分子生物學(xué)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)領(lǐng)域中的研究進(jìn)展

沈 泓，李 超，李 玨

（浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310052）

分子生物學(xué)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)領(lǐng)域中的研究進(jìn)展

沈 泓，李 超，李 玨

（浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310052）

近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因食品也隨之快速發(fā)展起來，但轉(zhuǎn)基因食品在為人類帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，也存在著安全隱患。因此，高效、便捷的轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)顯得至關(guān)重要。文章從基因水平、蛋白質(zhì)水平兩個(gè)方面，介紹了多種轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)，并對(duì)這些方法的基本原理、優(yōu)缺點(diǎn)及存在的問題等方面進(jìn)行了具體分析。

轉(zhuǎn)基因食品 檢測(cè) 基因 蛋白質(zhì)

轉(zhuǎn)基因食品（Genetically Modified Food）是指利用基因工程手段，將一些有利于人類生產(chǎn)的外源基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物、植物或者微生物中，改變其遺傳特性，從而獲得原物種所不具備的性狀、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、品質(zhì)特征[1]。因此，轉(zhuǎn)基因食品又可分為轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因微生物食品[2]。從1983年P(guān). Zambryski等用T載體將外源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞基因組從而得到第一株轉(zhuǎn)基因植物以來[3]，轉(zhuǎn)基因食品的研究與應(yīng)用越來越受到關(guān)注。轉(zhuǎn)基因油菜、玉米、棉花、南瓜等幾十個(gè)農(nóng)作物品種被相繼開發(fā)，這些轉(zhuǎn)基因作物具有抗除草劑、抗蟲、抗病毒等多種不同性狀的外源基因[4]。

然而，雖然轉(zhuǎn)基因食品的逐漸商業(yè)化為滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的物質(zhì)需求提供了新的途徑，但轉(zhuǎn)基因食品在食用安全性、對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響等方面一直頗受爭(zhēng)議[5]。轉(zhuǎn)基因食品是利用基因工程改變?cè)锓N遺傳物質(zhì)的新技術(shù)，轉(zhuǎn)基因過程中的各個(gè)環(huán)節(jié)都有可能產(chǎn)生安全隱患[6]，例如經(jīng)過DNA重組后的物種可能會(huì)合成具有毒性的蛋白質(zhì)；轉(zhuǎn)基因物種所表達(dá)的蛋白可能會(huì)影響人的免疫系統(tǒng)等。我國(guó)是轉(zhuǎn)基因作物種植大國(guó)，種植面積位居世界第六。同時(shí)，我國(guó)也是轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)口大國(guó)，研究顯示我國(guó)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆累計(jì)達(dá)2億t，市場(chǎng)上70%的豆制品中含有轉(zhuǎn)基因成分[7]。因此，建立高效、快速、準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因食品定性、定量檢測(cè)方法，是滿足廣大消費(fèi)者知情權(quán)和選擇權(quán)的需要，更是加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因食品安全監(jiān)管的重要技術(shù)支撐[8]。該文主要對(duì)目前分子生物學(xué)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)闡述。

1 基因水平的檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指通過基因工程手段對(duì)生物體內(nèi)DNA分子進(jìn)行修飾改造從而改變?cè)锓N遺傳性狀?；蛩降臋z測(cè)主要是利用PCR法、分子雜交、基因芯片等方法檢測(cè)遺傳物質(zhì)中是否存在外源基因[9]。

