基于蛋白質(zhì)和DNA的食品過敏原檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

丁亮，付琳，吳秀蓮，李夢雪

（南京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局高淳區(qū)質(zhì)量計(jì)量檢測所，江蘇南京211300）

基于蛋白質(zhì)和DNA的食品過敏原檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

丁亮，付琳，吳秀蓮，李夢雪

（南京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局高淳區(qū)質(zhì)量計(jì)量檢測所，江蘇南京211300）

目前，食品過敏問題已成為全球性的健康問題。在食品加工過程中產(chǎn)生的食品過敏成分或微量過敏原對敏感機(jī)體都是巨大的健康威脅。因此，可靠的分析方法是鑒別和檢測食品中過敏成分所必需的。該文綜述了基于蛋白質(zhì)和脫氧核糖核酸(DNA)的食品過敏原檢測技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展，并展望了其未來發(fā)展趨勢。

食品過敏原；蛋白質(zhì)；脫氧核糖核酸；檢測

食品過敏是致敏機(jī)體在再次受到食品中同種抗原刺激時(shí)引起的不良免疫反應(yīng)。食品過敏反應(yīng)通常由免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導(dǎo)，主要分為致敏和發(fā)敏兩階段。在機(jī)體初次受食品中抗原刺激后會(huì)產(chǎn)生抗原特異性IgE，并與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體再次接觸同一食品抗原后，會(huì)在肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面通過交聯(lián)抗原特異性IgE產(chǎn)生過敏反應(yīng)，使得大量蛋白水解酶、白三烯或促炎細(xì)胞因子釋放，引起過敏癥狀。致敏個(gè)體由于過敏原的攝入而產(chǎn)生的臨床癥狀包括蕁麻疹、瘙癢、水腫、支氣管痙攣、鼻炎、嘔吐、腹瀉、痙攣，甚至致命的過敏性休克[1-2]。

目前，食品過敏被世界衛(wèi)生組織納入五個(gè)最重要的公共健康問題之一，特別是在工業(yè)國家，有2%成年人和4%～8%幼兒受其影響。由于不同地區(qū)飲食習(xí)慣的不同，食品過敏的發(fā)病率和患病率還在不斷增加。在已確認(rèn)的可引起過敏反應(yīng)的160多種食物中，有8種被認(rèn)為與90%食物過敏有關(guān)。這些“主要的食品過敏原”包括牛奶、蛋類、魚、甲殼動(dòng)物貝類、堅(jiān)果、小麥、花生和大豆[3-4]。為保護(hù)消費(fèi)者安全及向消費(fèi)者提供更多信息，多國立法規(guī)定食品包裝袋上需要標(biāo)注過敏原。另一方面，提高現(xiàn)有食品過敏原的檢測分析方法，并制定新的標(biāo)準(zhǔn)化方法，為食品和餐飲業(yè)提供適當(dāng)?shù)墓ぞ咭约盀椤笆称愤^敏”消費(fèi)者提供“無過敏原”食品也是避免食物過敏重要的途徑。本文對基于蛋白質(zhì)和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的檢測方法在食品過敏原檢測中的應(yīng)用進(jìn)行了介紹，如免疫化學(xué)法、蛋白質(zhì)組學(xué)方法、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）等，及對食品過敏原檢測方法的發(fā)展進(jìn)行了探討。

