虎門合劑對成癮模型及戒斷大鼠GABA免疫陽性神經(jīng)元的影響

丁尤放++林涵++李樹春

【摘要】目的：研究嗎啡成癮性和戒斷大鼠在虎門合劑給藥后GABA陽性神經(jīng)元數(shù)量的變化。方法：通過提升傳統(tǒng)建模方法建立大鼠成癮模型和模型評估系統(tǒng)，同時利用免疫組化法觀察虎門合劑給藥后嗎啡成癮和戒斷大鼠陽性細胞元的變化。結(jié)果：嗎啡依賴大鼠海馬CA1區(qū)和齒狀回GABA陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，虎門合劑治療組海馬GABA陽性神經(jīng)元數(shù)量和光密度均顯著升高。結(jié)論：虎門合劑對嗎啡損傷一般記憶的效應(yīng)具有拮抗作用。

【關(guān)鍵詞】物質(zhì)依賴；γ-氨基丁酸（GABA）；海馬；神經(jīng)元；虎門合劑

【中圖分類號】R965【文獻標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）21-0015-04

Influences from Traditional Chinese HuMen Composition on GABA Immune Positive Neurons of Morphine-Dependence and Withdrawal Rats

DING YoufangLIN HanLI Shuchun*

Institute of Chinese Minority Traditional Medicine， Minzu University of China， Beijing 100081， China

Abstract：Objective To discuss the changes occurring in GABA positive neurons of morphine-dependence and withdrawal Rats after given HuMen Composition. Methods Rats addiction models and model evaluation system were established in the study through improving the traditional methods of building models. At the same time， immunohistochemical method was used to observe the changes occurring in positive neurons of morphine-dependence and withdrawal Rats after given HuMen Composition. Results the number of positive neurons is obviously decreased in hippocampus CA1 and Dentate Gyrus areas of morphine-dependent rats. In the treatment group of HuMen Composition， the number of hippocampus GABA and optical density are all increased respectively. Conclusion HuMen Composition may have certain antagonistic effect in curing damaged memory induced by morphine.

Keywords：Addiction；GABA；Hippocampus；Neurons；HuMen Composition

虎門合劑為名醫(yī)驗方，在甘肅、河南等地進行的中藥戒毒的臨床研究中取得了滿意的療效。尤其是1996年底，該藥在云南思茅等地的戒毒所進行臨床研究時，快速、高效和無副作用的優(yōu)點得到了當(dāng)?shù)赜嘘P(guān)部門的重視[1]。本方依據(jù)阿片類物質(zhì)戒斷綜合征的病因病機特點，以中醫(yī)氣血臟象理論為指導(dǎo)，以陰陽雙補、去瘀化痰、安神止痛，扶正固本等為治法，對改善成癮患者稽延性戒斷癥狀，對抗復(fù)吸具有明顯療效。

學(xué)習(xí)記憶在藥物依賴中的作用已越來越引起人們的重視，甚至有人提出藥物依賴是一種異常形式的記憶[2]。而老年性學(xué)習(xí)記憶能力減退的研究顯示，與學(xué)習(xí)記憶有密切關(guān)系的隔海馬投射系統(tǒng)除了有乙酰膽堿以外還有GABA，并且隔核內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元接受伏核GABA能神經(jīng)元的支配，GABA能神經(jīng)元的活動可調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)元的功能[3]。但在阿片類物質(zhì)依賴所致學(xué)習(xí)記憶功能改變中GABA的變化及意義未見報道。本研究用免疫組化方法對各組大鼠海馬GABA進行研究，試圖找出GABA在阿片類物質(zhì)依賴中的變化規(guī)律及其與學(xué)習(xí)記憶減退間的關(guān)系，以及虎門合劑對此的調(diào)節(jié)作用。

1實驗材料

11實驗動物：SPF級SD健康雄性大鼠，體重200～400g。數(shù)目：60只（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），合格證號：SCXK（京）2006-0008。動物常規(guī)飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境一周后，隨機分為6組，每組10只。模型組按造模方法皮下注射（sc）嗎啡，正常組sc生理鹽水。中藥組在造模同時以虎門合劑灌胃（ig），對照組在造模同時ig生理鹽水。模后組在造模完成后以虎門合劑灌胃（ig），模后對照組在造模后ig生理鹽水。

12試劑和儀器鹽酸嗎啡 （mor-phinehy-drochloride，MH）（沈陽市第一制藥廠），L-精氨酸（L-Arg）、DAB、花生油，內(nèi)源性生物素封閉液（ABB）、3%正常羊血清，GABA抗血清，生物素結(jié)合IgG（Co1∶200），ABC復(fù)合物 （武漢博士德生物工程有限公司），虎門合劑免煎劑（北京中醫(yī)藥大學(xué)制劑室）。CM1900橫冷式冰凍切片機（德國LAICA公司），Observor行為學(xué)研究裝置（荷蘭NODULES公司）。

