探討分子生物學(xué)技術(shù)在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用研究

侯鳳英

山東省菏澤市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，山東菏澤 274000

探討分子生物學(xué)技術(shù)在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用研究

侯鳳英

山東省菏澤市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，山東菏澤 274000

伴隨分子生物學(xué)的技術(shù)飛速發(fā)展，微生物的檢驗(yàn)方法與技術(shù)被廣泛應(yīng)用與研究。近幾年，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者不斷深入研究，已經(jīng)建立適用、快速、低耗、簡(jiǎn)便與特異微生物的檢驗(yàn)方法與技術(shù)，特別是對(duì)于分子生物學(xué)的技術(shù)應(yīng)用，其中較為突出的有生物芯片、聚合酶鏈的反應(yīng)與核酸探針等。該文著重分析了各種分子生物學(xué)的技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展。

分子生物學(xué)；微生物檢驗(yàn)；應(yīng)用

通常傳統(tǒng)微生物的檢驗(yàn)技術(shù)時(shí)根據(jù)微生物具體存在狀態(tài)對(duì)其分裂與地位進(jìn)行確定，這種傳統(tǒng)檢測(cè)方式容易存在誤差，就算是同一類微生物，生理生化的性狀與形態(tài)都會(huì)存在差異，鑒定準(zhǔn)確性難以保證。而在微生物檢驗(yàn)的工作中，研究現(xiàn)代化分子生物學(xué)的技術(shù)時(shí)，主要是研究蛋白質(zhì)遺傳、結(jié)構(gòu)與功能；生物大分子；核算機(jī)器的表達(dá)產(chǎn)物等互相作用科學(xué)。將現(xiàn)代化分子的生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于微生物的檢驗(yàn)中時(shí)，能夠獲得以下效果，現(xiàn)代的分子生物學(xué)研究的領(lǐng)域比較廣泛，在很大程度上可以提高檢驗(yàn)范圍與精度；伴隨微生物檢驗(yàn)認(rèn)可的程度提高，可以促進(jìn)分子生物學(xué)發(fā)展，進(jìn)而推動(dòng)各領(lǐng)域工作的進(jìn)步。近幾年，伴隨微生物的檢驗(yàn)認(rèn)可程度不斷提升，推動(dòng)了現(xiàn)代化分子生物學(xué)發(fā)展與進(jìn)步，這在某種程度上會(huì)促進(jìn)社會(huì)進(jìn)步，提高檢驗(yàn)準(zhǔn)確性與可靠性。

1 聚合酶鏈的反應(yīng)技術(shù)

由于微生物檢驗(yàn)種類比較多。如果檢驗(yàn)?zāi)康牟灰粯?，容易造成檢驗(yàn)技術(shù)方面的差異。在現(xiàn)代的分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)中，其要求的是高準(zhǔn)確性、高精度與快速度，在各種檢驗(yàn)技術(shù)中聚合酶鏈的反應(yīng)技術(shù)屬于一種分子生物學(xué)的技術(shù)，其較具有代表性。就目前而言，應(yīng)用聚合酶鏈的反應(yīng)技術(shù)可以同時(shí)鑒定與檢測(cè)不同病原的微生物，檢驗(yàn)原理如下：在同一聚合酶鏈的反應(yīng)管之中，能夠添加不同病原微生物特異性的引物，產(chǎn)生聚合酶鏈的反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)[1]。

2 基因芯片的技術(shù)