1 食品過敏原成分檢測的靶目標(biāo)分子

食品過敏原成分檢測主要依賴于過敏原自身或過敏原成分的標(biāo)記分子。通常有兩類標(biāo)記分子用于檢測過敏原：過敏原成分中的特征性蛋白和能表征過敏成分的特定的DNA序列。由于蛋白靶標(biāo)和DNA靶標(biāo)各有利弊，因此應(yīng)根據(jù)食品自身進(jìn)行選擇。一般選擇某種靶分子的重要依據(jù)在于其在樣品中的豐度，這將影響到檢測方法的靈敏性。蛋白同源性也是重要參考因素，當(dāng)選擇某種蛋白作為靶分子檢測不同物種中的過敏原時(shí)，應(yīng)選擇保守性較高的同源蛋白。盡管蛋白檢測方法比較常用，但蛋白成分容易受到食品加工和外界變化的影響，如季節(jié)和地理的影響；熱加工也會(huì)降低目的蛋白溶解度。而DNA分子則具有更好的穩(wěn)定性，且不受表型變異影響，因此更有助于定量分析及用于對敏感性要求較高的場合。

在DNA靶標(biāo)中，常用的靶向分子包括單拷貝或多拷貝分子，如線粒體、葉綠體或其他高度重復(fù)序列。由于多拷貝分子在樣品中數(shù)量較多，其可提高分析敏感性，而單拷貝分子則因恒定的拷貝數(shù)而更適合定量分析。DNA靶標(biāo)的選擇也受公共數(shù)據(jù)庫中DNA序列可利用度的影響。盡管可能缺少某些過敏成分的DNA序列，但隨著高通量和低成本技術(shù)的發(fā)展（如下一代測序），越來越多可利用的序列正存儲(chǔ)在公共數(shù)據(jù)庫，這也有助于依賴DNA的過敏原檢測技術(shù)的發(fā)展。

2 依賴蛋白質(zhì)的過敏原檢測技術(shù)

2.1 免疫化學(xué)法

傳統(tǒng)上，食品過敏原主要用免疫方法檢測，即利用抗體檢測過敏原中的目標(biāo)蛋白。目前以免疫化學(xué)為基礎(chǔ)的食品過敏原檢測方法主要有放射/酶聯(lián)過敏原吸附抑制實(shí)驗(yàn)（radio-allergosorbent/enzyme allergosorbent inhibition test，RAST/EAST）法、火箭免疫電泳（rocketimmuno-electrophoresis，RIE）、酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和斑點(diǎn)免疫印跡（dot immunoblotting）法等。其中，ELISA是食品工業(yè)中檢測食品過敏原最常用的方法，其靈敏度好，操作方便[5-6]。ELISA中過敏原與特異性酶標(biāo)記的抗體結(jié)合后，通過檢測酶活性而產(chǎn)生比色反應(yīng)來對過敏原進(jìn)行定量或定性分析。目前，已有大量商品化的ELISA試劑盒可檢測或定量復(fù)雜食品中的小麥、雞蛋、花生、大豆、牛奶、杏仁、榛子、羽扇豆、芝麻、芥菜和蕎麥等，檢測限達(dá)0.1～20 mg/kg[7-9]。

RAST/EAST是一種競爭性IgE結(jié)合試驗(yàn)，即先將與人體特異IgE抗體結(jié)合的過敏原固定在固定相，樣品中的過敏原則抑制固相上的過敏原與IgE結(jié)合，再通過顯色反應(yīng)檢測結(jié)合的IgE，從而定量樣品中的過敏原[10]。RAST/EAST多用于臨床中食品過敏原診斷，其用于商業(yè)中過敏原定量檢測主要受限于對過敏者血清的依賴性及實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化。RIE則是用含有抗體的凝膠進(jìn)行檢測，過敏原根據(jù)自身的電泳遷移率進(jìn)行遷移直到抗原-抗體復(fù)合物在凝膠中沉淀[11]。盡管RIE已被用于檢測多種食品過敏原，但其未能被廣泛應(yīng)用的原因在于繁瑣的凝膠制備過程及免疫染色程序。隨后發(fā)展的側(cè)流免疫層析法和試紙檢測是ELISA試劑盒方法的進(jìn)階，主要在膜帶上進(jìn)行，然而其僅能用于蛋白定性檢測[12]。還有其他較少用于食品過敏原檢測的免疫化學(xué)方法，如斑點(diǎn)免疫印跡試驗(yàn)可用于檢測牛奶乳清蛋白、花生、榛子和巴西堅(jiān)果等[13]。

