基于16S/18S rRNA基因文庫技術(shù)研究釀醋大曲固態(tài)發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)演變

劉雄，甘興，羅立新

（華南理工大學(xué)，生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006）

基于16S/18S rRNA基因文庫技術(shù)研究釀醋大曲固態(tài)發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)演變

劉雄，甘興，羅立新

（華南理工大學(xué)，生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006）

針對(duì)釀醋大曲發(fā)酵過程中不同階段樣品，以16S/18S rRNA基因?yàn)槟康钠危捎?6S/18S rRNA克隆文庫法分析大曲中細(xì)菌、真菌微生物群落的組成，并通過豐度和多樣性分析剖析發(fā)酵過程中微生物群落的演變。整個(gè)固態(tài)發(fā)酵過程中，細(xì)菌類共檢測(cè)到4個(gè)目14個(gè)屬，真菌類共檢測(cè)到3個(gè)目11個(gè)屬。大曲固態(tài)發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯動(dòng)態(tài)變化。其中，片球菌（Pediococcus），乳桿菌（Lactobacillus），明串珠菌（Leuconostoc）以及畢赤酵母（Pichia）為固態(tài)發(fā)酵前期優(yōu)勢(shì)菌；泛菌屬（Pantoea），腸桿菌屬（Enterobacter），阪崎腸桿菌（Cronobacter）以及淀粉霉（Amylomyces），根霉（Rhizopus）為固態(tài)發(fā)酵中后期優(yōu)勢(shì)菌；而芽孢桿菌（Bacillus）以及Rasamsonia，曲霉菌（Eurotium）為固態(tài)發(fā)酵后期優(yōu)勢(shì)菌。PCA分析表明，釀醋大曲固態(tài)發(fā)酵過程中不同階段的微生物種群多樣性不一，發(fā)酵1 d、3 d，發(fā)酵7 d、13 d，發(fā)酵19 d、25 d、30 d各分為一類。研究大曲制作過程中菌群結(jié)構(gòu)演變，對(duì)提高食醋品質(zhì)具有重大意義。

釀醋大曲；克隆文庫；微生物群落；固態(tài)發(fā)酵；動(dòng)態(tài)演變

大曲中的微生物組成主要分為細(xì)菌、酵母菌、霉菌3種，其群落組成對(duì)后續(xù)的釀造生產(chǎn)起著關(guān)鍵作用且各自扮演著不同角色。在釀造中，細(xì)菌主要產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶及多種有機(jī)酸[2]；酵母菌主要合成一系列的酯類、酸類、醇類、醛類等風(fēng)味物質(zhì)[3]；霉菌則是主要的糖化微生物群，并且還形成部分酯類和其他物質(zhì)來改善風(fēng)味[4]。

目前對(duì)大曲的研究主要集中在釀酒大曲，而對(duì)醋用大曲微生物多樣性研究較少。本研究采用16S/18S rRNA基因克隆文庫法對(duì)釀醋大曲微生物菌群進(jìn)行種類和豐度的分析，該方法被廣泛應(yīng)用于各種環(huán)境樣品或食品中的微生物生態(tài)分析，且不需要微生物的純培養(yǎng)，能更全面地揭示各種生態(tài)環(huán)境樣品中的微生物多樣性[5]。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

根據(jù)陜西某食醋廠大曲固態(tài)發(fā)酵過程中傳統(tǒng)的成熟階段，分別取發(fā)酵1 d（室溫）、3 d(35～38℃)、7 d(40～50℃)、13 d(53～60℃)、19 d(35～40℃)、25 d(28～34℃)和30 d(室溫)的大曲樣品。粉粹后保存至-20℃下，用于后續(xù)分析。

1.2 樣品基因組提取

樣品預(yù)處理如下：取0.5 g大曲樣品，置于2m L離心管中，再加入1m L PBS緩沖液，浸泡30m in，12000 r/m in離心2m in，棄上清液，收集菌體。之后采用Omega soil DNA kit提取微生物基因組DNA，詳細(xì)提取步驟參見操作說明書。用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取后的基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)（98 V,25min），同時(shí)采用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定樣品基因組DNA的濃度?；蚪M于-20℃下保存。

