨床出現(xiàn)頻率及表現(xiàn)、致病性、對(duì)藥物的敏感性均表現(xiàn)出明顯差異。小鼠模型研究表明，不同孢子絲菌基因型的毒力、致病性不同導(dǎo)致孢子絲菌臨床類(lèi)型的不同[23]。其中，巴西孢子絲菌和申克孢子絲菌為最致命的物種，致死率及播散率最強(qiáng)，之后依次是球形孢子絲菌墨西哥孢子絲菌，白孢子絲菌毒力最弱[24]。孢子絲菌不同復(fù)合種之間存在藥物敏感性顯著差異，巴西孢子絲菌對(duì)抗真菌藥物最敏感，最不敏感的是墨西哥孢子絲菌[25]。近幾年，孢子絲菌病的發(fā)病率及死亡率逐年上升。該病可引起深部及播散性真菌感染，極易誤診漏診，且敏感抗真菌藥物種類(lèi)少，治療時(shí)間長(zhǎng)，藥物副作用大，極大危害人類(lèi)及動(dòng)物健康。

真菌進(jìn)出口檢疫工作是一種國(guó)家主權(quán)行為，它是一項(xiàng)嚴(yán)謹(jǐn)且科學(xué)技術(shù)含量高的工作，其屬于國(guó)家動(dòng)植物檢疫工作。該項(xiàng)工作的主要目的是為防止危害包括人在內(nèi)的動(dòng)植物得病、蟲(chóng)、雜草及其他有害生物由國(guó)內(nèi)傳出或者由國(guó)外傳入，以預(yù)防該國(guó)家區(qū)域內(nèi)發(fā)生較大規(guī)?；蛘邚V泛傳播蔓延的生物入侵。既往受鑒定方法的限制，我國(guó)孢子絲菌病患者的病原體均且僅鑒定為申克孢子絲菌[26]，故認(rèn)為申克孢子絲菌為我國(guó)既有真菌，未將其納入檢疫重點(diǎn)。隨著孢子絲菌復(fù)合種的發(fā)現(xiàn)及深入研究，孢子絲菌的物種分類(lèi)系統(tǒng)已經(jīng)重建，由于孢子絲菌可通過(guò)土壤及植物傳播，國(guó)外已有報(bào)道巴西孢子絲菌等各復(fù)合種可引起人或動(dòng)物大面積傳播感染[27]。由于目前缺乏特異性診斷及檢測(cè)方法，復(fù)合種其他病原菌一旦傳入我國(guó)可能會(huì)造成較大面積的傳播及感染，有較大風(fēng)險(xiǎn)，為提高海關(guān)監(jiān)管的針對(duì)性，維護(hù)區(qū)域性進(jìn)出口秩序，保障和保護(hù)人民身體健康及環(huán)境安全，加強(qiáng)非本土孢子絲菌菌種傳入對(duì)我國(guó)乃至世界的國(guó)家檢疫性工作具有重要意義，故需要國(guó)家檢疫加強(qiáng)監(jiān)管及檢測(cè)，加強(qiáng)海關(guān)監(jiān)管以避免傳入我國(guó)。

4 生物安全監(jiān)測(cè)監(jiān)管建議

隨著經(jīng)濟(jì)、文化、學(xué)術(shù)交流的不斷全球化，各國(guó)之間的往來(lái)逐漸緊密頻繁，這揭示著我國(guó)的進(jìn)出口檢疫工作量將不斷增加。孢子絲菌來(lái)源于自然環(huán)境[28]，它不僅存在于自然環(huán)境，也可引起人獸共患，作為未被列入檢疫名錄的有害生物，若不進(jìn)行嚴(yán)格的檢疫和防范措施，其他復(fù)合種的傳入可引起嚴(yán)重的危害。

目前，多基因系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展已可以穩(wěn)定的分類(lèi)鑒定出孢子絲菌復(fù)合種，但國(guó)內(nèi)僅有少數(shù)幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展過(guò)相關(guān)研究并具備識(shí)別區(qū)分這些物種的技術(shù)能力，且這些技術(shù)還處在"實(shí)驗(yàn)室及臨床探索"階段，暫未普及，海關(guān)監(jiān)測(cè)相對(duì)薄弱，因此應(yīng)盡快建立多基因識(shí)別技術(shù)體系幫助口岸部門(mén)具備相應(yīng)的識(shí)別能力，同時(shí)積極研發(fā)特異性檢測(cè)方法以高效、快速識(shí)別復(fù)合種菌株。同時(shí)，我國(guó)邊境檢疫部門(mén)應(yīng)對(duì)孢子絲菌模式菌株標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)一收集、管理、評(píng)估，以方便工作人員在實(shí)際工作過(guò)程明確檢疫對(duì)象。對(duì)于已經(jīng)在環(huán)境及臨床中發(fā)現(xiàn)的孢子絲菌菌株，需定期追蹤相關(guān)信息。

綜上所述，在真菌分類(lèi)學(xué)日新月異發(fā)展的今天，真菌的檢疫也需要及時(shí)、規(guī)范地進(jìn)行更新、調(diào)整以適應(yīng)時(shí)代的需求。我國(guó)海關(guān)應(yīng)及時(shí)建立孢子絲菌復(fù)合種參考菌株及參考序列的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，參考多基因鑒別孢子絲菌復(fù)合種的標(biāo)準(zhǔn)方法及檢疫菌物的行業(yè)規(guī)范等以幫助口岸檢疫部門(mén)迅速建立對(duì)孢子絲菌的檢測(cè)監(jiān)測(cè)能力。

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