為了在微生物的檢驗(yàn)中充分發(fā)揮現(xiàn)代化分子生物學(xué)的技術(shù)應(yīng)用效果，相關(guān)人員逐漸研究出較高端基因芯片的技術(shù)。早在上個(gè)世紀(jì)的90年代就開發(fā)出了基因芯片的技術(shù)，其是把尼龍膜與玻片當(dāng)作載體，于單位面積中有秩序、高密度排列中很多生物活性的分子，主要是為了能夠一同對(duì)多種疾病進(jìn)行檢測(cè)，或是對(duì)不同生物的樣品進(jìn)行分析。在較為復(fù)雜微生物的檢驗(yàn)中比較常用基因芯片的技術(shù)，在長(zhǎng)期總結(jié)和發(fā)展過程中，基因芯片的技術(shù)以相對(duì)成熟，并且該技術(shù)有著其他方式無法比擬的優(yōu)越性。①可以將抗體產(chǎn)生以前感染患者檢測(cè)中應(yīng)用基因芯片的技術(shù)，以便臨床上診斷。目前，大部分患者的臨床癥狀比較特殊，且不能經(jīng)傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)獲取精確信息與數(shù)據(jù)，這使得治療過程因?yàn)槿狈?zhǔn)確數(shù)據(jù)，也就不能針對(duì)患者實(shí)際情況治療，導(dǎo)致患者最佳治療時(shí)機(jī)延誤，影響了患者康復(fù)。但采取基因芯片的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，能夠早診斷患者基本，做到早發(fā)現(xiàn)與早治療。②基因芯片的技術(shù)能夠彌補(bǔ)其他檢測(cè)技術(shù)缺陷，例如：可疑檢測(cè)出其他技術(shù)無法決定的疾病感染，在臨床上，感染始終是個(gè)難題，應(yīng)用基因芯片的技術(shù)，可以準(zhǔn)確確定患者感染程度與范圍等。

3 核算探針的技術(shù)

伴隨現(xiàn)代化分子生物學(xué)的技術(shù)發(fā)展，在很大程度上完善了微生物的檢驗(yàn)體系。因?yàn)樾l(wèi)生影響較為廣泛，尤其對(duì)于生物、社會(huì)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著決定性影響。因此，如果單純應(yīng)用基因芯片或是聚合酶鏈的反應(yīng)技術(shù)來檢測(cè)，難以取得理想效果，這就需要相關(guān)人員深入研究核算探針的技術(shù)[2]。核算探針的技術(shù)和上文兩種技術(shù)有著本質(zhì)區(qū)別，就概念而言，核算探針的技術(shù)主要指的是帶有標(biāo)記特異DNA的片段，按照堿基互補(bǔ)的原則，這種技術(shù)能夠和目的DNA進(jìn)行雜交，然后通過特定方式對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行測(cè)定。從現(xiàn)今微生物的檢驗(yàn)來看，核算探針的技術(shù)在下面幾個(gè)方面應(yīng)用比較廣泛。①核算探針可以對(duì)細(xì)菌中抗藥基因進(jìn)行檢測(cè)，而抗藥基因檢測(cè)的結(jié)果可以為醫(yī)學(xué)治療藥物研究提供參考，防止患者治療時(shí)體中出現(xiàn)抗藥性，以充分發(fā)揮藥物治療的效果，緩解患者病情。②核算探針技術(shù)能夠檢測(cè)那些用于生化鑒定、不能培養(yǎng)、缺少診斷抗原以及不能觀察微生物的產(chǎn)物，在臨床上，腸毒素的檢測(cè)主要使用核算探針檢測(cè)，這種檢測(cè)技術(shù)可以有效獲取腸毒素指標(biāo)與相關(guān)數(shù)據(jù)，進(jìn)而給臨床治療的工作提供參考。③核算探針能夠?qū)Σ《静∵M(jìn)行檢測(cè)，如：在流行病學(xué)的調(diào)查與感染病毒檢測(cè)中均會(huì)使用核算探針，并且能夠用來對(duì)無毒菌株以及有毒菌株進(jìn)行區(qū)分。核算探針這項(xiàng)技術(shù)能夠直接檢測(cè)物質(zhì)本質(zhì)，并且經(jīng)物質(zhì)表面獲取結(jié)果，尤其在DNA的檢測(cè)方面有著極高的權(quán)威性與準(zhǔn)確率。

4 DNA分子的標(biāo)記技術(shù)

在很多微生物的分類、檢驗(yàn)與遺傳育種方面都會(huì)使用DNA分子的標(biāo)記技術(shù)，就目前而言，DNA分子的標(biāo)記技術(shù)主要包含3種：①把分子雜交與電泳作為核心；②把PCR與電泳作為核心；③把DNA的序列作為核心。