1.3 16S/18S rRNA基因克隆文庫構(gòu)建

(4)技術(shù)力量在突破人類中心論中扮演了重要角色。因?yàn)榧夹g(shù)力量對(duì)人類行為及其后果的改變，使得倫理學(xué)研究范疇超越了傳統(tǒng)的時(shí)間和空間范圍，因此，勢(shì)必將打破大部分早期倫理體系中的人類中心論地位。與早期倫理學(xué)關(guān)注人、人的行為和行為后果不同，技術(shù)時(shí)代的倫理視域已經(jīng)擴(kuò)展開來，并逐漸呈現(xiàn)出一種宏大的、整體的視角。人的倫理學(xué)不僅關(guān)注人，而且關(guān)注人類整體，關(guān)注人類處于其中的自然。此外，從一種存在主義的視角看，人類的獨(dú)斷的情感和態(tài)度，與人類自身生存的未來已經(jīng)不相符合，對(duì)人類自身，尤其是大自然的認(rèn)識(shí)需要調(diào)整適應(yīng)，建立一種突破人類中心論的倫理學(xué)勢(shì)在必行。

1.3.1 16S/18S rRNA基因擴(kuò)增與純化

分別采用細(xì)菌通用引物27F/1492R，真菌通用引物NS1/FR1[6]擴(kuò)增16S/18S rRNA基因。擴(kuò)增的目的基因利用OMEGA膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。

1.3.2 16S/18SrRNA基因TA克隆

純化后的PCR產(chǎn)物與載體PMD 18-T vector在16℃連接1 h，然后轉(zhuǎn)化到E.coil DH5α-感受態(tài)細(xì)胞后培養(yǎng)1.5 h，最后取適量菌液均勻涂布在有氨芐青霉素的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)。在平板上隨機(jī)挑選菌落為模板，M 13F和M 13R[7]為引物進(jìn)行菌落PCR，保證每個(gè)目的基因陽性克隆不少于80個(gè)。

1.3.3 陽性克隆子的RFLP分析

將菌落PCR驗(yàn)證為陽性克隆子的16S/18S rRNA基因PCR產(chǎn)物分別用內(nèi)切酶HinfI和MspI(Justéet al. 2014)，HinfI和Hae III[8]進(jìn)行雙酶切。再用濃度為10%的中性PAGE膠，于150 V電壓下電泳70m in分析酶切產(chǎn)物，最后分析酶切產(chǎn)物的電泳圖譜，分類不同類型的圖譜，并計(jì)算每種圖譜出現(xiàn)的頻率，挑選每種圖譜具有代表性的陽性克隆子送往廣州艾基生物有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

序列相似性大于97%視作同一OTU。將每個(gè)OTU序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)并且挑選同源性最高的序列。再選取與OTU序列相近的序列與OTU序列一起通過MEGA6.0軟件中的Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[9]。根據(jù)每個(gè)樣品中OTU數(shù)量和種類的不同，分析微生物的多樣性，并用SPSS17.0軟件進(jìn)行主成分分析，對(duì)大曲制作過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行剖析。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S/18S rRNA基因克隆文庫

部分陽性克隆子菌落PCR瓊脂糖凝膠檢測(cè)圖見1，目的條帶明顯，陽性克隆率較高。對(duì)菌落PCR產(chǎn)物雙酶切后用中性PAGE膠檢測(cè)，部分分型瓊脂糖凝膠檢測(cè)圖見圖2，分型效果較好，易于OTU分類。