2實驗方法

21大鼠成癮模型的建立大鼠稱重，采用鹽酸嗎啡背部皮下注射，對照組將嗎啡換成生理鹽水，其他處理與模型組相同。給藥時間及劑量見表1。

22免疫組織化學(xué)取實驗大鼠，快速開胸，經(jīng)左心室主動脈插管，生理鹽水快速沖洗后，灌入預(yù)冷的4%緩沖多聚甲醛500mL，含025%戊二醛，取腦后固定2～4h，再轉(zhuǎn)入20%蔗糖中，于-70℃冰凍保存。作厚5μm冠狀冰凍切片，對含背側(cè)海馬的組織切片隔五取一，依次加入含3%正常羊血清中30min（37℃），001mol/L、PH74 PBS接片，03%（體積分數(shù)）甲醇過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，03%（體積分數(shù)）TritonX100 37℃處理30min，ABB封閉內(nèi)源性生物素。切片上加入GABA一抗（1∶100）及正常血清，4℃下孵育48～72h，加入二抗室溫3h，SABC室溫反應(yīng)2h，DAB/H2O2呈色，明膠貼片，脫水透明，中性樹膠封固。PBS代替一抗作為陰性對照。

3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均以（x±s）表示，采用SPSS115 統(tǒng)計軟件進行方差分析及兩兩比較進行統(tǒng)計學(xué)處理，對3組大鼠各腦區(qū)的NA進行單因素方差分析。P<005為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

4結(jié)果

41大鼠成癮模型的評定各組在末次注射后12小時將大鼠放入行為學(xué)觀察記錄箱中，1min后開始用Observor觀察戒斷體征，歷時20min，戒斷體征分為可數(shù)和不可數(shù)體征，可數(shù)體征包括：齒顫，咀嚼，直立，濕狗樣抖動，跳躍。直接記錄20min內(nèi)的次數(shù)得分。不可數(shù)體征包括：上瞼下垂、流淚、流涎、眨眼、腹瀉等，按評分標(biāo)準(zhǔn)評定（表2）。凡有接觸驚叫大鼠均增加2分。全部體征得分之和為戒斷總評分[3]。

嗎啡成癮大鼠和對照組大鼠戒斷后，經(jīng)過20min觀察，兩組動物戒斷癥狀出現(xiàn)頻次情況見表3?？梢?，嗎啡成癮大鼠模型的建立是成功的。模型組自然戒斷誘發(fā)戒斷癥狀結(jié)果是（3482±053）次，對照組的結(jié)果是（101±064）次，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<001）。

42海馬不同亞區(qū)GABA陽性神經(jīng)元的分布海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)GABA免疫組化染色可見陽性胞體和突起，細胞分布于海馬各區(qū)，其中CA1區(qū)較多，并可見有較長突起的Golgi樣染色細胞（圖1A）。齒狀回分子層的細胞相對稀疏（圖1B）。

與正常組相比，GABA免疫染色陽性細胞在模型動物海馬內(nèi)的密度較低，定量結(jié)果顯示，海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)CA1區(qū)的GABA陽性細胞與模型組對比明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<001）（圖1C），齒狀回分子層內(nèi)的GABA陽性細胞（圖1D）在模型組表達與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P<005）。見表4。

中藥組海馬內(nèi)GABA陽性神經(jīng)元在CA1區(qū)數(shù)目與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P<001）（圖1E、F）。中藥對照組海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)GABA陽性神經(jīng)元見于CA1、CA3區(qū)和齒狀回，各區(qū)的細胞形態(tài)和分布模式與對照組和模型組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>005）。但在CA1區(qū)GABA陽性神經(jīng)元數(shù)目與中藥組比較顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)之義（P<001）（表4），染色的強度也極度變淡（圖1G、H），說明中藥具有治療作用。

5討論

GABA是哺乳類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布于與學(xué)習(xí)記憶有密切關(guān)系的隔海馬投射系統(tǒng)。與學(xué)習(xí)記憶有密切關(guān)系的隔海馬投射系統(tǒng)除了有乙酰膽堿以外還有GABA，并且隔核內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元接受伏核GABA能神經(jīng)元的支配，GABA能神經(jīng)元的活動可調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)元的功能[5]。GABA在老年學(xué)習(xí)記憶能力損害的過程中起著非常重要的作用[6]。有研究顯示行為學(xué)訓(xùn)練前隔區(qū)內(nèi)注射GABA受體激動劑可損害動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力，若訓(xùn)練后給藥則可易化學(xué)習(xí)過程；訓(xùn)練后紋狀體內(nèi)注射GABA受體拮抗劑荷包牡丹堿可引起嚴(yán)重的逆行性遺忘癥[7]。此外，GABA代謝酶抑制劑可通過提高腦內(nèi)GABA水平而加重基底核損傷所致的空間定向能力障礙[8]。因此，可以認為GABA是參與學(xué)習(xí)記憶過程的另一重要的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)。

