一例肝豆?fàn)詈俗冃约彝サ腁TP7B基因突變研究

趙龍國慧劉世國宋衛(wèi)青

一例肝豆?fàn)詈俗冃约彝サ腁TP7B基因突變研究

趙龍1國慧2劉世國3宋衛(wèi)青1

目的 檢測肝豆?fàn)詈俗冃裕╓ilson Disease）患兒及其父母的ATP7B基因突變類型。方法 采用全基因組外顯子測序技術(shù)（WES）對(duì)1例肝豆?fàn)詈俗冃曰純杭捌涓改窤TP7B基因進(jìn)行檢測。結(jié)果 患兒母親ATP7B-exon8基因發(fā)生了錯(cuò)義突變（c．2 333G＞T），導(dǎo)致p．R778L；患兒父親ATP7B-exon11基因發(fā)生了錯(cuò)義突變（c．2 621C＞T），導(dǎo)致p．A874V。結(jié)論 患兒父母均為肝豆?fàn)詈俗冃曰驍y帶者。

肝豆?fàn)詈俗冃?；ATP7B基因；突變；測序分型

肝豆?fàn)詈俗冃裕╓ilson Disease）又稱威爾遜氏病，是一種遺傳性銅代謝障礙所致的肝硬化和以基底節(jié)為主的腦部變性的常染色體隱性遺傳的銅代謝障礙疾病。世界范圍發(fā)病率為1/10萬～1/3萬[1]，雜合子頻率為1/200～1/100[2]，其中中國是高發(fā)區(qū)，發(fā)病年齡多在5～35歲[3]，但報(bào)道經(jīng)基因確診的3～72歲均有[4-5]。該病是位于13q14.3的ATP7B基因突變所致，導(dǎo)致銅轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶缺失，從而導(dǎo)致血漿銅藍(lán)蛋白降低及銅在體內(nèi)器官的沉積等一系列臨床表現(xiàn)。肝豆?fàn)詈俗冃允悄壳吧贁?shù)可以治療的神經(jīng)遺傳病之一，患者如果能在發(fā)病早期或癥狀前期即被確診并得到及時(shí)治療，大多預(yù)后良好，反之病情逐漸加重甚至危及生命。

1 資料與方法

1.1 一般資料

患兒，女，12歲，父母非近親結(jié)婚。血清學(xué)檢查結(jié)果顯示血清銅藍(lán)蛋白52 mg/L，23 h尿銅排泄量232 μg，影像學(xué)檢查結(jié)果顯示輕度肝硬化，腦MRI雙側(cè)豆?fàn)詈顺蕦?duì)稱性低密度陰影，診斷為肝豆?fàn)詈俗冃?。采集患兒及其父母外周靜脈血5 ml，用于提取DNA。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 患者、患者父母分別采集靜脈血10 ml，保存于抗凝管中。

1.2.2 基因組DNA提取 選用天根生化科技生產(chǎn)的DNA提取試劑盒，對(duì)該家庭3人采集靜脈血進(jìn)行基因組DNA提取。

1.2.3 外顯子測序（WES） 對(duì)基因組DNA隨機(jī)片段化制備cDNA文庫。PCR擴(kuò)增并純化富集回收產(chǎn)物后，采用安捷倫人全外顯子試劑盒特異性捕獲外顯子區(qū)域序列。使用安捷倫2100檢測DNA樣品的濃度和含量。在Illumina MISeq2000高通量測序平臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行雙向測序，并通過SOAPaligner2.20對(duì)比軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，初步篩選高質(zhì)量單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)。

1.2.4 Sanger重測序驗(yàn)證 對(duì)于WES測序所檢測到的突變結(jié)果在原標(biāo)本中進(jìn)行Sanger測序。來驗(yàn)證外顯子測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。PCR突變所在的外顯子，引物序列由青島生工生物科技有限公司合成。 取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl置于15 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，使用ABI70測序儀（Applied Biosystems）進(jìn)行產(chǎn)物程序。采用DNAMAN軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并與GenBank中的ATP7B基因序列進(jìn)行對(duì)比，判斷是否為新突變位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 全基因組外顯子測序

結(jié)果表明，患兒的父親 ATP7B-exon11基因發(fā)生了錯(cuò)義突變（c.2 621C＞T），導(dǎo)致p.A874V；患兒的母親ATP7B-exon8基因發(fā)生了錯(cuò)義突變（c.2 333G＞T），導(dǎo)致p.R778L。

2.2 Sanger測序驗(yàn)證

以PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)的Sanger測序也得到了與WES方法完全相同的突變。

3 討論

肝豆?fàn)詈俗冃詮V泛分布于各族群人種之間，通常發(fā)生于兒童和青少年期，少數(shù)成年期發(fā)病。若早發(fā)現(xiàn)早診斷早治療，一般較少影響生活質(zhì)量和生存期。銅代謝障礙是該病的主要特征之一。銅離子在體內(nèi)異常沉積的速度、部位不同使得患者出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)器官功能損傷，隨著病情的不斷進(jìn)展，可導(dǎo)致數(shù)個(gè)臟器不可逆的損傷，并出現(xiàn)各種并發(fā)癥，危及患者生命。