圖1 部分陽性克隆子菌落PCR電泳圖

圖2 部分RFLP中性PAGE電泳圖

通過對(duì)陽性克隆子測(cè)序結(jié)果和不同OTU數(shù)目計(jì)數(shù)，分析了大曲樣品中微生物種類與豐度。通過聚類分析，16S rRNA基因克隆文庫共發(fā)現(xiàn)32個(gè)OTU，分屬于14個(gè)屬，見圖3。在大曲發(fā)酵前期，Pediococcus、Lactobacillus、Leuconostoc為優(yōu)勢(shì)菌屬，隨即在中后期呈下降趨勢(shì)，最后相對(duì)豐度降低甚至檢測(cè)不出。其中，Pediococcus在1 d時(shí)豐度為40%，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，豐度逐漸降低，最后在30 d時(shí)，甚至未檢測(cè)出。不同于Pediococcus在整個(gè)發(fā)酵過程中相對(duì)豐度呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)，Lactobacillus與Leuconostoc只在第1天和第3天檢測(cè)到。Lactobacillus豐度從第1天的37%降低至第3天的33%，隨后至發(fā)酵結(jié)束并未檢測(cè)出。Leuconostoc豐度從第1天的13%明顯降低至第3天的1%，隨后至發(fā)酵結(jié)束并未檢測(cè)出。而在大曲發(fā)酵中期，Pantoea、Enterobacter、Cronobacter為主要的優(yōu)勢(shì)菌屬。其中，Pantoea的相對(duì)豐度從第3天的12%迅速增長(zhǎng)至第7天的61%，Enterobacter的相對(duì)豐度從第3天的20%增長(zhǎng)至第7天的31%，并分別于第7天達(dá)到該屬在整個(gè)發(fā)酵過程中的最高豐度；Pantoea相對(duì)豐度從第7天的61%逐漸降低，在第25天降低至17.5%,隨即在第30天迅速增長(zhǎng)至52%，并成為成熟大曲中的主要優(yōu)勢(shì)菌之一。在大曲后期，Bacillus成為優(yōu)勢(shì)菌屬，其相對(duì)豐度從第19天的30%明顯增加至第25天的70%，隨后在第30天降低至25%。在第30天時(shí)，成熟大曲中檢測(cè)的主要細(xì)菌屬主要為Pantoea(52%)，Bacillus(25%)，Enterobacter(10%)，Thermoactinomyces sanguinis(7%)。

圖3 16S rRNA基因文庫

圖4 18S rRNA基因文庫

通過18S rRNA基因文庫構(gòu)建，共發(fā)現(xiàn)13個(gè)OTU，分屬于11個(gè)屬，見圖4。在大曲前期，Pichia anomala為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，在第3天時(shí)相對(duì)豐度為99%，而其在中后期基本沒有檢測(cè)到，只有在第19天時(shí)檢測(cè)到2%?；葚S立等[10]在分析某中溫大曲酵母群落結(jié)構(gòu)時(shí)，共發(fā)現(xiàn)Pichia、Saccharomyces、Debaryomyces、Zygosaccharomyces、Endomyces、Candida、Hanseniaspora、Rhodotorula、Issatchenkia等9個(gè)已知酵母菌屬。本研究所發(fā)現(xiàn)的酵母屬種類相對(duì)較少且單一，且在前期占據(jù)真菌類的主導(dǎo)地位，與報(bào)導(dǎo)的文獻(xiàn)有一定區(qū)別。在大曲發(fā)酵中期，Amylomyces、Rasamsonia、Rhizopus為優(yōu)勢(shì)菌屬，其中Amylomyces相對(duì)豐度在第7天高達(dá)95%，Rasamsonia從第7天開始檢測(cè)出，相對(duì)豐度在第25天達(dá)到最高的47%，且在成熟大曲中的顯示依然占有很大比重。Rhizopus只有在發(fā)酵過程中的第13天至第30天有檢測(cè)到，其豐度一直在10%左右上下浮動(dòng)，最后在第30天穩(wěn)定在6%；在大曲發(fā)酵后期，Aspergillus有增長(zhǎng)趨勢(shì)。主要的優(yōu)勢(shì)菌屬為Aspergillus(45%)，Rasamsonia(32%)，Eurotium(12%)，Rhizopus (6%)。

通過對(duì)測(cè)序結(jié)果比對(duì)，選出最相近和次相近的序列構(gòu)建進(jìn)化樹，見圖5和圖6。其中，16S rRNA基因文庫進(jìn)化樹(圖5)顯示，細(xì)菌類微生物主要可分為4大類：Enterobacteriales,Actinomycetales,Bacillales和Lactobacillales。18S rRNA基因文庫進(jìn)化樹（圖6）顯示，真菌類微生物主要分為3大類，Eurotiales，Saccharomycetales和Mucorales。

2.2 16S/18S rRNA基因克隆文庫PCA分析

細(xì)菌和真菌微生物的多樣性主成分分析見圖7。PCA分析表明，發(fā)酵1 d、3 d可聚為一類，發(fā)酵7 d、13 d可聚為一類，而19 d、25 d、30 d可聚為一類。微生物多樣性的聚類與大曲整個(gè)制作過程的溫度變化保持一定的相關(guān)性，在傳統(tǒng)大曲制作過程中，大曲發(fā)酵前7 d溫度持續(xù)上升，發(fā)酵7 d以后進(jìn)入大火階段，溫度達(dá)到峰值；后期溫度逐步下降，證明溫度對(duì)大曲微生物多樣性的影響是一個(gè)比較重要的因素[11]。