1.1 基于PCR的檢測(cè)方法

1.1.1 定性PCR法

為了使外源基因能被順利轉(zhuǎn)入宿主體內(nèi)并有效地表達(dá)，轉(zhuǎn)基因一般需要構(gòu)建啟動(dòng)子、終止子、選擇性標(biāo)記基因、報(bào)告基因[10]，其中啟動(dòng)子和終止子是目的基因表達(dá)必不可少的序列。據(jù)研究，絕大部分轉(zhuǎn)基因作物含有啟動(dòng)子CaMV 35S、終止子NOS和抗性基因NPTII3這3個(gè)基因元件。針對(duì)啟動(dòng)子、終止子、選擇性標(biāo)記基因等設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增這些序列，可鑒定出食品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分[5]。國(guó)內(nèi)，倪賢生等利用花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子和根瘤農(nóng)桿菌NOS終止子設(shè)計(jì)了特異性引物對(duì)35S、NOS，以PCR擴(kuò)增技術(shù)成功檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因大豆。國(guó)外，Shirai等[11]用該方法成功檢測(cè)了抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因大豆Rounfup Ready。但定性PCR法只是對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的初步檢測(cè)，某些植物或土壤微生物中也會(huì)含有CaMV 35S和NOS基因元件，因此該方法有假陽性的可能。

1.1.2 多重PCR法

多重PCR技術(shù)，又稱復(fù)合PCR技術(shù)，是1種在1個(gè)PCR反應(yīng)體系中加多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶序列的技術(shù)。常規(guī)PCR技術(shù)由于受到引物的限制，1次只能檢測(cè)1個(gè)目的片段，如需要檢測(cè)多個(gè)目的片段則需要進(jìn)行多次PCR檢測(cè)。而多重PCR法可通過1次擴(kuò)增，檢測(cè)多個(gè)靶基因片段，相較于常規(guī)PCR法既節(jié)約成本，又大幅提高檢測(cè)效率，其檢測(cè)效果也更為可信[12-13]。目前多重PCR技術(shù)已用于多個(gè)轉(zhuǎn)基因作物品種的檢測(cè)，且隨著對(duì)定量檢測(cè)的需求，該技術(shù)也被發(fā)展用于定量檢測(cè)。2005年，Hiroshi Akiyama等[14]成功將多重定量PCR技術(shù)應(yīng)用于擁有不同性狀的轉(zhuǎn)基因玉米的檢測(cè)。張平平等[15]以大豆外源凝集素基因和肌動(dòng)蛋白基因作為內(nèi)部對(duì)照以評(píng)價(jià)多重PCR反應(yīng)的效率，結(jié)果顯示當(dāng)轉(zhuǎn)基因大豆含量?jī)H為0.15%時(shí)，仍可以對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行可靠的鑒定。

1.1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR在常規(guī)PCR法的基礎(chǔ)上增加了一條帶有熒光基團(tuán)的探針，其5’端帶有1個(gè)報(bào)告基團(tuán)，3’端帶有1個(gè)淬滅基團(tuán)。反應(yīng)開始時(shí)，探針結(jié)合在目的基因上；隨著擴(kuò)增鏈的形成，DNA聚合酶將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增1條DNA鏈，就有1個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，從而對(duì)反應(yīng)管中的熒光度進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，確定反應(yīng)出的DNA的量，然后通過計(jì)算機(jī)程序?qū)Λ@得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理來給出樣品中DNA的量[16]。蔡慧農(nóng)等[17]將TaqMan探針應(yīng)用于熒光定量PCR，成功建立了轉(zhuǎn)基因大豆和轉(zhuǎn)基因玉米的TaqMan-熒光定量PCR檢測(cè)方法。熒光定量PCR法具有污染風(fēng)險(xiǎn)小、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。但該方法設(shè)備昂貴，單次檢測(cè)成本相對(duì)較高[18]。