傳統(tǒng)臨床上用于診斷肝豆?fàn)詈俗冃缘氖侄芜€比較單一，給臨床診治帶來一定困擾。較多的肝豆?fàn)詈俗冃缘幕颊咴缙诎Y狀復(fù)雜多樣，易被誤診為其他疾病如慢性肝炎、肝硬化、脾功能亢進(jìn)、溶血性貧血等。而且銅代謝檢查存在自身的局限性，假陰性假陽性結(jié)果較多。若能及早得到正確的診斷和治療，大多數(shù)患者可恢復(fù)良好，且生活質(zhì)量和壽命與正常人相似。

DNA測序技術(shù)是目前診斷肝豆?fàn)詈俗冃宰畛Ｓ玫幕驒z測方法，是該病基因診斷的標(biāo)準(zhǔn)。ATP7B基因全長約80 kb，由21個(gè)外顯子和20個(gè)內(nèi)含子組成[6]?；蜷L度為78 821 bp，大多數(shù)外顯子的長度為200 bp左右。結(jié)構(gòu)分析表明肝豆?fàn)詈俗冃曰虺室粋€(gè)開放讀碼框，cDNA序列長度為4 233 bp，編碼由1 411個(gè)氨基酸組成的P-型銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶。

隨著基因測序技術(shù)的不斷發(fā)展，及早確定ATP7B的基因突變類型，對(duì)于盡早明確診斷，及時(shí)做出干預(yù)有非常重要的意義，使機(jī)體早日免受器官損傷的風(fēng)險(xiǎn)。目前該基因以逐步作為產(chǎn)前診斷和新生兒篩查的指標(biāo)[7]。然而ATP7B基因突變類型非常多，目前報(bào)道的ATP7B基因突變類型有550多種，以少數(shù)幾個(gè)突變?yōu)橹鳎嬖诿黠@的種族和地區(qū)差異[8]。這些突變大多是雜合突變，了解這些突變對(duì)基因檢測至關(guān)重要。Kenney SM等[9]于2007年報(bào)道在肝豆?fàn)詈俗冃缘?18種突變中，379種是致病的，139種為非致病性的，還有一些突變尚不能確定是否致病。

我們本次的研究僅有1例樣本，對(duì)研究基因型與表現(xiàn)型的關(guān)系尚存在局限性。另外，闡明本地區(qū)ATP7B基因突變類型對(duì)于產(chǎn)前診斷和新生兒篩查非常重要，未來我們將收集更多患者資料，確定本地區(qū)肝豆?fàn)詈俗冃曰蜃儺惖幕A(chǔ)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步闡明ATP7B基因型與表現(xiàn)型的關(guān)系。

[1] Figus A，Angius A，Loudianos G，et al． Molecular pathology and haplotype analysis of Wilson disease in Mediterranean populations[J]．Am J Hum Genet，1995，57（6）：1318-1324．

[2] Als A，Walker AP，Ashkan K，et al． Wilson’s disease[J]． Lancet，2007，369（9559）：397-408．

[3] Roberts EA．Schisky ML． Division Gastroenterology and Nutrition． A practice guideline on Wilson disease[J]． Hepatology，2003，37（6）：1475-1492．

[4] Wilson DC，Phillips MJ，Cox DW，et al． Severe hepatic Wilson’s disease in preschool-aged children[J]． J Pediatr，2000，137（5）：719-722．

[5] 陳晶貞，孟艷燕． ATP7B蛋白在肝豆?fàn)詈俗冃灾械姆肿訖C(jī)制研究進(jìn)展[J]． 臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，7（8）：183-185．

[6] 陳定邦，馮黎，李洵樺． 肝豆?fàn)詈俗冃缘姆肿由飳W(xué)研究進(jìn)展[J]．分子診斷與治療雜志，2011，3（2）：120-124．

[7] Roberts EA，Schilsky ML． Diagnosis and treatment of Wilson disease：an update[J]． Hepatology （Baltimore， Md），2010，47（6）：2089-2111．

[8] 張秀海，劉偉． 肝豆?fàn)詈俗冃缘倪z傳學(xué)研究及治療進(jìn)展[J]． 臨床醫(yī)學(xué)，2008，28（11）：109-111．

[9] Kenney SM，Cox DW． Sequence variation database for the Wilson disease copper transporter，ATP7B [J]． Hum Mutat，2007，28（12）：1171-1177．

Study on ATP7B Gene Mutation in a Family With Wilson Disease

ZHAO Long1GUO Hui2LIU Shiguo3SONG Weiqing11 Medical College of Qingdao University, Qingdao Shandong 266003, China; 2 International Clinic, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao Shandong 266003, China; 3 Prenatal Diagnosis Center, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao Shandong 266003, China

ObjectiveTo investigate the type of ATP7B mutation in a child with Wilson disease and her parents.MethodsUsing whole-genome exon Sequencing(WES) to detect ATP7B gene in one patient with Wilson's disease and her parents.ResultsMissense mutations (c.2 333G＞T) in ATP7B-exon8 gene occurred in patient’s mother, which lead to p.R778L;Missense mutations (c.2 621C＞T) in ATP7B-exon8 gene occurred in patient’sfather, which lead to p.A874V.ConclusionPatient’s parents are Wilson disease gene carriers.

wilson disease; ATP7B gene; mutation; multilocussequence typing

R446．6

A

1674-9316（2017）06-0090-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．06．054

1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部，山東 青島 266003；2 青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院國際門診，山東 青島 266003；3 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，山東 青島 266003

宋衛(wèi)青