根據(jù)16S/18S rRNA基因克隆文庫中每個(gè)OTU陽性克隆子的數(shù)量，結(jié)果見表1。每個(gè)大曲樣品的陽性克隆子最少的有159，最高的有206，滿足文庫標(biāo)準(zhǔn)。文庫覆蓋率在92%以上，最高98%。從指數(shù)H、J和D可以看出，大曲微生物的多樣性是先升后降又升的趨勢(shì)，在大曲發(fā)酵前3 d，最高溫度不到40℃，適合絕大多數(shù)的微生物生長(zhǎng)，所以微生物多樣性增加。發(fā)酵3～7 d之間溫度持續(xù)升高至55℃，微生物多樣性略有下降。發(fā)酵19 d以后，溫度也降到38℃左右，微生物多樣性又開始逐漸增加。

3 討論

大曲微生物群落組成復(fù)雜，不同的微生物群落組成使得大曲種類不一。在白酒生產(chǎn)過程中，不同類型的大曲使用的生產(chǎn)目標(biāo)不一，可見大曲對(duì)于產(chǎn)品特色與質(zhì)量的重要性，本實(shí)驗(yàn)以陜西某醋廠生產(chǎn)使用的大曲為研究對(duì)象，基于16S/18S rRNA基因?yàn)槟康钠?，采用微生物指紋圖譜分析技術(shù)16S/18S rRNA克隆文庫法分析了大曲中微生物群落的組成，共發(fā)現(xiàn)37個(gè)細(xì)菌菌種，分屬于16個(gè)屬，其中，Pediococcus、Lactobacillus、Leuconostoc、Pantoea、Enterobacter、Cronobacter、Bacillus為大曲中的主要的細(xì)菌類群。共發(fā)現(xiàn)13個(gè)真菌菌種，分別屬于11個(gè)屬，其中，Amylomyces、Rasamsonia、Rhizopus、Aspergillus、Eurotium、Pichia為大曲中主要的真菌類群。

圖6 18S rRNA基因文庫系統(tǒng)發(fā)育樹

圖7 16S/18S rRNA基因克隆文庫PCA分析

目前，國內(nèi)學(xué)者采用多種生態(tài)學(xué)技術(shù)手段研究并闡述了各類大曲中微生物多樣性。陳玲等[12]利用克隆文庫法與高通量測(cè)序法得出濃香型大曲優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落分別為Bacillus、Lactobacillaceae、Pseudomonas、Streptomyces、Erwinia和unclassified Enterobacteriaceae；湯斌等[13]通過構(gòu)建16S rDNA克隆文庫，得出大曲中細(xì)菌微生物主要為L(zhǎng)actobacillaceae和Bacillus；羅惠波等[14]利用可培養(yǎng)真菌的分離鑒定方法得出大曲中Aspergillus、Monascus、 Rhizomucor、Lichtheimia、Saccharomycescerevisiae、Wickerhamomycesanomala、Sporidioboluspararoseus為主要優(yōu)勢(shì)真菌類群；王海燕等[15]通過PCR-DGGE技術(shù)比較了不同香型大曲中的細(xì)菌、酵母及霉菌組成差異，結(jié)果表明，大曲內(nèi)酵母優(yōu)勢(shì)類群為Saccharomycopsisfibuligera和Pichiaanomala，還存在其他非酵母菌科的酵母如Hanseniaspora guilliermondii、Debaryomyceshansenii、Issatchenkiaorientalis、Trichosporonasahii等。

從以上研究報(bào)道與本次克隆文庫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)菌落結(jié)果可以得出Lactobacillaceae、Bacillus、Rhizopus、Aspergillus、Pichia為大曲比較常見的優(yōu)勢(shì)群落。Bacillus可產(chǎn)生吡嗪、芳香族類、有機(jī)酸類物質(zhì)，它們可能對(duì)白酒的風(fēng)味產(chǎn)生重要作用[16]。乳酸作為食醋中含量?jī)H次于醋酸的一種有機(jī)酸，其不僅是食醋中不揮發(fā)酸的重要組成成分，也是食醋的重要呈味物質(zhì)[17]，乳酸菌能利用碳水化合物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸[18]，所以Lactobacillaceae對(duì)食醋的風(fēng)味貢獻(xiàn)突出；霉菌是我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品的菌種，Rhizopus能產(chǎn)生豐富的葡萄糖淀粉酶，因而可能將原料中的淀粉直接降解為酵母菌可利用的還原糖，進(jìn)而刺激酵母菌的生長(zhǎng)，同時(shí)，促進(jìn)原料中的碳源向發(fā)酵終產(chǎn)物酒精的代謝流[19]，Aspergillus產(chǎn)生糖化酶、淀粉酶，Pichia產(chǎn)酒精與乳酸菌聯(lián)合作用生成酯類物質(zhì)等豐味物質(zhì)[20]。本次對(duì)微生物群落的研究中，除了檢測(cè)到其他大曲研究中檢測(cè)到的常見功能種群外，整個(gè)微生物群落組成和演變與其他大曲研究不同，造成這種區(qū)別的原因可能是本實(shí)驗(yàn)研究的大曲為制醋大曲，而非制酒大曲。