1.2 基于基因芯片的檢測(cè)方法

基因芯片（Gene chip）又稱DNA微陣列（DNA microarray），是一種將大量帶有標(biāo)記的基因寡核苷酸探針按特定排列方式固定于尼龍膜、硅片、玻璃等載體之上[19]，可與靶基因片段進(jìn)行分子雜交，并通過掃描儀系統(tǒng)）檢測(cè)分子雜交信號(hào)強(qiáng)度，然后以計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)信號(hào)進(jìn)行綜合分析，即可獲得樣品中大量基因序列及表達(dá)信息，以對(duì)其進(jìn)行定性及定量[5]。在食品安全領(lǐng)域，基因芯片技術(shù)主要被應(yīng)用于食源性致病微生物快速檢測(cè)和轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)。黃文勝等[20]根據(jù)目前油菜種所轉(zhuǎn)入的外源基因，以CaMV35S啟動(dòng)子、FMV35S啟動(dòng)子、Nos終止子、Bar、Barnase、Barstar、EPSPS、GOX、PAT和內(nèi)源基因Fbp等為靶序列，設(shè)計(jì)特異性引物和探針，并制備相應(yīng)的基因芯片，結(jié)合多重PCR技術(shù)用來檢測(cè)油菜樣品中所含的外源基因，1次可同時(shí)檢測(cè)10個(gè)基因，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

2 蛋白質(zhì)水平檢測(cè)

生物遺傳信息的傳遞是遵循“中心法則”的，遺傳信息由DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，再通過RNA在核糖體中的翻譯合成對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)，用以維持生物體各項(xiàng)生理功能。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的目的是通過改變生物體DNA，使其表達(dá)人們所期望的特異蛋白質(zhì)。因此，針對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中外源基因所表達(dá)的特異性蛋白進(jìn)行檢測(cè)，也可準(zhǔn)確的鑒定出轉(zhuǎn)基因成分。目前，蛋白質(zhì)水平上用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的方法主要有Western印跡法、酶聯(lián)免疫吸附法、試紙條法、蛋白質(zhì)芯片等。

2.1 Western印跡法

蛋白質(zhì)印跡法與分子雜交原理相似，是一種結(jié)合電泳分離、特異性抗體、顯色酶促反應(yīng)的技術(shù)，能夠從相對(duì)復(fù)雜的混合物中檢測(cè)出特異性蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)印跡法主要是從待測(cè)樣本中提取總蛋白，經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白質(zhì)按分子質(zhì)量大小分離后，將其轉(zhuǎn)移到固相支持物（硝酸纖維膜或尼龍膜）上，用同位素標(biāo)記的抗體作為探針進(jìn)行雜交，再通過放射性顯影技術(shù)檢測(cè)出食品中的轉(zhuǎn)基因成分[5]。該技術(shù)目前已被用于致病菌、轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)領(lǐng)域，利用該方法可從植物細(xì)胞總蛋白中檢測(cè)出50 ng的特異性蛋白質(zhì)，若總蛋白純度高可檢出1～5 ng[1]。據(jù)報(bào)道，蛋白質(zhì)印跡法成功檢測(cè)了Roundup Ready大豆中的CP4合成酶，且檢測(cè)限達(dá)到了0.5%～1.0%[21]。但蛋白質(zhì)印跡法操作過程復(fù)雜，操作時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致該技術(shù)無法成為一種高效的轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)方法。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附法又稱為酶標(biāo)法，是在免疫酶基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型免疫檢測(cè)技術(shù)，它將抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機(jī)地結(jié)合了起來。ELISA的基本原理是用固相載體吸附檢測(cè)樣品和抗體或抗原，將其與相應(yīng)的美標(biāo)抗體或抗原進(jìn)行特異性反應(yīng)形成抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入酶底物后發(fā)生顯色反應(yīng)，待測(cè)抗原的量與顯色產(chǎn)物成正比，因此可通過分析有色產(chǎn)物的量確定樣本中待測(cè)物的含量[22]。ELISA技術(shù)要求低，操作簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，已發(fā)展成為1種應(yīng)用廣泛的檢測(cè)技術(shù)手段。目前在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)領(lǐng)域，已有多種商業(yè)化ELISA檢測(cè)試劑盒。但ELISA技術(shù)也有其缺點(diǎn)，就是檢測(cè)通量低，且1種試劑盒一般只可檢測(cè)1種特定的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，檢測(cè)成本相對(duì)較高[8]。