4.1 隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA/RAPD

RAPD的技術(shù)主要是通過隨機(jī)合成引物，應(yīng)用PCR來擴(kuò)增靶細(xì)胞的DNA，因?yàn)橐锏拈L(zhǎng)度不一致，容易產(chǎn)生各種大小不一樣PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物?，F(xiàn)階段，RAPD應(yīng)用比較廣泛，主要操作過程如下：提取樣本中的DNA，隨機(jī)對(duì)引物PCR進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)電泳進(jìn)行凝膠，放射自顯影或是EB染色。通常情況下，在分析與鑒定菌株之間、微生物中間以及亞種間親緣關(guān)系時(shí)，經(jīng)常會(huì)采用RAPD的技術(shù)，即使在微生物的檢驗(yàn)中，RAPD的技術(shù)比較簡(jiǎn)便與快速[3]。

4.2 限制片段的長(zhǎng)度多態(tài)性DNA/RFLP

在體中不同生物結(jié)構(gòu)存在巨大差異，同類生物不同個(gè)體間，就算蛋白質(zhì)的產(chǎn)物功能與結(jié)構(gòu)基本一樣或是完全一樣，但是DNA的水平還是存在明顯差異。而RFLP指紋圖譜在微生物種類與種間分型鑒定中比較適用，屬于種群、種與種類分類手段。通常RFLP的技術(shù)操作過程如下：提取樣本中的DNA，限制內(nèi)切酶的酶切，對(duì)電泳進(jìn)行凝膠，雜交，清洗膜，最后放射自顯影。

5 分析核酸序列

分析核酸序列主要過程是在核算的序列中查找基因位置，并對(duì)已知DNA的序列進(jìn)行標(biāo)記。核算的測(cè)序步驟如下：提取與純化核酸，進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，應(yīng)用自動(dòng)序列的分析儀測(cè)序PCR產(chǎn)物，把序列提交至GeNBANk，經(jīng)BLAST的程序以及已知序列分析相似性，分析系統(tǒng)發(fā)育情況，然后繪制出系統(tǒng)的發(fā)育樹。在處理數(shù)據(jù)時(shí)，微生物種、屬間遺傳距離計(jì)算方式比較多，Jukes-CNAtor的方法比較常用。在完成遺傳距離的計(jì)算以后，要建立系統(tǒng)的進(jìn)化樹，同樣有很多建立方法，例如：NeighborJoiN。分析系統(tǒng)的發(fā)育樹時(shí)，常用軟件包含ARB與MEGA等。在真菌核酸的序列中，測(cè)序?qū)ο笾饕?8SrDNA，主要原因是長(zhǎng)度相對(duì)較長(zhǎng)，所含信息比較多。一般情況下，ITS的序列屬于中度保守的序列，保守性的表現(xiàn)在種內(nèi)較為一致，但是在種間則有顯著差異。也就因?yàn)镮TS的序列該特點(diǎn)，使其比較適用于分析種類或是屬內(nèi)物種間差異明顯的一些菌群。對(duì)于細(xì)菌而言，16SrRNA的序列分析逐漸變成種屬分類與鑒定常用的方式，現(xiàn)已報(bào)道了超過2500個(gè)16SrRNA的序列。在微生物的細(xì)胞之中16SrRNA數(shù)量比較大，其分子量相對(duì)適中，提取比較容易，并且16Sr-RNA一級(jí)結(jié)構(gòu)較為保守，其在微生物分類與檢驗(yàn)中比較有用，能夠方便微生物間同源性的關(guān)系分析。通常認(rèn)為只要16SrRNA的序列同源性超過97%，就是同一個(gè)種類，但是16SrRNA的寡核苷酸中順序分析無法對(duì)微生物的菌株進(jìn)行鑒定，例如：膿腫的分枝桿菌與龜分支的桿菌中，DNA的同源性＜50%，但是16SrRNA的基因同源性高達(dá)99%[4]。