本研究中，乳酸菌Pediococcus、Lactobacillus、Leuconostoc及酵母菌Pichia為固態(tài)發(fā)酵前期優(yōu)勢(shì)菌；細(xì)菌Pantoea、Enterobacter、Cronobacter及真菌Amylomyces、Rhizopus為固態(tài)發(fā)酵中后期優(yōu)勢(shì)菌；而細(xì)菌Bacillus及真菌Rasamsonia，Eurotium為固態(tài)發(fā)酵后期優(yōu)勢(shì)菌。其演變規(guī)律與汾酒大曲微生物群落結(jié)構(gòu)演變規(guī)律相類似[21]。Bacillus為大曲發(fā)酵后期的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種與江東材[22]的研究中芽孢桿菌在片高溫大曲發(fā)酵過程的演變相似。而大曲固態(tài)發(fā)酵過程中，發(fā)酵溫度被認(rèn)為是影響大曲微生物群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)演變的重要因素[23]。下一步，將集中研究大曲固態(tài)發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子間內(nèi)在聯(lián)系，以期對(duì)環(huán)境因子脅迫下食醋大曲固態(tài)發(fā)酵過程微生物演變規(guī)律有一個(gè)更全面的認(rèn)識(shí)。

表1 16S/18S rRNA基因克隆文庫多樣性指數(shù)分析

[1]LIP,LIS,CHENG L,et al.Analyzing the relation between the microbial diversity of Daqu and the turbidity spoilage of traditional Chinese vinegar[J].Applied microbiology and biotechnology,2014,98(13)：6073-6084.

[2]雷振河.汾酒發(fā)酵主要有機(jī)酸成分分析與產(chǎn)酸細(xì)菌的鑒定[J].釀酒,2011,38(4)：24-28.

[3]WUQ,XU Y,CHEN L.Diversity of yeast species during fermentative process contributing to Chinese Maotai-flavour liquor making[J].Letters in applied microbiology,2012,55(4)：301-307.

[4]楊躍寰,葉光斌,邊名鴻,等.瀘曲中兩株高產(chǎn)糖化酶菌的分離鑒定與初步應(yīng)用[J].釀酒科技,2013(10)：65-68.

[5]OLINE D K.Phylogenetic comparisons of bacterial communities from serpentine and nonserpentine soils[J]. Applied and environmental microbiology,2006,72(11)：6965-6971.

[6]VAINIO E J,HANTULA J.Direct analysis of wood-inhabiting fungi using denaturing gradient gel electrophoresis of amplified ribosomal DNA[J].Mycological research,2000,104 (08)：927-936.

[7]STUBNER S.Enumeration of 16S rDNA of Desulfotomaculum lineage1 in rice field soil by real-time PCR with SybrGreen?detection[J].Journal of microbiological methods,2002,50(2)：155-164.

[8]KIM TW,LEE JH,KIM SE,et al.Analysis of microbial communities in doenjang,a Korean fermented soybean paste, using nested PCR-denaturing gradient gel electrophoresis[J]. International journal of food microbiology,2009,131(2/3)：265-271.

[9]LIANG B,WANG LY,MBADINGA SM,et al. Anaerolineaceae and Methanosaeta turned to be the dominant microorganisms in alkanes-dependent methanogenic culture after long-term of incubation[J].AMB Express,2015,5：37.

[10]惠豐立,柯濤,褚學(xué)英,等.大曲中酵母菌種群結(jié)構(gòu)及多樣性分析[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2009,28(1)：102-106.

[11]WANG H Y,XU Y.Effect of temperature on microbial composition of starter culture for Chinese light aroma style liquor fermentation[J].Lett appl microbiol,2015,60(1)：85-91.