總體而言，免疫化學(xué)方法，特別是ELISA在檢測食品過敏原時(shí)，靈敏性好，容易操作。然而，其也存在多種缺陷，如抗體的交叉反應(yīng)，易產(chǎn)生假陽性；食品中其他成分的干擾；在固體基質(zhì)的吸附可能破壞過敏原表位等。盡管如此，ELISA仍是食品過敏原鑒別和定量的重要方法。

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)方法

蛋白質(zhì)組學(xué)包括蛋白序列與改造、蛋白功能研究、蛋白間相互作用和定位以及蛋白豐度。由于蛋白質(zhì)是食品多種特性的生物標(biāo)記分子，蛋白質(zhì)組學(xué)在食品科學(xué)研究中具有重要作用。樣品的蛋白組學(xué)分析包括蛋白水平的多步分離和質(zhì)譜分析。目前有2種蛋白組學(xué)分析流程：一是蛋白質(zhì)先被酶水解后得到多肽，然后進(jìn)行質(zhì)譜分子；二是在質(zhì)譜儀中直接將整個(gè)蛋白碎片化，避免了蛋白酶解過程[14]。在這兩種方法中，通過將蛋白質(zhì)和多肽的質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，匹配最佳的蛋白即為目標(biāo)蛋白。HEICK J等[15]利用液質(zhì)聯(lián)用多元反應(yīng)監(jiān)測方法同時(shí)鑒別及定量面粉和面包中多種食品過敏物，如花生、核桃、榛子、杏仁、雞蛋和牛奶，檢測限達(dá)3～70 mg/kg?；诘鞍踪|(zhì)組學(xué)的食品過敏原檢測方法克服了免疫學(xué)方法中交叉干擾的弊端，可對多種蛋白質(zhì)和多肽進(jìn)行測定，且可同時(shí)檢測多種過敏原。蛋白質(zhì)組學(xué)可確定過敏原的分子量、測定其翻譯后修飾、鑒別過敏蛋白的新亞型?；诘鞍踪|(zhì)組學(xué)的過敏原檢測技術(shù)提高了食物鏈的安全性。目前該方法的應(yīng)用需要相對先進(jìn)的設(shè)備和計(jì)算基礎(chǔ)設(shè)施，有大量數(shù)據(jù)產(chǎn)生，其應(yīng)用依賴于高技能人員，這使得成本增加，有點(diǎn)超出大多常規(guī)分析的范疇。

3 依賴DNA的過敏原檢測技術(shù)

3.1 終點(diǎn)定量PCR和PCR-ELISA

終點(diǎn)定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR（end point quantitative polymerase chain reaction，End-point quantitative PCR）是簡單低成本的DNA擴(kuò)增方法。其主要的缺點(diǎn)在于需要通過凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，由于凝膠電泳檢測的靈敏度有限，使得該技術(shù)準(zhǔn)確性降低。聚合酶鏈反應(yīng)酶聯(lián)免疫吸附測定（PCR-ELISA）中，用生物素或地高辛標(biāo)記擴(kuò)增的DNA片段作為抗原，通過與捕獲探針雜交固定于固相捕獲系統(tǒng)，隨后通過酶標(biāo)抗體實(shí)現(xiàn)顯色定量分析。通過這種方式，PCR-ELISA可以用一組通用引物去檢測和區(qū)分多個(gè)序列/目標(biāo)，因此對檢測多種致敏成分比較有優(yōu)勢。然而，這種方法只能算是半定量，因?yàn)樵摿炕窃赑CR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行。HOLZHAUSER T等[16]在比較PCR-ELISA和ELISA檢測榛子效果的研究中，發(fā)現(xiàn)兩種方法敏感性類似，但PCR-ELISA具有更好的特異性。