6 PCR的技術(shù)

在微生物的檢驗(yàn)中，PCR的技術(shù)比較常見，其是在同一個(gè)反應(yīng)管之中，添加不同病原微生物特異性的引物實(shí)施擴(kuò)增，能夠用在各種病原性微生物同時(shí)鑒定與檢測(cè)中。早在上個(gè)世紀(jì)的90年代中期，我國(guó)就開始廣泛應(yīng)用PCR的技術(shù)對(duì)感染病原性微生物進(jìn)行檢測(cè)，例如：性病的致病菌、人類免疫的缺陷病毒以及肝炎病毒等。目前，PCR的技術(shù)逐漸用在結(jié)核桿菌的耐藥基因與分枝桿菌檢測(cè)與鑒定中，并且禽流感致病毒檢測(cè)中，同樣采取了PCR的技術(shù)。PCR的技術(shù)主要優(yōu)勢(shì)是準(zhǔn)確、快速與靈敏，但凡樣本中存在病原體，應(yīng)用PCR就能夠檢測(cè)出。并且PCR的技術(shù)不會(huì)因?yàn)榛旌蠘?biāo)本而受到影響，能夠從很多正常菌群標(biāo)本之中檢測(cè)出病原菌，其對(duì)不易分離的病原菌鑒定比較有用，例如：螺旋體、分枝桿菌以及支原體衣原體等，可見在病原性微生物檢驗(yàn)中，PCR應(yīng)用的前景比較好。但是傳統(tǒng)PCR的技術(shù)也有諸多問題，例如：PCR在檢測(cè)RNA的病毒時(shí)，操作比較繁瑣，并且種間的污染環(huán)節(jié)比較多，容易出現(xiàn)假陰性或是假陽性的結(jié)果；產(chǎn)生引物的二聚體。因此，為有效規(guī)避傳統(tǒng)PCR的技術(shù)缺陷，逐漸研發(fā)出新型PCR的技術(shù)，并且已經(jīng)用在實(shí)踐中，如：引物DNA的擴(kuò)增、熱啟動(dòng)的PCR、多重PCR以及逆轉(zhuǎn)錄的PCR等[5]。

7 結(jié)語

綜上，在微生物的檢驗(yàn)中，現(xiàn)代化分子生物學(xué)的技術(shù)應(yīng)用越來越普遍，這種技術(shù)優(yōu)勢(shì)比較明顯，并且較為先進(jìn)，能夠?yàn)榕R床治療提供有效的依據(jù)。在微生物的檢驗(yàn)中，分子生物學(xué)主要優(yōu)勢(shì)就是廣泛、快速、高效與準(zhǔn)確，近幾年，分子生物學(xué)的技術(shù)逐漸向著特異性與自動(dòng)化方向進(jìn)步，同時(shí)和其他技術(shù)、學(xué)科進(jìn)行融合，這將會(huì)拓展分子生物學(xué)應(yīng)用范圍，促進(jìn)其發(fā)展與推廣。

[1]梅冰,陸翔,王永喬.微生物非培養(yǎng)技術(shù)在環(huán)境微生物領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J].化學(xué)工程師,2015,29(10):31-33.

[2]黃東紅,鄭友限,潘少敏.泉州市6例布魯菌病的微生物生化鑒定及分子生物學(xué)確認(rèn)[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,48(2):125-127.

[3]楊燕,孫夢(mèng)家,蔣波.藥品無菌檢查中污染微生物的鑒定與OOS調(diào)查分析[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,2016,47(12):1559-1563.

[4]方婷子,施春雷.分子技術(shù)在食源性致病微生物檢測(cè)中的應(yīng)用[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2014,23(7):1923-1929.

[5]陳雯雯,段文峰,劉洋，等.新技術(shù)在食品微生物檢驗(yàn)檢測(cè)中的應(yīng)用[J].上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2016,45(1):121-126.

R7

A

1672-5654（2017）05（c）-0191-02

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.15.191

2017-02-22）

侯鳳英（1967-），女，山東菏澤人，本科，研究方向：微生物檢驗(yàn)。