2.3 蛋白質(zhì)芯片

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在原理上與基因芯片技術(shù)大致相同，將蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑或檢測(cè)探針以陣列形式固定在玻片、硅片、纖維膜等固相載體上，將從待測(cè)樣品中提取的總蛋白與蛋白芯片進(jìn)行孵育反應(yīng)，帶有熒光標(biāo)記的靶蛋白分子與芯片中的分子發(fā)生特異性反應(yīng)，通過對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，可判斷食品中是否含有待檢的目標(biāo)蛋白及其含量，由此推斷食品中是否含有該蛋白對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因成分及其含量[5]。汪琳等[23]建立了1種抗體蛋白芯片檢測(cè)方法，可同時(shí)檢測(cè)BT Cry1Ac 蛋白、植酸酶蛋白、BT Cry1Ah 蛋白的這3種轉(zhuǎn)基因成分。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)有著特異性強(qiáng)、檢測(cè)效率高的優(yōu)點(diǎn)，但也有著一些需要解決的問題，如芯片制造成本相對(duì)較高，固定于載體表面特異外源蛋白容易失活，靈敏度低等。

2.4 試紙條法

試紙條法主要是將特異性抗體交聯(lián)到試紙條和顯色物質(zhì)上，當(dāng)試紙條上的特異性抗體與抗原物質(zhì)結(jié)合后再與帶有顯色物質(zhì)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，形成雙抗夾心結(jié)構(gòu)并在紙上顯色，若不含有抗原則不顯色。可根據(jù)轉(zhuǎn)基因食品中所包含的外源性蛋白設(shè)計(jì)相應(yīng)抗原，制備檢測(cè)試紙條。該法操作簡(jiǎn)便，成本低廉，且不需要儀器設(shè)備，非常適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。但試紙條法也存在著些許不足，如檢測(cè)靈敏度低，當(dāng)轉(zhuǎn)基因食品中外源基因表達(dá)量低時(shí)，無法進(jìn)行有效檢測(cè)；經(jīng)過加工的轉(zhuǎn)基因食品其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)容易受到破壞，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[24]。

3 結(jié)語

隨著基因工程的快速發(fā)展，越來越多轉(zhuǎn)基因食品流入市場(chǎng)，轉(zhuǎn)基因食品在滿足各種特定需求的同時(shí)，其安全性也越來越受到人們關(guān)注。對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行有效標(biāo)識(shí)和合理監(jiān)管的前提就是要對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行有效檢測(cè)。因此，建立起快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、高效的、適用性廣的轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)至關(guān)重要。核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)是特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品的理想物質(zhì)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)也有了極大的發(fā)展。除了該文介紹的技術(shù)，還有許多從分子水平出發(fā)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的新技術(shù)，如巢式和半巢式PCR[25]、生物傳感器技術(shù)[26]、PCR-ELISA法[27]、免疫PCR法[28]等。轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)方法多種多樣，但所有的方法都各有優(yōu)缺點(diǎn)，需要不斷完善和改進(jìn)。隨著技術(shù)的進(jìn)步，會(huì)有更多先進(jìn)的轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)出現(xiàn)。

[1] 顧愛國(guó)，王偉，張曉強(qiáng)，等．轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，（3）：180～183

[2] 國(guó)家安全生產(chǎn)監(jiān)督管理局．農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例．中國(guó)種業(yè)，2002，13（3）：38～39

[3] Zambryski P，Joos H，Genetello C，Leemans J，Montagu MV，Schell J．Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity．Embo Journal，1983，2（12）：2143～2150

[4] 霍飛，江國(guó)虹，常改．轉(zhuǎn)基因食品的發(fā)展現(xiàn)狀及安全性評(píng)價(jià)．中國(guó)公共衛(wèi)生，2003，19（9）：1132～1134

[5] 王勇，陳定虎，張輝玲．分子生物學(xué)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中的應(yīng)用．廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，（2）：97～100

[6] 鄭云雁，李小芳．轉(zhuǎn)基因食品及其衛(wèi)生管理（綜述）．中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，1998，（5）：36～39