[12]陳玲,袁玉菊,曾麗云,等.16S rDNA克隆文庫法與高通量測(cè)序法在濃香型大曲微生物群落結(jié)構(gòu)分析中的對(duì)比研究[J].釀酒科技,2015(12)：33-36.

[13]湯斌,劉金英,周慶武,等.免培養(yǎng)技術(shù)對(duì)濃香型白酒大曲中細(xì)菌多樣性的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2011,37(9)：36-40.

[14]羅惠波,楊曉東,楊躍寰,等.濃香型大曲中可培養(yǎng)真菌的分離鑒定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析[J].現(xiàn)代食品科技,2013(9)：2047-2052.

[15]WANG HY,GAO Y B,FAN Q W,et al.Characterization and comparison of microbial community of different typical Chinese liquor Daqus by PCR-DGGE[J].Lett appl microbiol, 2011,53(2)：134-140.

[16]YAN Z,ZHENG XW,HAN B Z,et al.Monitoring the ecology of Bacillus during Daqu incubation,a fermentation starter,using culture-dependent and culture-independent methods[J].J microbiol biotechnol,2013,23：614-622.

[17]蔣忠,馮文利,王偉,等.乳酸菌和酵母菌共酵改善食醋品質(zhì)的研究[J].中國釀造,2015,34(9)：104-108.

[18]侯小歌,杜小波,李學(xué)思,等.中溫大曲中乳酸菌的分離鑒定及產(chǎn)酸特性[J].釀酒科技,2010(9)：17-20.

[19]喬曉梅,趙景龍,杜小威,等.高通量測(cè)序法對(duì)清香大曲真菌群落結(jié)構(gòu)的分析[J].釀酒科技,2015(4)：28-31.

[20]ZHENG XW,YAN Z,HAN B Z,et al.Complex microbiota of a Chinese"Fen"liquor fermentation starter(Fen-Daqu), revealed by culture-dependent and culture-independent methods[J].Food microbiol,2012,31(2)：293-300.

[21]ZHENG X W,YAN Z,NOUT M R,et al.Microbiota dynamics related to environmental conditions during the fermentative production of Fen-Daqu,a Chinese industrial fermentation starter[J].Int j food microbiol,2014,182：57-62.

[22]江東材,周瑞平,陳云宗,等.偏高溫大曲發(fā)酵過程中芽孢桿菌的演替[J].釀酒科技,2012(9)：62-65.

[23]WANG HY,XU Y.Effect of temperature on microbial composition of starter culture for Chinese light aroma style liquor fermentation[J].Lett appl microbiol,2015,60(1)：85-91.

Analysis of Dynamic Change in Microbial Groups during Solid-State Fermentation of Daqu for Vinegar Brewing on the Basis of 16S/18S rRNA Clone Library

LIU Xiong,GAN Xing and LUO Lixin
(College of Bioscience and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou,Guangdong 510006,China)

In this study,16S/18S rRNA clone library was used to analyze microbial groups and fungi groups in Daqu for vinegar brewing in different fermenting stage,and the dynamic change in microbial groups in abundance and diversity was further analyzed.A total of 14 bacterial genera within 4 orders and 11 fungal genera within 3 orders were detected during solid-state fermentation of Daqu.A succession of microbial assemblages was observed during the fermentation of Daqu.Bacterial genera of Pediococcus,Lactobacillus,Leuconostoc and yeast of Pichia were dominant bacteria in prior fermentation period.Bacterial genera of Pantoea,Enterobacter,Cronobacter and fungal genera of Amylomyces, Rhizopus were considerably accelerated during medium fermentation stage and were dominant bacteria until the end of the fermentation.However,bacterial genus of Bacillus and fungal genera of Rasamsonia,Eurotium were prevailing bacteria in late fermentation stage.In addition, PCA analysis indicated that microbial groups diversity varied in different fermenting stages(1 d and 3 d of the fermentation different from 7 d and 13 d of the fermentation,and 19 d,25 d,and 30 d of the fermentation).These exploratory findings were of great significance in improving the quality of edible vinegar.

Daqu for vinegar brewing;clone library;microbial community;solid-state fermentation;dynamic evolution

TQ925.7；Q93-3；TS264.22

A

1001-9286（2017）01-0042-06

10.13746/j.njkj.2016331

2016-11-09

劉雄(1991-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锇l(fā)酵。

羅立新，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：工業(yè)微生物學(xué)，發(fā)酵工程，微生物分子生態(tài)學(xué)。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-11-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161125.1423.011.html。