3.2 qPCR

實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative PCR，qPCR）可監(jiān)測樣本擴(kuò)增的每時(shí)每刻各熒光值的連續(xù)變化。如今，qPCR已被廣泛用于食品分析，包括過敏原成分分析。與終點(diǎn)定量PCR相比，qPCR具有明顯優(yōu)勢，如可檢測短片段，不需凝膠電泳檢測等。在食品分析中，qPCR方法主要依賴于兩種檢測化學(xué)物質(zhì)：DNA結(jié)合染料和水解探針。前者中最常用的是SYBRGreen染料，后者多為TaqMan探針。qPCR可以潛在的用于定量分析食品過敏成分，但目前大部分方法還是基于絕對定量，其主要依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線。COSTA J等[17]成功地利用qPCR在食品中檢測出杏仁，且通過擴(kuò)增杏仁中Pru du 5（也叫酸性核糖體蛋白P2）過敏原的編碼序列從其相關(guān)產(chǎn)品中鑒別杏仁。INIESTO E等[18]研究了烘焙、高壓和蒸汽滅菌處理對榛子過敏原編碼序列的影響，結(jié)果表明，熱處理、烘焙、蒸汽滅菌都可降低榛子DNA檢測能力，這是由于DNA提取率和DNA完整性降低。由于某些食品的組成成分可能抑制PCR反應(yīng)，其會(huì)影響qPCR對過敏成分的定量檢測[19]。在DNA提取和純化之前向食品中加入內(nèi)標(biāo)物將有助于提高定量結(jié)果的可信度，因?yàn)槭称烦煞謱NA提取和純化的影響可通過對內(nèi)標(biāo)物的影響估量。

3.3 高分辨熔解分析

高分辨率熔解度分析（high resolution melting analysis，HRM）是通過檢測溫度升高時(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸熔解產(chǎn)生的熒光變化，分析樣品中DNA產(chǎn)物[20]。隨著高分辨率儀器和飽和熒光DNA結(jié)合染料的發(fā)展，HRM分析已被用于基因分型、表觀遺傳學(xué)、食品檢測研究。因特定PCR產(chǎn)物的熔融溫度（Tm）可用于在種屬水平區(qū)分食品，HRM分析已被用于食品成分鑒定。COSTA J等[21]利用HRM結(jié)合實(shí)時(shí)PCR通過檢測杏仁中的Pru du 5過敏蛋白編碼基因從加工食品中檢測到微量杏仁。MARTíN-FERNáNDEZ B等[22]利用HRM可將小麥與其他谷物（如大麥、黑麥和燕麥）區(qū)分開。加工食品產(chǎn)物中榛子也可被DNA條形碼-HRM定量，檢測限達(dá)0.01%[23]。

3.4 連接依賴探針擴(kuò)增

連接依賴探針擴(kuò)增（ligation-dependent probe amplification，LPA）是基于兩個(gè)熒光標(biāo)記的寡核苷酸片段探針，與靶序列DNA進(jìn)行雜交，然后連接擴(kuò)增，分析產(chǎn)物。僅當(dāng)兩個(gè)寡核苷酸探針分別與靶序列完全互補(bǔ)時(shí)，連接酶才能將兩段探針連接成一條完整的核酸單鏈，隨后產(chǎn)生特定大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，通過毛細(xì)管電泳鑒別[24]。LPA已用于檢測10種不同的過敏成分[25]。在不同的矩陣測試時(shí)，LPA可鑒別單一過敏原，檢測限達(dá)5 mg/kg。與內(nèi)部陽性對照信號相比，8種過敏成分信號的檢測限范圍為5～400基因拷貝數(shù)[26]。