[7] 卓曼熙．轉(zhuǎn)基因食品安全認(rèn)知調(diào)查報(bào)告．科研，2016，（8）：00115～00116

[8] 王廣印，范文秀，陳碧華，等．轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展．主要檢測(cè)技術(shù)及其特點(diǎn)．食品科學(xué)，2008，29（10）：698～705

[9] 陳軍紅，牛智光．簡(jiǎn)述轉(zhuǎn)基因食品的分析檢測(cè)技術(shù)．科研，2016，（11）：00174～00174

[10] Murphy DJ，Partridge M．Detection of genetically modified soya in a range of organic and health food products．British Food Journal，2004，106（3）：166～180

[11] Shirai N，Momma K，Ozawa S，Hashimoto W，Kito M，Utsumi S，Murata K．Safety Assessment of Genetically Engineered Food：Detection and Monitoring of Glyphosate-Tolerant Soybeans．Bioscience Biotechnology & Biochemistry，1998，62（7）：1461～1464

[12] 曹澤虹，高明俠．轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)方法．中國(guó)食品添加劑，2005，35（4）：100～105

[13] 周少蕓．轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)方法的研究進(jìn)展．福建稻麥科技，2007，25（1）：43～45

[14] Hiroshi Akiyama，， ，Takahiro Watanabe， ，Kaoru Wakabayashi，Shinsuke Nakade，Shuji Yasui，Kozue Sakata，Ryoko Chiba，F(xiàn)rank Spiegelhalter，Akihiro Hino A，Maitani?T．Quantitative Detection System for Maize Sample Containing Combined-Trait Genetically Modified Maize．Analytical Chemistry，2005，77（22）：7421～7428[15] 張平平，劉憲華．多重PCR方法對(duì)大豆轉(zhuǎn)基因食品的定性檢測(cè)．食品科學(xué)，2004，25（11）：227～230

[16] 李娜，周艷明，李彩衛(wèi)，等．PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中的應(yīng)用．糧油加工，2006，（10）：81～83

[17] 蔡慧農(nóng)，劉光明，蘇文金，等．TaqMan探針用于轉(zhuǎn)基因食品的熒光定量PCR檢測(cè)．食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29（12）：1～7

[18] 孫大慶，閆冰，趙寧，等．應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)的PCR技術(shù)及其進(jìn)展．中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2007，22（1）：108～113

[19] 楊喻曉，張文，丁美會(huì)，等．基因芯片技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用．糧油食品科技，2009，17（1）：68～70

[20] 黃文勝，潘良文，粟智平，等．基因芯片檢測(cè)轉(zhuǎn)基因油菜．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2003，11（6）：588～592

[21] Duijn GV，Biert RV，Bleeker-Marcelis H，Peppelman H，Hessing M．Detection methods for genetically modified crops．Food Control，1999，10（6）：375～378

[22] 王蘭蘭．臨床免疫學(xué)和免疫檢驗(yàn)．人民衛(wèi)生出版社，2004

[23] 汪琳，邢佑尚，周琦，等．3種轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)蛋白芯片的研制．植物檢疫，2011，25（3）：1～6

[24] 姚文國(guó)，朱水芳．轉(zhuǎn)基因食品檢驗(yàn)分析技術(shù)概述．糧油食品科技，2003，11（1）：26～28

[25] 黃昆侖，羅云波．用巢式和半巢式PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆Roundup Ready及其深加工食品．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2003，11（5）：461～466

[26] Forte VT，Pinto AD，Martino C，Tantillo GM，Grasso G，Schena FP．A general multiplex-PCR assay for the general detection of genetically modified soya and maize．Food Control，2005，16（6）：535～539

[27] 劉全振，夏棟，陸利霞，等．轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)方法進(jìn)展．食品研究與開發(fā)，2007，28（5）：161～164

[28] 孟陸麗，程謙諱，張謙益．轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方法及應(yīng)用．糧食與油脂，2006，（4）：10～13