在海馬GABA存在于非錐體神經(jīng)元，按其與其它遞質(zhì)的共存情況可分為多種亞型：①含鈣結(jié)合蛋白的GABA能中間神經(jīng)元，主要是含小白蛋白和鈣結(jié)合素D28K。②含神經(jīng)肽的GABA能神經(jīng)元，目前已發(fā)現(xiàn)的GABA能神經(jīng)元內(nèi)的神經(jīng)肽有生長抑素，膽囊收縮素，血管活性腸多肽和神經(jīng)肽-Y。③含一氧化氮合酶的GABA能神經(jīng)元。④不含上述物質(zhì)的GABA能神經(jīng)元。這些亞群間的神經(jīng)元有很多相互重疊，即GABA能神經(jīng)元可與多種神經(jīng)活性物質(zhì)共存。如大鼠海馬CA1區(qū)GABA陽性神經(jīng)元中約有30%含有PV，而PV陽性神經(jīng)元中有96%含CaBP，14%PV陽性神經(jīng)元含有SOM?？梢奊ABA神經(jīng)元是一類非常復(fù)雜的神經(jīng)元[9]。

本交實驗結(jié)果顯示，模型組海馬本部各區(qū)的GABA能神經(jīng)元均明顯減少（P<001）；在齒狀回分子層，GABA陽性神經(jīng)元的光密度在模型組明顯少于對照和中藥組；而成癮組與用藥對照組之間沒有明顯差異（P>005）。因此，可以認為海馬CA1區(qū)和CH區(qū)的GABA能神經(jīng)元在戒斷時明顯減少，但學(xué)習(xí)記憶能力的改變究竟是GABA的直接作用還是GABA通過影響其他神經(jīng)遞質(zhì)而間接作用，還有待進一步的研究。

眾所周知，海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)的GABA能神經(jīng)元是一類中間神經(jīng)元。它接受基底前腦GABA能傳入纖維的支配，而不接受膽堿能傳入纖維和谷氨酸能傳入纖維的支配。它發(fā)出的軸突支配海馬的錐體細胞。損傷研究顯示，致癲癇藥物可引起海馬內(nèi)GABA免疫反應(yīng)終扣的丟失，并有不同程度的GABA能神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為線粒體腫脹，細胞器崩解和神經(jīng)末梢變性[10]。也有研究顯示[11]，GABA可通過控制其靶細胞BDNF的表達水平而調(diào)節(jié)海馬中間神經(jīng)元的表型，表現(xiàn)在發(fā)育早期GABA可促進神經(jīng)元以旁分泌的形式產(chǎn)生大量BDNF，從而使GABA能中間神經(jīng)元體積增大，表達NPY增加，發(fā)育晚期，GABA抑制BDNF合成，GABA受體激動劑蠅蕈醇可引起中間神經(jīng)元體積縮小，NPY表達減少。NPY是與GABA共存的一種神經(jīng)肽，可抑制CA1區(qū)和CA3區(qū)錐體細胞的興奮性傳遞?？梢奊ABA有可能是成癮過程中GABA能神經(jīng)元環(huán)路變性的一種使動因子。

本實驗發(fā)現(xiàn)虎門合劑治療組海馬GABA均有所升高，說明虎門合劑對嗎啡的損傷一般記憶效應(yīng)具有拮抗作用。這種改善作用可能是中藥促進學(xué)習(xí)記憶的一般機制之一。同時按著中醫(yī)對腦病的研究成果來看，完全可以將依賴疾病定義為腦絡(luò)之病，至少是一種腦病。

參考文獻

[1]李樹春，滿序聰，徐斯凡，等.虎門合劑對嗎啡依賴大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響[J].山西中醫(yī)，2010，26（8）：50-53.

[2]Nestler EJ. Neurobiology. Total recall-the memory of addiction[J]. Science，2001， 292（5525）：2266-2267.

[3]Jacobson LH， Kelly PH， Bettler B，et al. GABA[B（1）]receptor isoforms differentially mediate the acquisition and extinction of aversive taste memories[J].J Neurosci， 2006，26（34）：8800-8803.

[4]紀(jì)家濤.嗎啡依賴大鼠模型的建立[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1997，18（1）：81-82.

[5]Sullivan MA， Chen H， Morikawa H. Recurrent inhibitory network among striatal cholinergic interneurons[J]. J Neurosci，2008，28（35）：8682-8690.

[6]Saulle E， Gubellini P， Picconi B， Centonze D， Tropepi D， Pisani A， Morari M， Marti M， Rossi L， Papa M， Bernardi G， Calabresi P. Neuronal vulnerability following inhibition of mitochondrial complex II： a possible ionic mechanism for Huntingtons disease[J]. Mol Cell Neurosci. 2004，25（1）：9-20.

[7]Ishitobi S， Ayuse T， Yoshida H，et al. Effects of midazolam on acquisition and extinction of conditioned taste aversion memory in rats[J]. Neurosci Lett. 2009，450（3）：270-274. Epub 2008 Nov 24.

[8]Pitknen A， Halonen T. Prevention of neuronal cell death by anticonvulsants in experimental epilepsy （extended abstract）[J].Acta Neurol Scand Suppl. 1995，162：22-23.

[9]Fiorentino H， Kuczewski N， Diabira D， Ferrand N， Pangalos MN， Porcher C， Gaiarsa JL. GABA（B） receptor activation triggers BDNF release and promotes the maturation of GABAergic synapses[J]. J Neurosci. 2009 Sep 16； 29（37）：11650-11661.

（編輯：梁志慶）