3.5 DNA arrays

為進(jìn)行多重檢測，許多芯片被用于檢測PCR產(chǎn)品，并用于檢測食品中的過敏成分。ROSSIS等[27]使用肽核酸（peptide nucleicacids，PNAs）芯片檢測擴(kuò)增的花生和榛子DNA。PNAs是結(jié)合到互補(bǔ)DNA序列的寡核苷酸類似物，較其同源DNA表現(xiàn)出更高的親和力和特異性[28]。電化學(xué)DNA芯片可檢測榛子中兩個(gè)不同過敏原的特異性DNA片段，且樣品濃度可在納摩爾水平。WANG W等[29]在含硅的表面開發(fā)出一種光學(xué)薄膜微陣列方法，可在兩個(gè)tetraplex PCR系統(tǒng)中同時(shí)檢測8種食物過敏成分，如同時(shí)檢測腰果、花生、小麥、大豆、魚、雞、蝦和牛肉，及同時(shí)檢測芝麻、燕麥、杏仁、芹菜、榛子、核桃、羽扇豆和芥末[30]。此時(shí)，信號可肉眼觀察而不需額外的儀器。從榛子、花生和大豆DNA擴(kuò)增的地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，可利用5′-生物素探針雜交檢測，該探針可被鏈霉親和素修飾的數(shù)字化視頻光盤（digital video disk，DVD）表面固定，檢測限達(dá)1 μg/g[31]?；?′-SH和3′-生物素標(biāo)記莖環(huán)雙探針的電化學(xué)DNA傳感器，也可通過檢測Ara h 1基因的片段來檢測花生是否存在，檢測限為0.35 fmol/L，線性響應(yīng)范圍10-15～10-10mol/L。DNA傳感器可在未進(jìn)行PCR擴(kuò)增的情況下定量檢測花生乳飲料的DNA提取物[32]。

4 結(jié)束語

如今，為了保護(hù)過敏機(jī)體免受過敏原反應(yīng)的困擾，人們提倡減少接觸任何過敏原的機(jī)會(huì)。但由于加工食品通常還有各種各樣的成分，包括潛在的過敏原，使得很難完全不接觸過敏原。因此，食品過敏原的檢測是當(dāng)前食品安全的重要任務(wù)。由于依賴蛋白質(zhì)檢測方法的復(fù)用能力及質(zhì)譜儀器的新發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)方法正被廣泛替代傳統(tǒng)的免疫化學(xué)方法和基于DNA的PCR法。同樣的，多種DNA檢測新技術(shù)正蓬勃發(fā)展，如HRM、LPA和DNA芯片。除上述幾種方法外，寡合苷酸適體，即結(jié)合多種目標(biāo)物的單鏈或RNA寡核苷酸，也逐步作為抗體的另一選擇應(yīng)用于生物分析，目前已有多種適體用于食品過敏原的檢測；生物傳感器，特別是新型納米材料，也逐步用于檢測食品過敏原。

在食品中的過敏成分檢測中，為得到可靠的具有可比性的分析結(jié)果，還需要驗(yàn)證及協(xié)調(diào)各分析方法。同樣地，對于新開發(fā)的快速檢測方法，如基于生物傳感器的方法，也需要進(jìn)行驗(yàn)證，及評估其真實(shí)食品樣品中的適用性。

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Recent advance of detection technology of food allergens based on protein and DNA

DING Liang,FU Lin,WU Xiulian,LI Mengxue
(Gaochun Testing Institute of Quality and Metrology,Nanjing Bureau of Quality and Technical Supervision,Nanjing 211300,China)

At present,food allergies have become global health concern.The food allergenic ingredients or micro-allergens produced during food processing were a huge health threat on sensitive individuals.Therefore,the reliable analytical methods are necessary to identify and detect allergenic ingredients in food.The application and development of food allergen detection technology based on protein and deoxyribonucleic acid(DNA)were summarized,and the future development trend was prospected.

food allergens;protein;deoxyribonucleic acid;detection

TS207.3

0254-5071（2017）07-0157-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.034

2017-05-10

丁亮（1988-），男，助理工程師，本科，研究方向?yàn)槭称窓z測。